添加壳聚糖纳米粒子的聚乳酸/他克莫司纳米纤维复合膜：用于抑制气管瘢痕形成并促进气管伤口愈合

《International Journal of Biological Macromolecules》：Chitosan nanoparticles-incorporated polylactic acid/tacrolimus nanofiber composite membrane for tracheal scar inhibition and tracheal wound healing promotion

　　

吕光超|冯世云|桑世芳|赵慧|王凯忠

中国吉林省长春市吉林大学第一医院器官移植中心胸部外科二科、肺移植科，130021

摘要

术后气管狭窄是由于过度瘢痕形成引起的复杂胸部手术（如袖状肺叶切除术、肺移植）的主要并发症，目前有效的预防策略有限。我们假设通过同时电纺和电喷技术整合壳聚糖（CS）、聚乳酸（PLA）和他克莫司（TAC）的复合膜能够利用各自的优势抑制气管瘢痕形成并促进气管伤口愈合。本文制备了含有CS纳米粒子的PLA/TAC纳米纤维（CS/PLA/TAC）复合膜，并对其物理化学性质（形态、机械强度、润湿性）进行了表征。体外实验表明，该膜在28天内持续释放TAC，选择性促进正常气管成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭以及早期胶原分泌，同时通过下调转化生长因子-β和α-平滑肌肌动蛋白抑制肥大性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原生成。此外，该膜还表现出很强的抗菌活性和良好的生物相容性，未观察到对肝脏或肾脏的显著损害。在小鼠气管损伤模型中，该膜有效抑制了瘢痕形成，调节了胶原沉积，并促进了正常组织再生。这些发现验证了我们的假设，表明CS/PLA/TAC复合膜是预防术后气管狭窄和促进临床胸部手术愈合的有前景的生物材料。

引言

术后瘢痕形成导致的气管狭窄是胸部手术（如袖状肺叶切除术和肺移植）后最常见的并发症之一[1]。袖状肺叶切除术后气管狭窄的发生率为3%至18%，而在肺移植受者中这一比例高达5%至15%[2]、[3]、[4]。值得注意的是，这种并发症的两年死亡率为约12%，传统侵入性干预措施（如球囊扩张或支架置入）后的复发率为40%至60%[2]、[3]、[4]，这突显了亟需有效的预防策略。尽管外科技术和围手术期护理有所进步，但仍缺乏有效的治疗手段来预防或逆转气管狭窄。因此，开发基于新型生物材料的策略以原位防止气管瘢痕形成并促进胸部手术后的气管伤口愈合具有迫切的临床意义。

壳聚糖（CS）是一种从甲壳素中提取的天然多糖，因其良好的生物相容性、抗菌活性以及促进细胞黏附和增殖的能力而在生物材料领域受到广泛关注[5]。然而，其固有的较差机械性能严重限制了其在长期植入中的应用[6]，因为持续的机械稳定性是保持植入物功能并避免过早失效的关键前提。聚乳酸（PLA）是一种合成的脂肪族聚酯，具有优异的机械性能、可控的生物降解性，并已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的医疗应用批准[7]。然而，PLA的疏水性及其缺乏生物活性位点常常导致细胞相互作用不足，限制了其在生物环境中的性能[8]。基于CS和PLA的天然-合成聚合物复合系统结合了两种聚合物的优势，为高性能生物材料的发展奠定了基础。

为了赋予材料合适的支架结构，需要采用有效的成型技术。电纺技术是一种有前景的手段，可用于制备模仿天然细胞外基质（ECM）结构的纳米纤维支架[9]，因此它们是生物医学应用的理想候选材料[10]。尽管已经通过电纺制备了一些PLA/CS复合纳米纤维[11]、[12]、[13]，但由于CS和PLA之间的亲水性-疏水性不相容性，实现CS在PLA基质中的均匀分散仍存在挑战。最近，同时结合电纺和电喷技术显示出制备微/纳米复合材料的巨大潜力[14]、[15]。电喷技术是在外加电场下生成微/纳米颗粒的通用方法，提供了修改电纺纳米纤维的灵活性[16]。这两种技术的联合应用为定制形态、结构和功能特性提供了多功能平台，使得可以将CS微/纳米颗粒纳入PLA纳米纤维中。此外，这些复合材料还可以通过这两种技术进行功能化，携带生长因子、肽和小分子药物等生物活性剂，在损伤部位发挥局部治疗效果[17]、[18]。最近通过电纺和电喷组合制备的材料列在表S1中。虽然之前使用该制备系统制备的材料已在许多领域得到应用，但迄今为止尚未有研究记录其在气管修复中的使用。

他克莫司（TAC）是一种临床上可用的钙调神经磷酸酶抑制剂，具有新兴的细胞类型抗纤维化特性，通过抑制活化成纤维细胞中的TGF-β信号通路来抑制肌成纤维细胞的分化和细胞外基质的沉积[19]、[20]。与其他抗纤维化药物（如皮质类固醇、 antimetabolites等）不同，TAC不会因非特异性毒性、狭窄的治疗窗口或较差的局部递送适用性而受到限制[21]、[22]，它将抗纤维化效果与局部持续释放的兼容性相结合，在保持细胞活力和组织再生的同时最小化全身免疫抑制和局部不良反应[23]、[24]。尽管在气管修复中的应用尚不充分，但载有TAC的生物材料支架可调节成纤维细胞的活性和基质重塑。这表明TAC是治疗气管纤维化重塑的合理候选药物，载有TAC的材料为预防气管瘢痕增生和促进术后愈合提供了有效途径。值得注意的是，局部应用他克莫司可能会引起局部不良反应，包括组织萎缩和剂量依赖性的毒性[25]、[26]，尤其是在高剂量暴露下。这种情况进一步强调了需要采用局部、持续、低剂量的递送策略，而不是自由释放药物。

综上所述，我们假设TAC/CS/PLA三元复合膜可以以可测量的方式调节成纤维细胞的行为和细胞外基质重塑，具体表现为：(i) 促进正常气管成纤维细胞的增殖和迁移；(ii) 抑制肥大性瘢痕成纤维细胞的活性和胶原过度生成；(iii) 降低体内的纤维化相关标志物，从而成为预防气管狭窄和促进胸部手术术后伤口愈合的有效治疗候选材料。本文采用同时电纺和电喷技术制备了含有CS纳米粒子和载有TAC的PLA纳米纤维的复合纳米纤维膜，其中疏水的PLA和亲水的CS能够形成相互连接的形态。随后，本研究重点探讨了材料组成和结构对性能的影响，最终为开发先进的生物材料以预防气管瘢痕形成和促进胸部手术后的伤口愈合做出了贡献。与以往的研究相比，本工作针对特定的临床挑战进行了有针对性的设计，具有明确的治疗目标和材料/功能协同作用，推动了气管生物材料修复领域的发展。

章节片段

材料

聚乳酸（PLA，分子量=110,000）和他克莫司（TAC，含量>98%）购自Macklin Inc。壳聚糖（CS，脱乙酰化度>95%，粘度>400 mPa·s）以及氯仿（CH3Cl）和二甲亚砜（DMF）购自Aladdin。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素购自Gibco（美国）。人类气管成纤维细胞和肥大性瘢痕成纤维细胞来自中国细胞库。

复合材料的制备

由于电纺和电喷方法的特性，可以在纳米纤维中同时加入颗粒[30]。在本研究中，将具有理想机械强度和结构稳定性的PLA与TAC药物一起电纺成纳米纤维。同时，将具有良好生物相容性、生物降解性和抗菌特性的壳聚糖（CS）电喷成颗粒。

结论

本研究通过同时电纺-电喷策略成功制备了含有壳聚糖纳米粒子的聚乳酸/他克莫司（CS/PLA/TAC）纳米纤维复合膜，结合了各组分的互补优势，有效预防术后气管狭窄并促进气管伤口愈合。体外实验证实了其良好的生物性能：它促进了正常气管成纤维细胞的增殖、迁移和早期胶原分泌。

CRediT作者贡献声明

吕光超：撰写——原始草稿、验证、方法论、研究、正式分析、数据整理、概念化。冯世云：研究、正式分析、概念化。桑世芳：研究、数据整理。赵慧：方法论、正式分析、数据整理。王凯忠：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了 Jiangsu Qianjing 0BEL-45D临床应用研究（2023091910406）的财政支持。