2022-2023年阿曼登热疫情的基因组学和流行病学洞察

《International Journal of Infectious Diseases》：Genomic and Epidemiological Insights into the 2022-23 Dengue outbreak in Oman

　　阿斯玛·阿尔·巴拉乌希（Asma Al Balushi）| 罗希特·萨蒂亚姆（Rohit Satyam）| 法特玛·巴·阿拉维（Fatma Ba Alawi）| 萨比尔·阿德鲁布（Sabir Adroub）| 拉米娅·布阿拉（Lamiae Boualla）| 苏鲁德·阿尔·马马里（Khuloud Al Maamari）| 托比亚斯·穆里埃（Tobias Mourier）| 萨拉·阿尔·西纳尼（Sara Al Sinani）| 巴达尔·阿尔·布赛迪（Badar Al Busaidi）| 阿扎·赛义德·阿尔·卡尤迪（Azza Said Al Qayoudhi）| 阿尔纳布·佩因（Arnab Pain）
阿曼马斯喀特苏丹卡布斯大学医院医学系

**摘要**
登革热被公认为一种被忽视的热带疾病，它在流行区和新兴地区仍然对公共卫生构成重大挑战。阿曼此前被认为是一个低风险国家，但最近报告了本地传播的增加。本研究旨在分析2022-2023年疫情期间流行的登革热病毒（DENV）基因组的多样性。

**方法**
我们分析了来自苏丹卡布斯大学医院的162份DENV阳性患者样本。通过长读长扩增子测序获得了近乎完整的基因组，并与全球参考基因组进行了系统发育比较。

**结果**
DENV-2基因型II-F1.1占样本总数的95.68%。DENV-1和DENV-3在阿曼首次被检测到。六例DENV-1基因型III-A中的五例和一例DENV-3基因型I-A2表明可能存在本地传播。系统发育重建显示阿曼的DENV-1和DENV-2序列具有独特的单系群，表明研究群体内可能存在局部传播。DENV-1与巴基斯坦的病毒谱系聚类，表明可能是输入性感染；而两例不同的DENV-2病例与印度的分离株一致，这与他们的旅行史相符。

**结论**
这是中东和北非（MENA）地区首次进行的全长度DENV基因组研究，记录了该群体中发现的多种病毒谱系，并提供了阿曼存在本地传播的证据，强调了实时基因组监测对于控制登革热的重要性。

**引言**
登革热病毒（DENV）是一种属于黄病毒科（Flaviviridae）的正链单链RNA病毒，包含四种抗原不同的血清型（DENV-1至DENV-4）。每种血清型可引起从轻度登革热（DF）到严重的登革出血热（DHF）或登革休克综合征（DSS）等一系列临床表现[1]。该病毒依赖于关键基因，包括介导宿主细胞进入和免疫逃逸的包膜（E）蛋白基因，以及对病毒复制和致病性至关重要的非结构基因（NS1、NS3和NS5）[2]。
根据世界卫生组织（WHO）的数据，尽管登革热被归类为被忽视的热带疾病，但它仍然是全球主要的健康威胁，影响超过100个国家。截至2024年4月，全球报告的病例已超过760万例，反映了这一疾病的巨大负担[https://www.who.int/emergencies/disease-outbreak-news/item/2024-DON518]。环境变化使登革热媒介（埃及伊蚊和白纹伊蚊）扩展到以前未受影响的地区，而快速的城市化、薄弱的监测体系、增加的旅行活动以及有限的公共卫生基础设施进一步推动了疾病的传播[3]。包括阿曼在内的多个中东和北非国家报告了登革热发病率的上升[4]。虽然历史上阿曼的登革热发病率低于印度和印度尼西亚等高发国家，但诊断不足和监测限制可能掩盖了实际的疾病负担。阿曼的登革热死亡率在全球排名前十，每10万人中有0.89人死亡，超过了多个邻近的MENA国家（世界卫生排名，2020年）[图1A]。最近在沿海地区（包括马斯喀特、佐法尔和阿尔巴蒂纳）发现的本土登革热病例表明该地区正朝着持续的本地传播转变[图1B]。病例数的增加与住院率升高和严重临床表现（如登革出血热和登革休克综合征）有关，尤其是在儿童和老年人中，这主要是由于诊断延迟[5,6]。疾病控制仍然具有挑战性，因为登革热的管理主要依赖于支持性护理和通过媒介控制进行预防。疫苗使用有限，因此需要更加依赖及时的监测[2,7]。基因组监测能够早期发现疫情[5]，追踪病毒进化，并了解影响传播、疾病严重程度和疫苗效力的突变[8,9]。然而，尽管其具有重要的公共卫生意义，中东和北非地区的登革热基因组监测仍然有限[9]。如果没有加强监测、早期发现和有针对性的控制措施，阿曼的医疗系统负担可能会增加。

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**图1.**
(A) 过去二十年中九个MENA国家登革热死亡人数的估计变化。阿曼的死亡人数上升幅度较大。该图表来自Our World in Data，并使用Adobe Illustrator进行了修改（请注意，死亡率数据仅截至2021年）。
(B) 2000年至2023年间阿曼报告的登革热病例数，2022年和2023年感染人数显著增加。图中显示了2022年和2023年的省级病例分布，马斯喀特两年间的发病率始终最高。2023年阿德达赫利亚（Ad Dakhliyah）和阿尔巴蒂纳北部（Al Batinah North）的病例数明显增加，反映了各地区的流行病学趋势变化。

**方法论**
(1) **患者资格和伦理**：纳入2022年1月至2023年7月期间在苏丹卡布斯大学医院就诊的实验室确诊为登革热（RT-PCR或NS1阳性）且年龄≥13岁的患者。采用捕获ELISA（Panbio?，Abbott）对血清或血浆样本（n=162）进行NS1抗原和IgM/IgG抗体检测作为常规诊断的一部分。所有样本的NS1抗原均为阳性。这些样本被匿名处理，存储在-40°C下，并转移至KAUST进行基因组分析。样本来自马斯喀特的一个三级护理中心，可能无法完全代表阿曼所有地区的登革热病毒多样性。
(2) **RNA提取和血清型特异性多重PCR**：使用RNAdvance Viral Kit（Beckman Coulter）在Biomek i7工作站上从200 μL血清中提取RNA，并用40 μL洗脱；然后使用SuperScript IV VILO（Thermo Fisher Scientific）从10 μL RNA中逆转录。通过两个重叠引物池（池1和池2）进行血清型特异性多重PCR[10]，生成400 bp的扩增子，四个血清型之间有50 bp的重叠；每个池在25 μL反应中扩增2.5 μL cDNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix（New England Biolabs）和引物（10 μM），条件为：98°C 30秒，然后35个循环，每次98°C 15秒和65°C 5分钟。两个池的产物合并后，用AMPure beads（Agencourt）纯化，用25 μL EB缓冲液洗脱，并使用Qubit dsDNA HS检测盒（Thermo Fisher Scientific）进行定量。
(3) **文库制备和Oxford Nanopore（ONT）测序**：根据制造商的方案，使用Oxford Nanopore Ligation Sequencing Kit（SQK-NBD114.96）将纯化的PCR产物转化为测序文库。预处理的样本用ONT Native Barcoding Kit进行条形码标记，等摩尔混合后，用AMPure XP beads纯化，并用35 μL洗脱缓冲液洗脱。为了适配子连接，每个混合文库的30 μL使用NEBNext Quick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）进行连接，再次用AMPure XP beads纯化，然后用15 μL洗脱液洗脱。文库在R10.4.1流式细胞仪（FLO-MIN114）上使用MinION Mk1C（Oxford Nanopore Technologies，英国）进行48小时测序。测序试剂盒使用pod5（v0.3.23）进行验证，碱基调用和多路复用使用Dorado（v0.9.1）进行，运行质量使用pycoQC（v2.5.0.3）进行评估[11]。
(4) **血清型鉴定、基因型鉴定和基因组注释**：使用Genome Detective Pan-viral平台（v2.18.0）[12,13]上传FASTQ文件进行DENV血清型和基因型鉴定。组装的基因组使用默认的宏基因组管线处理，基因型调用使用Craft web服务器[14]独立确认。使用seqkit（v2.8.2）的stats子命令评估基因组完整性，并使用FLAVi v2（Fast Loci Annotation of Viruses）[16]进行注释。
(5) **系统发育分析和基因型确认**：基因组和元数据来自Nextclade Dengue仓库（https://github.com/nextstrain/dengue/tree/main/phylogenetic）。根据NextClade排除标准（https://github.com/nextstrain/dengue/blob/main/phylogenetic/defaults/exclude.txt，最后访问日期：2025年4月2日）移除的序列（长度小于8 Kbp），得到6,795个DENV-1、6,059个DENV-2、3,124个DENV-3和1,463个DENV-4组装。使用VSEARCH v2.21.1进行去重，然后将整理后的序列与内部样本结合（见补充表2）。使用MAFFT v7.525（2024年3月13日）生成多重序列比对，并使用CIAlign v1.1.4进行精炼[17]以修剪缺失的末端和去除人为插入。使用IQ-TREE v3.0.0通过最大似然树搜索重建系统发育树[18]，自动确定替代模型。使用TreeTime（v0.11.4）通过最小二乘法对树进行时间校准[19]，并在R中使用ggtree可视化[19]。
(6) **变异分析和优先级排序**：从Genome Detective获取变异调用文件（VCFs）[20]，使用SnpEff 5.2（版本2023-09-29 06:17）[21]进行注释。使用bcftools stats（v1.17；htslib 1.17）[22]生成摘要统计，并使用MultiQC[23]进行汇总。量化最常见的同义突变和错义突变，并使用bedtools intersect -v区分死亡患者和出院患者的私人突变[21]。使用vcf2maf v1.6.22（https://github.com/mskcc/vcf2maf）将VCFs转换为MAF，并使用自定义R脚本将变异映射到多蛋白结构域[22]。由于DENV-1和DENV-2的样本量较大，仅评估了错义突变的结构影响[24]。
(7) **统计分析**：连续变量以中位数和四分位数范围报告，并使用独立样本t检验进行比较。分类变量以计数和百分比表示，并根据需要使用卡方检验或Fisher精确检验进行比较。

**基线人口统计学和临床特征**
在2022年1月至2023年7月的登革热疫情期间，共从苏丹卡布斯大学医院的患者中收集了162份NS1抗原和RT-PCR阳性的样本。大多数病例来自马斯喀特省，其次是阿尔巴蒂纳南部（图2A；补充表1）。性别分布平衡，152/162（93.8%）的样本是阿曼公民（图2B）。六名患者报告了旅行史，包括五名阿曼人和一名来自巴基斯坦的非阿曼人（补充文件1：表1a）。病例数在每年4月至5月达到高峰。住院患者的年龄大于门诊患者（中位数54岁[IQR 33-67] vs. 38岁[IQR 29-52]，p <0.001）（图2B；补充表1）。常见合并症包括高血压（28.4%；46/162）、糖尿病（23.5%；38/162）、慢性心脏病（15.4%；25/162）和慢性肾病（9.3%；15/162），主要见于住院患者。发热是最常见的症状（94.4%；153/162）。住院患者从症状出现到就诊的中位时间更长（中位数4天[IQR 2-6天]， vs. 门诊患者[中位数3天[IQR 2-5天]，p = 0.018），反映了典型的登革热病程，即更严重的症状通常在症状出现几天后出现（补充表1；补充图1）。

**实验室结果**
住院患者表现出更严重的血小板减少（57 ×10?/L，[IQR 31–83] vs. 168 ×10?/L，[IQR 116–220]；p<0.001）和更严重的肝脏受累，AST水平升高（143 U/L，[IQR 76–280] vs. 46 U/L，[IQR 28–65]；p<0.001）以及ALT水平升高（95 U/L，[IQR 43-197] vs. 34 U/L，[IQR 19–47]；p<0.001）。这些差异与定义疾病严重程度的既定临床标准一致，表明住院患者和门诊患者之间的比较反映了预期的临床分层。住院患者的IgG和IgM血清阳性率也更高（IgG：22.5% vs. 7.8%，p=0.014；IgM：55.9%， vs. 31.4%，p=0.007）。在采样时，许多患者尚未发生血清转化：82.1%为IgG阴性，51.9%为IgM阴性。NS1抗原检测证实了抗体阴性的患者也感染了登革热（补充表1）。

**病毒测序和基因型鉴定**
样本的PCR筛查显示Ct值范围为14至39.29（补充图2），其中21个样本的Ct值<10。在2023年的队列中，随着Ct值的增加，基因组覆盖度下降，而2022年的队列则没有这种情况。除了一个样本（Oman_06323，覆盖度为63.33%）外，所有样本均获得了近乎完整的病毒基因组（覆盖度>90%，深度>20倍），平均覆盖度为97.88%。基因分型确定了155个DENV-2基因型II分离株（主要谱系F，次要谱系1.1），5个来自Al Batinah South的DENV-1基因型III分离株，以及1个DENV-3基因型I分离株，表明在疫情爆发期间存在多种登革热病毒血清型的共循环（图2A-C）。系统动态分析使用全球参考序列进行了系统发育分析，以验证阿曼地区的DENV-1、DENV-2和DENV-3的谱系归属。IQ-TREE 3自动选择了适当的替换模型[18]，分别为DENV-1选择GTR+F+R9，DENV-2选择GTR+F+I+R9，DENV-3选择GTR+F+R8。这些系统发育树随后被输入TreeTime，并使用从根到尖端的回归方法对其进行 rooted[19]。对于DENV-1，所有阿曼样本形成了一个单一的、得到良好支持的单系传播群体（图3A）。该群体与2022年的巴基斯坦序列显示出姐妹关系，这些巴基斯坦序列在进化上似乎更原始。这种模式与该地区可能的隐秘传播一致；然而，由于样本收集不完整，无法得出明确结论，也可能反映了疫情爆发前阿曼与巴基斯坦之间未被发现的传播或流行病学联系。所有阿曼DENV-1样本的单系聚集表明可能存在一个已建立的本地传播链，而不是多次独立引入，尽管需要更广泛的地理采样来确认这一点。

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图3. 来自阿曼的（A）DENV-1、（B）DENV-2和（C）DENV-3分离株的最大似然系统发育树。这些树只是显示了阿曼基因组及其相邻分支的部分。大多数阿曼DENV-1和DENV-2样本与2022年公开的巴基斯坦基因组具有进化相关性，少数样本与2022年的印度菌株聚集在一起（底部中间和右侧的面板）。邻近阿曼样本的基因组标有起源国家和样本收集日期。Shimodaira-Hasegawa近似似然比测试（SH-aLRT）分支支持和Ultrafast Bootstrap值（SH-aLRT/UFBoot）用灰色文本表示。

对于DENV-2，155个序列中的149个形成了一个大的单系支系，与2022年和2024年的巴基斯坦序列聚集（图3B）。然而，有几个异常值揭示了更复杂的传播模式：三个样本（Oman_95373、Oman_97384和Oman_63273）与2022年的印度序列聚集，其中一个（Oman_95373）有近期前往阿联酋的旅行史；Oman_76300基础性地与2021年的印度序列聚集，对应于近期前往印度的旅行；两个没有旅行史的样本（Oman_3754和Oman_32859）与2017-2018年的斯里兰卡分离株形成了一个单独的支系（图3B）。这些发现表明，虽然大多数DENV-2病例反映了主要的本地传播链，但来自印度和斯里兰卡的多次独立引入也可能是疫情的原因之一；然而，这些模式可能不代表全国范围内的传播动态。

唯一的DENV-3样本（Oman_37717）尽管没有报告旅行史，仍基础性地与2021年的孟加拉国分离株聚集（图3C），这表明可能存在未被发现的本地传播、监测不全面或未被采样的中间谱系。

总的来说，根据目前采样的群体情况，这些系统发育发现表明阿曼地区的登革热病毒格局呈现双重模式，既有本地传播也有反复的病毒引入，强调了持续基因组监测以追踪病毒进化和新出现谱系并指导公共卫生策略的必要性。

变异分析识别出登革热基因组中的多种潜在稳定突变。从Genome Detective[13]获取了变异调用文件（VCFs），并使用SNPEff[21]进行注释，将突变分类为高、中、低和修饰型，分析重点是错义变化（补充图3 A和B）。在所有三种血清型中，转换占主导地位，C>T和T>C替换最为常见，其次是A>G和G>A（补充图4），这与之前的观察结果一致[25]。尽管尚未从功能上得到证实，但过量的C>U（C>T）突变在RNA病毒中是非随机的，通常归因于宿主介导的RNA编辑（APOBEC3驱动的胞嘧啶脱氨）[26]（补充图4）。此外，基因变异的量化在DENV-1中识别出708个、DENV-2中识别出1108个、DENV-3中识别出626个独特的同义突变，以及分别121个、295个和98个错义突变。通过使用GFF注释将基因组划分为不重叠的基因区间来评估区域突变模式（补充文件2：表2a–c）。为了捕捉相对于区域长度的变异相对丰度，我们计算了各种基因区域中SNVs的基因长度标准化计数。在DENV-1中，同义突变最常见于NS2A和NS4A，其次是膜糖蛋白M和NS4B；而在DENV-2中，NS4A、NS2A蛋白2K和NS2B中的同义SNVs过度表达。错义突变在DENV-1中最为常见于NS2A，在DENV-2中最为常见于膜糖蛋白M，突出了氨基酸变异的热点区域（图4 A和B）。这些观察结果与来自印度地方性登革热样本的报告一致，尽管这些突变的功能影响尚不完全清楚[27,28]。

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图4. （A）DENV-1和（B）DENV-2样本中编码各种结构和非结构蛋白的基因组区域中的长度标准化的同义和非同义突变。列代表样本，行代表DENV的基因区域。

使用Viro3D[24]提供的蛋白质结构域模型稳定性影响通过三种ΔΔG预测算法进行了评估：mCSM[29]、MAESTRO[30]和DDMut[31]，其中正的ΔΔG表示稳定，负的ΔΔG表示不稳定。在DENV-1中，观察到特定的结构域模式，催化核心结构域（CCD）的突变频率最高，其次是NS1和NS2A。两个RdRp突变在保守的多聚酶基序中较为显著：p.A3109V (c.9326C>T；基序B) 被预测为稳定突变，p.I3162T (c.9485_9486delTCinsCT；基序C) 被预测为不稳定突变。尽管之前有报道RdRp突变不耐受，但包括那些在保守基序内的同义和非同义突变都较为常见，表明选择压力较小或存在保持聚合酶功能的补偿性突变[32]（补充文件3）。稳定突变p.D317N和p.Q2113L分别在糖蛋白中心二聚化结构和NS4A中一致观察到，突出了可能影响病毒适应性和稳定性的区域（补充图5）。在DENV-2中，NS1和RdRp CCD每个样本约有13个错义突变。RdRp中的突变，特别是p.K3291T (c.9872A>C) 和 p.Q332H (c.996G>T)，位于催化核心结构域内，代表了重要的氨基酸变异位点。这些突变可能与潜在的功能或结构影响相关，需要实验验证。

在162名实验室确诊的登革热患者中，10人（6.2%）需要入住重症监护室（ICU），6人（3.7%）在住院期间死亡。双尾Fisher精确检验未发现DENV基因型与死亡率之间有显著关联，尽管所有致命病例都涉及DENV-2基因型II，谱系F.1.1。对死亡患者和康复患者的分离株进行比较基因组分析未发现与致命结果唯一相关的突变。鉴于死亡人数较少，该研究可能不足以检测到微妙的基因型-结果关联。

这项研究首次全面调查了阿曼地区的登革热病毒（DENV），提供了循环血清型的完整特征，并建立了基于基因组学的监测框架。整合病毒基因组和临床数据可以洞察循环谱系、传播动态以及影响疾病严重性的宿主因素。DENV感染从轻微发热到需要重症监护甚至死亡不等。正如先前的研究报告，宿主合并症（如糖尿病、高血压和慢性肾脏病）与我们的队列中更严重的登革热风险相关[33]。住院患者表现出严重的实验室指标，包括升高的血细胞比容、血小板减少、转氨酶升高和低白蛋白血症，反映了血浆渗漏、肝脏受累和出血风险[34]。血清学谱型与疾病时间和严重程度一致。早期就诊的患者以IgM为主，而住院患者中的IgG阳性率较高，表明存在继发感染和潜在的抗体依赖性增强，与之前的研究一致[35,36]。基因组测序产生了高质量的组装（中位覆盖率>97.88%），2023年的样本显示Ct值与覆盖率之间存在适度负相关，与之前的报告一致[37,38]。多重PCR和短扩增子策略改善了低Ct值的样本恢复，但在较高Ct值时效果有限，这强调了优化样本质量和RNA输入的重要性[37,38]。DENV-2基因型II-F占主导地位，有隐秘的DENV-1基因型III-A和可能的DENV-3基因型I-A传播的证据，表明存在以前未报告的多种血清型的共循环[6]。全球范围内，DENV-2 II-F主要分布在欧亚地区，而DENV-1 III-A已在非洲和亚洲报告[12]。这种复杂的血清型分布反映了地区模式，包括沙特阿拉伯的模式，并强调了阿拉伯半岛上登革热病毒格局的演变，强调了持续基因组监测的必要性[39]。系统发育分析表明阿曼DENV-1和DENV-2与巴基斯坦序列紧密聚集，表明可能是通过旅行或人员流动引入的；然而，来自邻国的基因组数据有限，限制了传播的完整重建，强调了扩大区域测序的必要性[27]。唯一的DENV-3基因组（基因型I，谱系A2）与2021年孟加拉国的分离株聚集；然而，由于缺乏旅行史和之前的本地报告，无法确定其引入方式或是否为本土传播。这一独特基因组的发现强调了持续监测以捕获未报告谱型的重要性。

疾病严重程度因疫情不同而异，取决于循环的病毒株和宿主反应。DENV-2和DENV-3通常与严重的登革热相关，特别是在继发感染和高流行地区[40]。DENV-2亚洲/美洲（基因型III）[41,42]和DENV-1基因型V [43]内的基因型变异可能通过增强复制、免疫逃避或非结构蛋白中的突变影响毒力。在我们的研究中，所有致命病例都涉及DENV-2基因型II，谱系F.1.1；然而，没有基因型特异性突变与死亡率相关，表明疾病严重程度并非主要由病毒遗传因素驱动。然而，致命病例中缺乏致病性变异可能是因为当前研究中的致命病例数量有限，需要更大的基因组数据集。根据现有的样本集，宿主因素起主要作用，22.5%的严重病例有预先存在的抗DENV IgG，与抗体依赖性增强一致，同时合并症在严重病例中较为普遍。其他因素，包括宿主基因多态性和免疫反应变异性，也可能影响临床异质性[33]。致命病例中缺乏独特的病毒变异进一步支持了严重后果是由宿主-病毒相互作用而非病毒进化单独引起的观点。整合宿主遗传学、纵向免疫分析和更大的多中心病毒基因组数据集有助于更好地理解严重性和死亡率的决定因素。

这项来自阿曼的首次全长DENV基因组研究强调了多样的谱系，其中DENV-2占主导地位，并提供了阿曼存在本地传播的证据。通过结合病毒基因组和临床数据，该研究提供了关于循环血清型、谱系多样性和影响疾病严重性的宿主因素的新见解，为该地区的基因组学驱动的登革热监测建立了框架。

当前研究的局限性包括仅来自一个三级护理中心的样本，这可能过高估计了严重病例的比例，并低估了社区层面的传播；地区基因组数据有限，限制了传播链的精确重建；以及非DENV-2和致命病例的数量较少，限制了基因型-严重程度分析。尽管存在这些局限性，该研究展示了基因组监测在追踪病毒进化、识别新出现谱型和指导公共卫生策略方面的实用性和重要性。这突显了在阿曼和更广泛的阿拉伯半岛加强多中心监测和主动基因组监控的紧迫性。

作者贡献：
AAB：概念构思、样本和元数据收集、提案提交和伦理批准、手稿准备（临床部分）和校对；
RS：数据分析、手稿准备（生物信息学分析）和校对；
FBA & KAM：研究构思、想法提出、项目协调（包括实验室样本管理）和临床数据审查；
SA和LB：样本处理、测序、手稿准备和校对；
TM：统计分析和校对；
SAS、BAB和ASAQ：样本和元数据收集和运输；
AP：研究构思、资金获取、项目协调、校对、结构化和提交。

资助来源：
这项研究由Arnab Pain教授的Faculty Baseline Fund（资助编号BAS/1/1020-01-01）资助，以及KAUST智能健康卓越中心的KCSH资助（资助编号FCC/1/5932-01-01）和UK Foreign, Commonwealth & Development Office通过Wellcome Trust Epidemic Preparedness资助（资助编号224845/Z/21/Z）。

伦理批准：
已获得SQUH（SQU-EC/137/2023）和KAUST（22IBEC010）的伦理批准。所有样本均进行了去标识处理，并且不要求获得书面同意。

数据访问声明：
本研究中生成的原始数据已提交给欧洲核苷酸档案库（ENA），项目编号PRJEB96736。用于生成图像的代码在补充材料中提供。补充文件可在Zenodo上找到（10.5281/zenodo.17564881）。