真菌裂解多糖单加氧酶的C端无序区域能够与铜结合，并表现出抗真菌特性

《International Journal of Biological Macromolecules》：The C-terminal intrinsically disordered region of a fungal lytic polysaccharide monooxygenase binds copper and displays anti-fungal properties

　　

Ketty C. Tamburrini | Koar Chorozian | Clarisse Roblin | Aurore Labourel | Mireille Haon | Sacha Grisel | Evangelos Topakas | Mickael Lafond | Bruno Guigliarelli | Gaston Courtade | Sonia Longhi | Jean-Guy Berrin

摘要

溶菌多糖单加氧酶（LPMOs）是在降解复杂多糖（如纤维素和几丁质）过程中发挥关键作用的酶。虽然LPMOs因其在将生物质转化为生物燃料的工业应用中受到广泛关注，但新的证据表明它们在真菌植物致病性、微生物疾病以及（微生物） organism发育中也具有其他功能。AA14 LPMO家族在丝状真菌中分布广泛，但其最初的底物特异性最近受到了质疑。此外，超过一半的AA14家族成员具有无序的C末端区域（dCTR），这一区域被认为具有功能性。在这项研究中，我们对含有dCTR的Pycnoporus coccineus AA14A LPMO进行了功能表征。我们使用小角X射线散射（SAXS）和圆二色性实验发现，其dCTR具有高度无序性，该区域由一个高度糖基化的低复杂度区域和一个带电的C末端尾部组成。研究发现，PcoAA14A的dCTR通过C末端尾部中的组氨酸残基与铜离子结合。通过电子顺磁共振（EPR）进一步证实，涉及铜和氧化还原敏感半胱氨酸的氧化过程会引发酶的二聚化。鉴于C末端尾部的最后一个残基与抗菌肽具有相似性，我们探究了其潜在的抗菌功能，结果发现C末端尾部的带电区域能够选择性地抑制担子菌孢子的生长。这些数据表明，附着在AA14 LPMO上的dCTRs是功能性区域，必须加以考虑才能揭示这些非典型LPMOs的真正作用。

引言

溶菌多糖单加氧酶（LPMOs）在分解复杂的多糖（如纤维素和几丁质）方面起着关键作用，这些多糖分别存在于植物和真菌的细胞壁中。与传统碳水化合物活性酶（CAZymes）不同，LPMOs通过对多糖进行氧化修饰来促进水解酶对其的酶促降解[1],[2]。LPMOs的活性位点上暴露有一个铜原子，称为组氨酸支架[3]。催化过程涉及使用各种电子源将铜离子从Cu(II)还原为Cu(I)[4]。虽然最初认为LPMOs需要分子氧，但实际上H₂O₂是这些酶最有效的辅底物[5]。目前，LPMOs在CAZy数据库的辅助活性（AA）类别中被分为八个家族：AA9-AA11和AA13-AA17[6]。LPMOs在分类上非常广泛，已确认它们存在于真菌、细菌、卵菌、动物，甚至病毒和植物（蕨类）中，这扩展了我们对这些酶生态学意义的理解[7]。

LPMOs的底物特异性因家族而异，主要针对纤维素、几丁质、淀粉或果胶。尽管它们分布广泛，但最近发现的LPMO家族中只有少数成员被进行了表征，其功能尚不清楚。LPMOs在多种工业应用中越来越受到关注；它们被加入到商业纤维素酶混合物中以增强木质纤维素生物质的降解[8],[9]，并且由于它们对纤维素纤维表面的破坏作用，还具有生产纳米纤维素这一新型增值产品的巨大潜力[10]。在自然界中，LPMOs在真菌植物致病性[11],[12]、由细菌引起的疾病（例如肺炎）[13]、真菌（例如人类脑膜炎）[14]、卵菌[15]和病毒（例如昆虫痘病毒）[16]以及（微生物） organism发育[17]中的作用日益重要。

AA14 LPMO家族是在2018年通过对白色腐朽菌Pycnoporus coccineus（同义词Trametes coccinea）中的两种LPMO进行生化表征后建立的[18]。在植物生物质上生长时，发现编码AA14 LPMO的基因在真菌生长期间上调，而对重组产生的PcoAA14A和PcoAA14B的研究表明，它们能增强对木质纤维中异木聚糖的糖化作用[18]。后续研究表明，当PcoAA14B与GH30木聚糖酶结合使用时，可协同降解预处理过的木材材料[19]。然而，在研究Trichoderma reesei中的新AA14家族成员TrAA14A时，对其底物特异性进行了重新评估[20]。将该新酶与PcoAA14A进行比较后发现，尽管这两种酶具有许多共同特性（例如生成和消耗H₂O₂的能力），但它们似乎不对与纤维素相关的木聚糖起作用，这引发了关于这一广泛存在于丝状真菌中的家族作用的多种疑问。最近的一项研究提出，AA14可能参与葡糖醛氧基甘露聚糖[21]的降解，后者是真菌细胞壁的成分之一[22],[23]。

有趣的是，AA14家族是唯一一个 kh?ng 含有任何碳水化合物结合模块（CBMs）的LPMO家族。相反，AA14 LPMOs具有内在无序的C末端区域（dCTRs）[24]。内在无序蛋白质（IDPs）或区域（IDRs）打破了传统的结构-功能范式。与蛋白质通常折叠成单一稳定三维结构的观念相反，IDPs/IDRs缺乏稳定的二级和/或三级结构[25]，而是采用了一系列动态相互转换的构象。IDPs/IDRs的构象异质性源于疏水残基的减少和带电氨基酸的富集[26]。IDRs在细胞过程中的关键作用包括信号转导、转录调控和分子识别[27]，它们的内在灵活性使它们能够与多种结合伴侣相互作用，并适应不同的环境，在细胞网络中介导复杂的、依赖上下文的相互作用[28]。

在所有LPMO家族中，AA14家族的dCTRs含量最高，占序列的57%。由于这些区域在LPMO表征前通常被去除，因此它们对LPMO功能的潜在贡献尚不清楚。迄今为止唯一报道的dCTR的功能作用来自一种来自真菌植物病原体的AA9 LPMO，研究表明dCTR通过二硫键在体外和体内促进LPMO的二聚化[12]。这种二聚化增强了其在纤维素上的结合能力和活性。此外，删除编码这种AA9 LPMO的基因会阻碍专化感染结构——appressorium的形成，并延缓宿主渗透。

在这项研究中，我们专注于Pycnoporus coccineus中的一种具有长dCTR的AA14 LPMO。我们结合生化方法和生物物理方法对其构象特性进行了实验表征，并通过微生物学和显微镜分析评估了其功能作用。我们的结果证实，dCTRs是必须考虑的功能性区域，需要进一步研究以阐明这些非典型且广泛分布的LPMOs的作用。

章节片段

生物信息学分析

系统发育树的构建方法如Tuveng等人所述[20]。通过BlastP搜索GenBank和JGI MycoCosm数据库中的蛋白质序列，以PcoAA14A和PcoAA14B作为查询词。使用CD-HIT Suite[29]从序列簇中选择一个代表性序列（序列一致性大于80%）。仅对应于催化结构的序列使用Clustal Omega[30]进行比对。随后构建了系统发育树

AA14家族中广泛分布着无序的C末端区域（dCTRs）

AA14家族是dCRTs含量最高的LPMO家族。为了探究家族内的dCRT分布情况，我们对570个AA14 LPMOs进行了深入的生物信息学分析。系统发育分析显示，所有分支中都存在dCRTs（图1A），且腐木真菌和菌根真菌的dCRT数量高于其他生活方式的真菌（图S1）。尽管不同分支中的dCRT长度存在差异，中位数范围为41个残基

讨论与结论

LPMOs的功能表征仍然具有挑战性。AA14家族也不例外，因为其最初的底物特异性最近受到了质疑和重新评估[20]。为了解开这个神秘家族的谜团，我们重点研究了存在于超过一半AA14成员中的dCRTs。我们的实验观察到。PcoAA14A_dCTR在分离状态和完整蛋白质背景下都具有较高的无序程度。圆二色性研究

Ketty C. Tamburrini：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原初草稿，验证，方法论，研究，正式分析，数据管理，概念构建。Koar Chorozian：撰写 – 审稿与编辑，验证，方法论，研究，正式分析。Clarisse Roblin：撰写 – 审稿与编辑，验证，方法论，正式分析，数据管理。Aurore Labourel：撰写 – 审稿与编辑，方法论，研究。

资金来源

本工作得到了CNRS、INRAE和法国综合结构生物学基础设施（FRISBI）（ANR-10-INSB-0005）的财政支持。K.C.T. 在France 2030投资计划下获得法国政府的资助，属于艾克斯-马赛大学卓越计划（A*MIDEX）的一部分，并隶属于微生物学、生物能源和生物技术研究所（IM2B）（AMX-19-IET- 006）。J-G.B.、E.T.和K.C.在Campus France的支持下获得资助

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢Cendrine Nicoletti（iSm2实验室）和Annick Doan（BBF实验室）在显微镜实验中的帮助。感谢Petra Pernot和Mark Tully（ESRF，提案编号：MX2324和MX2490）以及Aurélien Thureau（SOLEIL，提案编号：20210786）在记录SEC-SAXS数据方面的帮助，同时感谢ESRF和SOLEIL提供的同步辐射光束时间安排。我们还感谢Gerlind Sulzenbacher（AFMB实验室）对AFMB BAG的高效管理。感谢AFMB的所有技术和支持人员