HuR通过促进翻译起始复合物的形成，增强了IRES驱动的Senecavirus A病毒翻译过程

《Agriculture Communications》：HuR Promotes IRES-Driven Translation of Senecavirus A by Facilitating the Formation of Translation Initiation Complexes

　　张林茹 | 万浩成 | 周梦涵 | 施彦 | 李新伟 | 胡曼 | 张宇航 | 何文瑞 | 万博 | 李明明 | 张桂花 | 韩世冲
中国河南农业大学兽医学院国家动物免疫学国际联合研究中心，郑州450046

**摘要**
Senecavirus A（SVA）属于小RNA病毒科（Picornaviridae），它不仅是一种新兴的猪病病原体，还是一种具有强大溶瘤能力的病毒，能够引发神经内分泌恶性肿瘤。为了高效复制，SVA利用复杂的策略劫持宿主的翻译机制，通过其内部的核糖体结合位点（IRES）元件来启动病毒蛋白的合成，尽管其背后的调控机制尚未完全阐明。在这项研究中，我们发现人类抗原R（HuR）这种已知的RNA结合型转录后调控因子，能够上调由SVA IRES驱动的翻译和复制过程。研究表明，在SVA感染后，HuR从细胞核转移到细胞质中，并通过促进病毒IRES上翻译起始复合物的形成来特异性地促进病毒翻译。我们还确定了HuR的C末端RNA识别结构域是这一过程中最重要的区域。进一步的机制分析显示，病毒蛋白VP1、2AB和3Cpro通过不同的机制协同作用促进HuR的核质转运：VP1与HuR直接相互作用，促进其定位到细胞质；而2AB和3Cpro则通过自噬依赖途径降解核孔蛋白62和核孔蛋白214，从而破坏核孔的通透性。有趣的是，HuR可能也是其他含有IRES的小RNA病毒和黄病毒（flaviviruses）中调节翻译和感染过程的保守因子。总的来说，我们的发现揭示了HuR在启动IRES驱动的翻译过程中的新调控功能，这为其作为广谱抗病毒治疗靶点提供了潜在的应用前景。

**1. 引言**
Senecavirus A（SVA），以前称为Seneca Valley病毒，是小RNA病毒科（Picornaviridae）中Senecavirus属的唯一成员。这种在细胞质中复制的RNA病毒具有约7300个核苷酸长度的单链正链RNA基因组。其基因组结构包含一个大的开放阅读框（ORF），两侧由广泛折叠的5′-非翻译区（5′-UTR）和3′-非翻译区（3′-UTR）限定。ORF的翻译从靠近内部核糖体结合位点（IRES）的起始密码子开始，生成一个多蛋白前体，该前体随后被病毒蛋白酶切割为四个结构蛋白（VP1–VP4）和八个非结构蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3Cpro和3Dpol）[1], [2], [3]。作为新兴的猪病病原体，SVA与猪群中的囊性疾病和新生仔猪的群体死亡事件有关，对国际猪肉生产构成了严重威胁[4], [5], [6]。此外，SVA还作为一种天然存在的溶瘤病毒，对神经内分泌来源的肿瘤细胞具有优先攻击性，这一特性使其成为治疗小细胞肺癌的临床研究候选药物[7], [8], [9]。

作为专性细胞内寄生虫，病毒完全依赖于宿主细胞的翻译机制来生成其复制所需的蛋白质。为此，病毒发展出了复杂的机制来颠覆宿主的蛋白质合成系统，以优先生产病毒蛋白。这种颠覆不仅减少了翻译资源的竞争，还抑制了宿主的先天免疫防御[10], [11], [12], [13]。根据翻译起始的机制，细胞翻译途径可以分为依赖帽结构（cap-dependent）和依赖IRES（IRES-dependent）的过程，其中翻译起始是决定性的步骤。值得注意的是，小RNA病毒基因组的5′-UTR区域包含一个IRES结构，该结构具有复杂的二级和三级结构，包括伪结（pseudoknots）和茎-环结构（stem–loops），这些结构通过多种特定的RNA–蛋白质和RNA–RNA相互作用来调控核糖体的结合[14], [15], [16], [17]。SVA的IRES包含两个主要的茎-环结构域DII和DIII，以及AUG起始密码子上游的一个伪结结构，这些成分已被证明对SVA的翻译和复制至关重要[18], [19], [20]。某些编码参与细胞周期、凋亡和应激反应的细胞mRNA中也存在IRES元素[21]。在应激条件下，细胞的翻译可以从依赖帽结构的方式转变为依赖IRES的方式，小RNA病毒可以利用这一点来优先合成病毒蛋白而不是宿主基因[14]。

一般来说，病毒IRES可分为四类，每类都具有独特的二级结构和核糖体招募机制。鉴于IRES的复杂性和灵活性，IRES驱动的翻译需要常规的翻译起始因子（eIFs）和专门的IRES作用因子（ITAFs）的共同参与[14]。大多数ITAFs是多功能RNA结合蛋白（RBPs），它们在调节IRES活性中起关键作用，可以通过改变IRES的构象来优化其与翻译机制组分的相互作用[14], [17], [22], [23]。因此，ITAFs对IRES介导的翻译的调节为重新分配细胞翻译资源、促进病毒在感染期间的适应性提供了另一种途径。例如，在口蹄疫病毒（FMDV）的感染过程中，宿主的RBP DEAD box helicase 3和核仁素（nucleolin）作为正催化剂（positive ITAFs）参与促进病毒IRES上翻译起始复合物的形成[24], [25]。此外，还有一些多功能蛋白，如嘧啶链结合蛋白（pyrimidine tract binding protein）、富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子3（serine/arginine-rich splicing factor 3）、远上游元件结合蛋白1（far upstream element-binding protein 1）和Src相关有丝分裂相关蛋白68 kDa（Src-associated in mitosis 68 kDa protein），也被证明可以刺激病毒IRES的活性[26], [27], [28], [29], [30]。然而，病毒与宿主之间在IRES介导的翻译起始过程中的相互作用仍大部分未知。因此，在本研究中，我们试图进一步阐明ITAFs调节SVA IRES介导的翻译的机制。

此前，我们实验室的研究人员已经系统地鉴定出与SVA 5′-UTR相互作用以及响应SVA感染而发生核质转运的细胞蛋白[31], [32]。通过整合这两组发现，我们发现了人类抗原R（HuR），也称为ELAV样蛋白1。HuR是一种众所周知的转录后基因表达调控因子，在多种人类癌症中过表达，通过与多种致癌mRNA的相互作用促进肿瘤发生[33]。在静息状态下，HuR主要位于细胞核中，但在应激条件下会转移到细胞质中，这一转移对其介导的功能（包括核输出、稳定性及其靶mRNAs的翻译）至关重要[34], [35]。值得注意的是，还有报道表明HuR支持几种RNA病毒（包括丙型肝炎病毒HCV和柯萨奇病毒B3 CVB3）的翻译和复制[36], [37]。病毒感染会触发HuR的细胞质重新定位，使其能够与病毒RNA相互作用，从而指导病毒复制[38]。然而，HuR在SVA生命周期中的作用尚未得到阐明。在本研究中，我们利用HuR的RNA结合能力和核质穿梭特性来揭示其影响SVA复制的机制，并研究了驱动HuR核质转运的病毒机制。我们的发现揭示了HuR在小RNA病毒翻译调控中的新功能。

**2. 材料与方法**
2.1. 细胞系和病毒株
使用的猪细胞系包括Instituto Biologico-Rim Suino-2 [IBRS-2; 美国ATCC文化收集（ATCC; 马纳萨斯，VA，美国）CRL-1835，RRID：CVCL_4528] 和 porcine kidney-15 (PK-15; ATCC CCL-33, RRID：CVCL_2160），以及人胚肾细胞系HEK293T (ATCC CRL-11268, RRID：CVCL_1926)，这些细胞在添加了10%胎牛血清（FBS; Gibco, Grand Island, NY, USA, 编号30044333）和抗生素-抗真菌溶液（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素; Solarbio, Beijing, China, 编号P1400）的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Solarbio, Beijing, China, 编号12100）中培养。所有细胞培养物在含有5% CO2的潮湿环境中维持在37°C。SVA株CH-HuB-2017（GenBank登录号MN922286.1）在我们的实验室中繁殖并用于实验。

2.2. 抗体和化学试剂
来自兔子的多克隆抗体包括针对HuR（编号11910-1-AP）、HA（编号66006-2-IG）、Flag（编号66008-4-IG）、Lamin B（编号12987-1-AP）、eIF2α（编号11233-1-AP）、eIF3j（编号10493-1-AP）、eIF4A（编号11280-1-AP）、eIF4G（编号15704-1-AP）、eIF5B（编号13527-1-AP）和多聚腺苷酸结合蛋白（PABP；编号10970-1-AP），以及来自小鼠的单克隆抗体，包括针对Flag（编号20543-1-AP）、活化C激酶1受体（RACK1；编号27592-1-AP）、β-actin（编号81115-1-RR）和羊抗兔（编号SA00001-2）或抗鼠（编号SA00012-1）的二级抗体，这些抗体均购自Proteintech Group, Inc.（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。来自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的小鼠单克隆抗HuR抗体（编号MA1-167）。来自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）的羊抗兔二级抗体，分别偶联Alexa Fluor 594（AF594；编号A-11012）或Alexa Fluor 488（AF488；编号A-11008），以及偶联AF594（编号A-11005）或AF488（编号A-11001）的羊抗鼠二级抗体。兔（编号A7016）和小鼠（编号A7028）免疫球蛋白G（IgG）对照品由Beyotime Biotechnology（中国上海）提供。我们在实验室中制备了针对SVA VP1的小鼠单克隆抗体和针对SVA VP2的兔多克隆抗体。环己酰胺（CHX）购自APExBIO（美国德克萨斯州休斯顿，编号A8244）。Z-Val-Ala-Asp (OMe)-Fluoromethylketone（Z-VAD-FMK）购自Selleck Chemicals（美国德克萨斯州休斯顿，编号S7023）。3-甲基腺嘌呤（3-MA；编号T1879）和Z-Leu-Leu-Leu-al（MG132；编号T2154）购自TargetMol（美国马萨诸塞州波士顿）。二甲基亚砜（DMSO）购自Solarbio（中国北京，编号D8371）。

2.3. 质粒构建
通过标准逆转录聚合酶链反应（RT–PCR）从PK-15细胞扩增相应的cDNA，随后将其亚克隆到p3×Flag-CMV-14（编号KL-ZL-1888）或PRK-HA（编号KL-ZL-2280，均来自Addgene，美国马萨诸塞州沃特敦）质粒中，从而获得带有Flag或HA标签的构建体。从SVA cDNA中扩增结构蛋白和非结构蛋白的编码区，并插入p3×Flag-CMV-14载体中，生成带有Flag标签的病毒蛋白。双顺反子报告质粒的生成遵循既定方案[39]。具体来说，从SVA（包括下游ORF的57个碱基对）、FMDV、脊髓灰质炎病毒（PV）、肠病毒71（EV71）和经典猪瘟病毒（CSFV）（包括下游ORF的69个碱基对）中PCR扩增IRES元素，然后将其亚克隆到psiCHECK-2双萤光素酶载体（Promega Corporation，美国威斯康星州麦迪逊，编号C8021）中。

2.4. RNA干扰
针对HuR转录本的基因特异性小干扰RNA（siRNA）（siHuR）和随机设计的阴性对照siRNA（siNC）由GenePharma（中国上海）化学合成。siRNA序列如下：porcine HuR，5′-CCAGUUUCAAUGGUCAUAATT-3′；siNC，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。当细胞融合度达到70%时，使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，编号13778150）按照制造商说明进行细胞转染。

2.5. 定量RT–PCR（qPCR）
总RNA使用RNeasy Plus Kit（Qiagen，德国希登，编号9109）分离，然后使用HiScript Reverse Transcriptase Kit（Vazyme，中国江苏南京，编号R222-01）合成cDNA。我们使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国江苏南京，编号Q711-02）在QuantStudio 5 Real-Time PCR系统（Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州）上进行qPCR扩增。基因表达水平以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内源性对照进行标准化，并通过荧光定量法（PCR相对定量）进行量化。qPCR的具体引物序列见表1。

**表1. qPCR和PCRP使用的引物序列**
| 目标 | 导向 | 引物序列 |
| --- | --- | --- |
| SVA | 正向 | 5′-CACCGACAACGCCGAGAC-3′ | 反向 | 5′-GAGATCGGTCAAACAGGAATTTGAC-3′ |
| SVA GAPDH | 正向 | 5′-ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA-3′ | 反向 | 5′-GATCGAGTTGGGGCTGTGACT-3′ |
| porcine HuR | 正向 | 5′-CCATGACCCAGAAGGACGTG-3′ | 反向 | 5′-CCTCTGGACAAACCTGTGGT-3′ |
| SVA IRES | 正向 | 5′-CTCGACCCTCCTTAGTAAGGGAA-3′ | 反向 | 5′-ATTTGTATGTGCTACCTATAGAAC-3′ |
| SVA 3′-UTR | 正向 | 5′-ACAACGACGGCTTATATAAACCAG-3′ | 反向 | 5′-TTCTGTTCCGACTGAGTTCTCCC-3′ |
| porcine RPS16 | 正向 | 5′-CTGCAGCCATGCCTTCCAAGGGT-3′ | 反向 | 5′-TCATCACGATGGGCTTATCGGT-3′ |
| SVA GAPDH | 正向 | 5′-GTCCATGCCATCACTGCCACCCAG-3′ | 反向 | 5′-GCTGTTGAAGTCACAGGACACAAC-3′ |

2.6. 共聚焦免疫荧光显微镜
在玻璃盖片上培养的PK-15和IBRS-2细胞以感染复数（MOI）为1进行SVA感染。感染后指定时间点，用4%甲醛（Solarbio，北京，编号P1110）在磷酸盐缓冲液（PBS）中固定15分钟，然后用0.1% Triton X-100（Beyotime Biotechnology，上海，编号P0096）渗透10分钟。用1%牛血清白蛋白在PBS中封闭1小时后，在4°C下过夜使用以下目标的初级抗体进行染色：SVA VP2（1:200）、HuR（1:200）、HA（1:200）和Flag（1:200）。随后用含0.1% Tween-20的PBS清洗三次，再用相应的AF594或AF488标记的二级抗体（1:500）孵育1小时。再用含0.1% Tween-20的PBS清洗后，用Hoechst 33342染料（Beyotime Biotechnology，上海，编号P0133）染色10分钟。共聚焦成像使用Zeiss LSM800激光扫描显微镜（Carl Zeiss AG，德国奥伯科亨）进行。2.7. 核质分离实验PK-15细胞培养在100毫米培养皿中，以1的感染复数（MOI）接种SVA，并在感染后3、6、9和12小时收集样本。根据制造商的协议，使用Nucleus and Cytoplasm Protein Extraction Kit（Invent Biotechnologies，美国明尼苏达州普利茅斯，商品编号SC-003）将核蛋白和质蛋白从细胞单层中分离出来。随后通过Western blotting分析目标蛋白的亚细胞定位，其中β-actin和Lamin B1分别作为质蛋白和核蛋白的标记物。2.8. 共免疫沉淀将HEK293T细胞培养在100毫米培养皿中，短暂转染编码特定蛋白质的质粒。转染24小时后，收集细胞并使用M2裂解缓冲液[20 mM Tris-HCl（pH 7.5；Solarbio，中国北京，商品编号T8230），0.5% Nonidet P-40（北京鼎国长盛生物技术有限公司，中国北京，商品编号DH218），10 mM NaCl，3 mM 乙二胺四乙酸（EDTA；Solarbio，中国北京，商品编号T1300），以及3 mM 乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA；BBI Life Sciences Corporation，中国上海，商品编号A60007-0025）进行裂解，并加入蛋白酶抑制剂（Beyotime Biotechnology，中国上海，商品编号P5309）。超声处理2分钟后，以13,000 × g的速率在4 °C下离心10分钟去除细胞碎片。所得上清液用于与特定抗体进行免疫沉淀和Western blotting实验。2.9. 细胞活力检测本研究使用Enhanced Cell Counting Kit-8（CCK-8；Beyotime Biotechnology，中国上海，商品编号C0041）来评估细胞活力。细胞接种在96孔板中，并接受以下处理：转染特定的siRNAs 48小时，转染带有HA标签的构建体24小时，或用指定浓度的化学物质处理24小时。处理后，根据制造商的说明向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液。孵育2小时后，测量450 nm处的吸光度以确定细胞活力。2.10. 双 Luciferase报告基因检测双报道基因构建体的活性检测方法如前所述[31]。简而言之，PK-15细胞经过HuR敲低或过表达处理后，转染特定的双报道基因质粒。感染后24小时，制备细胞提取物，并使用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega Corporation，美国威斯康星州麦迪逊，商品编号E2980）定量测量Firefly luciferase（FLuc）和Renilla luciferase（RLuc）的活性。2.11. RNA结合蛋白免疫沉淀感染SVA（MOI = 1）的PK-15细胞提取物在感染后9小时制备，然后在冰上使用Protein A-agarose（GE Healthcare，美国伊利诺伊州芝加哥，商品编号20422）预孵育1小时。通过1000 × g的速率在4 °C下离心10分钟去除非特异性复合物。随后进行免疫沉淀。等量的上清液与兔抗HuR抗体、同型对照IgG或仅含裂解缓冲液（无抗体对照）在冰上孵育2小时。加入预平衡的Protein A-agarose珠子，再孵育1小时。通过1000 × g的速率在4 °C下离心5分钟沉淀免疫复合物，并用裂解缓冲液清洗三次。使用RNeasy Plus Kit（Qiagen，德国希伦，商品编号9109）从沉淀物中分离RNA。使用BeyoRTII First Strand cDNA Synthesis Kit（Beyotime Biotechnology，中国上海，商品编号D7168）进行逆转录，随后进行PCR扩增。针对SVA IRES、3′-UTR、GAPDH或核糖体蛋白S16（RPS16）的PCR引物列在表1中。2.12. 生物素化RNA pull-down实验体外转录和生物素化RNA pull-down实验按照先前报道的方法[31]进行。简要来说，将SVA 5′-UTR cDNA克隆到pcDNA3.1空载体（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，商品编号V790-20）中，生成pcDNA3.1–SVA 5′-UTR。使用RiboMAX Large Scale RNA Production System（Promega Corporation，美国威斯康星州麦迪逊，商品编号P1300）和BamHI酶切线性化模板来生成SVA 5′-UTR RNA转录本。随后，按照制造商的指南使用Pierce RNA 3′ End Desthiobiotinylation Kit（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，商品编号20163）对RNA进行生物素标记。将生物素化的SVA 5′-UTR转录本通过室温下30分钟的孵育固定在链霉亲和素包被的磁珠上。然后将磁珠与细胞裂解物在4 °C下旋转60分钟进行孵育。用洗液清洗三次后，加入洗脱缓冲液以分离复合物。最后，使用特定的抗体通过Western blotting检测样本。2.13. 多聚核糖体谱分析转染了特定HA标签蛋白或siRNA的PK-15细胞以1的感染复数接种SVA，并在感染后9小时收获。裂解前，细胞用0.1 mg/mL CHX在37 °C下处理5分钟以抑制核糖体活性。然后用含有20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM KCl、5 mM MgCl2、0.1 mg/mL CHX、1% Triton X-100、50 U/mL RNase抑制剂（Beyotime Biotechnology，中国上海，商品编号R0101-200kU）和1 mM 苯甲基磺酰氟（上海Saint-Bio Biotechnology有限公司，中国上海，商品编号T17264）的多聚核糖体提取缓冲液处理细胞。离心后，将上清液加载到10%–50%蔗糖密度梯度上，并使用Beckman SW 41 Ti转子（Beckman Coulter，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）在210,000 × g的速率下离心3小时。收集各组分后，使用ISCO fraction collector Retriever 500（Teledyne ISCO，美国内布拉斯加州林肯）在254 nm波长下监测吸光度。从每个组分中提取总RNA用于后续的qPCR分析。2.14. 50% 组织培养感染剂量（TCID50）SVA感染的PK-15和IBRS-2细胞和培养基经过三次冻融循环后，依次稀释在无血清的DMEM中。在96孔细胞培养皿中作为单层培养的IBRS-2细胞进行感染，每种稀释重复八次。吸附后1小时，丢弃培养基，并用PBS洗去未吸收的病毒。随后，细胞在添加1% FBS的维持培养基中培养。感染后96小时，计数具有细胞病变效应的细胞数量，并使用Reed-Muench方法确定TCID50值。2.15. 统计分析所有数据来自至少三个独立实验，以均值±标准差（SD）表示。使用SPSS Statistics（IBM Corporation，美国阿蒙克，纽约）通过Student’s t检验评估统计显著性，显著性水平由P值定义：P < 0.05（*），P < 0.01（**）。3. 结果3.1. HuR在SVA复制中起正向调节作用为了明确HuR在SVA生命周期中的功能作用，我们研究了HuR过表达或耗竭如何影响SVA在猪PK-15和IBRS-2细胞系中的传播，这两种细胞系都对猪小RNA病毒感染具有敏感性[40]。首先，我们验证了外源表达或沉默HuR对细胞活力的影响可以忽略不计，这通过感染前的活力测定得到了证实（图1a, b）。获得这些信息后，我们确定了病毒产量以评估HuR对SVA复制的影响。如图1c, d（左侧）所示，在HuR耗尽的细胞中，病毒产量显著降低。具体而言，在感染后6、9和12小时，siHuR转染的PK-15细胞中的病毒滴度分别降低了约4.0倍、8.6倍和11.7倍，在siHuR转染的IBRS-2细胞中分别降低了约15.8倍、13.6倍和5.9倍。相反，在这两种细胞系中，外源HuR表达后病毒产量显著增加（图1e, f，左侧）。Western blotting结果显示，在siHuR转染的PK-15和IBRS-2细胞中VP1表达显著减少，而在HuR异位表达后VP1表达明显增加（图1c–f，中间）。随后的qPCR分析显示，在HuR耗尽的细胞中病毒RNA合成显著减少，而在HuR过表达后显著增加（图1c–f，右侧）。总体而言，这些发现表明，在这两种细胞模型中，HuR作为促进SVA复制的因子。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图1. HuR正向调节SVA的复制。(a和b) HuR敲低或过表达对PK-15 (a)和IBRS-2 (b)细胞活力的影响，通过CCK-8测定。(c和d) HuR敲低对PK-15 (c)或IBRS-2 (d)细胞中SVA滴度、病毒蛋白产生和RNA积累的影响。(e和f) HuR过表达对PK-15 (e)或IBRS-2 (f)细胞中SVA滴度、病毒蛋白产生和RNA积累的影响。数据以三个独立实验的均值±SD表示。*P < 0.05, **P < 0.01。3.2. SVA感染诱导HuR上调和核质转位为了表征SVA感染后HuR表达的动态变化，我们在3、6、9和12小时将SVA接种到PK-15和IBRS-2细胞中，并评估其转录本和蛋白水平与mock感染对照相比的变化。如图2a所示，SVA感染后两种细胞系的HuR mRNA水平呈时间依赖性升高。相应地，我们记录到病毒感染后蛋白水平逐渐增加（图2b）。这些观察结果表明，SVA感染在转录和翻译水平上都显著上调了HuR的表达。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图2. SVA感染上调HuR表达并诱导HuR从核转移到质。(a和b) 在指定感染时间点，SVA (MOI = 1)感染后的PK-15或IBRS-2细胞中HuR的转录本 (a) 和蛋白 (b) 水平。(c) mock感染或SVA感染的PK-15或IBRS-2细胞中HuR的亚细胞定位的共聚焦免疫荧光分析。比例尺，20 μm。(d) 用指定抗体对mock感染或SVA感染的PK-15细胞的质和核组分进行Western blot分析。MW，分子量。数据以三个独立实验的均值±SD表示。**P < 0.01。尽管HuR主要定位于核内，但在细胞暴露于某些刺激物（如病毒感染[36] [37]）时，它会从核转移到质。鉴于HuR在SVA感染中起关键作用，而SVA感染发生在质内，我们推测HuR会在SVA感染后从核转移到质，从而提高其与病毒RNA的结合能力。这一推测得到了验证，因为在未感染的PK-15和IBRS-2细胞中，HuR主要位于核内，而在SVA感染后，HuR明显从核转移到质，特别是在感染后4和8小时。同样，作为阳性对照的核蛋白U1小核核糖核蛋白A在感染后8小时也转移到质内。相反，作为阴性对照的核蛋白精氨酸/赖氨酸丰富剪切因子1在整个SVA感染过程中保持核定位（图2c）。这些发现表明，HuR的核质转运对于有效的病毒复制是必需的。这种核质转运通过核质分离结合Western blot分析进一步得到验证，结果显示从感染后3小时开始，HuR在质隔室中的积累逐渐增加，其积累量与SVA感染的进展相关（图2d）。因此，这些发现表明SVA感染后，HuR从核显著转移到质。3.3. SVA VP1、2AB和3Cpro协同作用增强HuR在质中的积累为了确定SVA如何调控HuR从核转移到质，我们使用免疫荧光显微镜检查过表达Flag标签病毒蛋白的细胞中HuR的亚细胞分布，发现当细胞异表达VP1、2AB和3Cpro时，HuR显著重新分布到质中。相比之下，在异表达SVA结构蛋白VP0和VP3或其他非结构蛋白的细胞中未检测到HuR分布的显著变化（图3a）。这些观察结果提供了证据，表明病毒蛋白VP1、2AB和3Cpro可能在驱动HuR的核质转运中起作用。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图3. SVA VP1、2AB和3Cpro特异性增加了HuR在细胞质中的含量。(a) 对PK-15细胞中异源表达单个病毒蛋白的HuR亚细胞定位进行共聚焦免疫荧光分析。比例尺，20 μm。(b和c) 对HuR与病毒蛋白VP1（b）和3Cpro（c）之间的相互作用进行共免疫沉淀分析。IP表示免疫沉淀；Abs表示抗体。(d) 病毒2AB表达对内源性Nup62和Nup214降解的影响。随后，我们研究了VP1、2AB和3Cpro如何特异性地提高HuR在细胞质中的含量的潜在机制。我们首先进行了共免疫沉淀实验，以检查HuR与上述三种病毒蛋白之间是否存在物理相互作用。有趣的是，结果表明HuR直接与SVA VP1相互作用（图3b），但与2AB或3Cpro没有相互作用（图3c）。在这方面，我们的研究小组之前已经证明SVA感染可以通过改变核孔复合体（NPC）的结构和功能来破坏核质转运途径，并且SVA 3Cpro可以促进核孔蛋白62（Nup62）和核孔蛋白214（Nup214）的降解[32]。在本研究中，我们发现病毒2AB也触发了Nup62和Nup214的降解，从而导致HuR的核质转运（图3d）。为了进一步确定2AB和3Cpro诱导的Nup62和Nup214降解涉及的途径，我们用特定抑制剂处理表达2AB或3Cpro的HEK293T细胞，这些抑制剂包括自噬抑制剂3-MA、蛋白酶体抑制剂MG132和泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK。初步的细胞活力测试结果证实，在所用浓度下，这些特定抑制剂没有显著的细胞毒性作用（图4a）。随后的分析显示，只有3-MA以剂量依赖的方式抑制了2AB和3Cpro诱导的Nup62和Nup214的降解（图4b, e），而MG132（图4c, f）和Z-VAD-FMK（图4d, g）则没有显著效果。这些结果表明，SVA 2AB和3Cpro通过自噬依赖的途径触发了Nup62和Nup214的降解。下载：下载高分辨率图像（855KB）下载：下载全尺寸图像图4. SVA 2AB和3Cpro通过自噬依赖的途径协同促进Nup62和Nup214的降解。(a) 通过CCK-8实验确定HEK293T细胞在24小时暴露于不同浓度（0.5至1.5 mM）的3-MA、MG132（10至20 μM）或Z-VAD-FMK（10至20 μM）后的细胞活力。(b至d) 3-MA（b）、MG132（c）和Z-VAD-FMK（d）对HEK293T细胞中病毒2AB诱导的Nup62和Nup214降解的影响。(e至g) 3-MA（e）、MG132（f）和Z-VAD-FMK（g）对HEK293T细胞中病毒3Cpro诱导的Nup62和Nup214降解的影响。总的来说，这些发现表明SVA VP1通过与HuR的相互作用特异性促进了HuR向细胞质的重新分布，而2AB和3Cpro则通过自噬依赖的途径降解NPC成分Nup62和Nup214来协同促进HuR的重新分布。

3.4. HuR对SVA IRES驱动的转录有正向调节作用，并间接影响病毒RNA的合成。HuR促进病毒RNA合成和加工依赖于其从细胞核到细胞质的初始转运。为了确定HuR是否对于SVA IRES介导的转录是必需的，我们使用了一个双基因荧光素酶报告系统psiCHECK-SVA来评估SVA IRES的活性（图5a），并发现当HuR异源表达或敲低时，RLuc值（一个指示帽依赖性活性的指标）没有显著变化。相比之下，在异源表达HuR的情况下，我们观察到FLuc活性明显增加，表明SVA IRES介导的转录；而当HuR被耗尽时，活性显著降低，这意味着HuR正向调节SVA IRES驱动的转录（图5b）。同样，通过计算FLuc/RLuc表达比率，我们也评估了其他含有IRES的病毒（包括EV71、PV、FMDV和CSFV）在HuR过表达或敲低后的IRES活性。结果发现，随着HuR表达的上调，IRES活性显著增加了150%–256%，而在HuR敲低后则显著降低至44%–76%（图5c）。这种在多种病毒中观察到的一致模式证明了HuR作为含有IRES元素的微小RNA病毒和黄病毒类的通用转录调节因子。下载：下载高分辨率图像（973KB）下载：下载全尺寸图像图5. HuR正向调节SVA IRES的转录，并间接影响病毒RNA的合成。(a) 包括病毒IRES在内的双基因构建的示意图。(b) HuR过表达和敲低对帽依赖性RLuc活性和SVA IRES驱动的FLuc活性的影响。RLU表示相对光单位。(c) HuR过表达和敲低对EV71、PV、FMDV和CSFV的IRES活性的影响。数据相对于对照组（任意设定为100%）进行了归一化。(d) HuR敲低对总RNA和负链病毒RNA水平的影响。(e) 不同量的非生物素化SVA 5′-UTR（第3-5道）或VP1 RNA（第8-10道）与生物素化SVA 5′-UTR探针竞争结合HuR的情况。第1和6道仅代表细胞裂解物。(f) 从SVA感染的细胞裂解物中 pull-down SVA IRES和3′-UTR与HuR的结合。使用细胞RPS16和GAPDH基因作为对照RNA。数据显示为三次独立实验的平均值±标准差。*P < 0.05, **P < 0.01。在SVA感染期间，病毒基因组RNA同时作为转录和RNA复制过程的模板，导致这两个过程之间紧密相关[41]。因此，我们假设抑制病毒转录将导致病毒RNA积累的减少。与这一假设一致，在HuR表达被敲低后，我们在SVA感染后4–8小时检测到病毒RNA总量和负链RNA的显著减少（图5d）。为了进一步确定HuR是作为病毒RNA合成的直接还是间接调节因子，我们使用蛋白质合成抑制剂CHX来分离转录和复制过程。值得注意的是，当我们在3小时时点抑制病毒转录（此时未检测到病毒复制蛋白或子代RNA的显著差异）时，HuR耗尽后并未观察到病毒RNA合成的显著变化（图5d）。总的来说，这些发现表明HuR对病毒RNA的影响是间接的，可能与HuR耗尽细胞中病毒复制蛋白的积累减少有关。

3.5. HuR的RRM3结构域对于结合IRES和促进病毒IRES驱动的转录至关重要。鉴于HuR在病毒IRES依赖性转录中的关键作用，我们接下来试图确定HuR是否与SVA IRES相互作用。为此，我们使用来自SVA感染细胞的提取物和生物素化的5′-UTR RNA转录本进行了RNA亲和实验。如图5e所示，HuR被生物素化的5′-UTR沉淀下来，而这种相互作用可以被未标记的5′-UTR以剂量依赖的方式竞争性抑制，而VP1 RNA则没有类似的效果。为了确认HuR与病毒基因组RNA之间的双向相互作用是否也在感染细胞中发生，我们从SVA感染的PK-15细胞裂解物中制备样本，并使用抗HuR抗体或对照IgG进行RNA结合蛋白免疫沉淀。随后，从免疫沉淀物中提取的RNA使用针对IRES含有的5′-UTR、3′-UTR、RPS16或GAPDH基因的特异性引物进行RT–PCR分析。结果表明，使用抗HuR抗体进行的免疫沉淀特异性地沉淀了SVA IRES和3′-UTR区域，而没有检测到RPS16或GAPDH mRNA。相比之下，在IgG或无抗体对照组样本中未观察到特定的RT–PCR条带（图5f）。这些发现表明，HuR在细胞内和体外都能特异性结合SVA基因组RNA。HuR具有三个RNA识别基序（RRMs）和一个含有HuR核质穿梭（HNS）结构域的铰链区域[34]、[35]。为了确定这些结构域中哪一个 mediates its binding to the SVA 5′-UTR，我们将编码全长HuR或不同截短版本的HuR与Flag标签融合的质粒转染到PK-15细胞中（图6a），然后使用所得细胞裂解物进行RNA-蛋白质 pull-down 实验。结果表明，生物素化的SVA 5′-UTR捕获了全长HuR以及截短的突变体HuR-RRM3，但没有捕获两种截短突变体HuR-RRM1和HuR-RRM2（图6b），这表明HuR的RRM3结构域在其结合SVA 5′-UTR中起着关键作用。转录本数量以回收到的总mRNA转录本百分比表示，并与分数数作图对比。 (e) 在感染后9小时，使用mock-infected或SVA-infected PK-15细胞的提取物进行HuR的免疫沉淀分析。IP代表免疫沉淀。(f) 使用来自mock-或SVA-infected PK-15细胞的提取物（已去除HuR）来沉淀生物素标记的SVA 5′-UTR。输入样本（第1至4列）用于评估蛋白质丰度。这些相关蛋白质的灰度强度通过ImageJ软件进行分析。为了确定HuR是否作为ITAF与eIFs或40S核糖体亚基共同作用以稳定核糖体与IRES之间的相互作用，我们使用mock-或SVA-infected细胞的裂解物进行了免疫沉淀，并通过Western blotting检测沉淀物中的翻译起始因子。观察结果表明，除了eIF5B外，HuR与大多数评估的eIFs（即eIF2α、eIF3e、eIF3j、eIF4A和eIF4G）特异性共沉淀（图7e）。此外，还发现HuR与40S组分的RACK1和PABP相关联。为了进一步明确HuR在病毒IRES介导的翻译启动中的具体作用，我们进行了生物素标记RNA的沉淀实验，结果发现eIF2α、eIF3e、eIF3j、eIF4A、PABP和RACK1均与生物素标记的SVA IRES结合（图7f）。然而，与免疫沉淀结果一致，未观察到eIF5B的结合，这表明该因子可能不是SVA IRES翻译启动所必需的。重要的是，我们观察到当去除HuR时，这些相互作用显著减弱。因此，这些发现表明为了促进病毒蛋白质的有效合成，HuR对于在SVA IRES上组装翻译起始复合物是必需的。

讨论
翻译调控在病毒-宿主相互作用中起着关键作用。病毒进化出了一系列策略，将宿主核糖体导向病毒mRNA，从而优先合成病毒蛋白质并抑制宿主的先天防御机制[10]、[11]、[12]、[42]。我们之前的研究结果表明，SVA可以通过特异性介导异质核糖核蛋白A2B1 (hnRNPA2B1) 的转移来破坏宿主的翻译机制，不仅选择性地促进病毒IRES介导的翻译，还导致宿主翻译关闭和免疫逃逸[31]。同样，有报道指出SVA通过3Cpro介导切割翻译辅因子poly(A)-结合蛋白cytoplasmic 1来抑制宿主蛋白质合成，从而促进病毒复制[43]。然而，目前SVA IRES介导的病毒-宿主相互作用中涉及的复杂机制尚未完全阐明。在本研究中，HuR被鉴定为一种强有力的ITAF，能够促进SVA IRES驱动的翻译。功能分析显示，病毒蛋白VP1、2AB和3Cpro协同作用，破坏HuR在细胞核与细胞质之间的转移平衡，而细胞质中的HuR通过促进翻译起始复合物在病毒IRES上的组装来特异性促进SVA IRES介导的翻译（图8）。有趣的是，我们还发现HuR是含有IRES的微小RNA病毒和黄病毒翻译的保守决定因子。这些发现，结合之前的报道（指出HuR在HCV、CVB3和EV71的翻译和复制中的作用[36]、[37]、[44]），强调了其作为广谱抗病毒药物治疗目标的潜在价值。

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图8. 假设的HuR介导SVA复制促进模型

越来越多的证据表明，病毒IRES介导的翻译是一种系统性的工程方法，其特征是核糖体亚基、经典eIFs、ITAFs和IRES之间的复杂调控和精确相互作用。例如，为了促进高效的病毒IRES驱动的翻译，微小RNA病毒采用了一系列精巧的策略来操控ITAFs，如触发蛋白水解处理、翻译后修饰和亚细胞重定位[14]、[22]。在本研究中，我们发现SVA上调HuR的表达并促进其向感染细胞质中的转移。机制分析显示，SVA蛋白VP1、2AB和3Cpro可能通过不同的机制在细胞核与细胞质之间协同转移HuR。VP1通过物理相互作用特异性地将HuR重新分配到细胞质中，而2AB和3Cpro似乎通过自噬依赖途径降解Nup62和Nup214，从而导致核仁孔通透性破坏。此前我们已经报道过，ITAF hnRNPA2B1在SVA感染后通过与VP3的相互作用而显著转移到细胞质中[31]。我们还发现了2C和3Cpro介导的RNA结合模式蛋白14的细胞质转移，以及3AB介导的SIN3转录调控因子家族成员A的细胞质转移[32]。总体而言，这些观察结果表明病毒在操控核蛋白运输方面具有机制上的特异性和选择性，以促进高效病毒复制。值得注意的是，HuR的磷酸化/甲基化事件与其细胞质定位和RNA结合亲和力有关[34]、[35]；然而，这些过程对SVA翻译和复制的确切影响仍有待确定。

在病毒IRES介导的翻译初期，ITAFs的基本功能可能涉及与eIFs和40S核糖体亚基的协同作用，以促进核糖体与IRES的结合。在本研究中，我们鉴定出HuR是一种强有力的ITAF，有助于促进SVA IRES驱动的翻译。在HuR的三个RRM中，RRM3对于其与SVA 5′-UTR的相互作用至关重要，并且单独存在就足以支持病毒IRES介导的翻译。与此发现一致，先前的研究表明RRM3是一个多功能结构域，参与HuR寡聚体的形成以及与富含AU元素的RNA分子的结合[45]、[46]。这提供了证据，表明HuR可能在SVA 5′-UTR形成寡聚体复合物，从而促进高效翻译。

此外，我们的研究还发现HuR与43S预启动复合体组分的相互作用对于在SVA IRES上组装翻译起始机制以及在病毒转录本上生成具有翻译活性的核糖体是必不可少的。这些发现支持了一个假设模型，即HuR通过与其他RNA和RBPs的协同结合来调控最佳的IRES结构，并促进内部核糖体的进入。然而，进一步的机制研究将有必要完全揭示HuR在促进病毒IRES驱动的翻译中的调控框架。

结论
在本研究中，我们鉴定出HuR是一种强有力的IRES作用因子，能够增强SVA IRES驱动的翻译。功能分析显示，SVA的VP1、2AB和3Cpro蛋白通过不同的机制协同作用来促进HuR在细胞核与细胞质之间的转移，其中VP1通过物理相互作用特异性地将HuR重新分配到细胞质中，而2AB和3Cpro通过自噬依赖途径降解Nup62和Nup214，导致核仁孔通透性破坏。细胞质中的HuR通过促进翻译起始复合物在病毒IRES上的组装来特异性促进病毒IRES介导的翻译。有趣的是，HuR似乎也是含有IRES的微小RNA病毒和黄病毒翻译的保守决定因子。总体而言，我们的发现揭示了HuR在微小RNA病毒和黄病毒中启动IRES驱动的翻译中的先前未定义的作用，从而强调了其作为广谱抗病毒治疗目标的潜在价值。

作者贡献声明：
- Bo Wan：可视化、验证、资源准备。
- Shichong Han：撰写-审阅与编辑、撰写-初稿、监督、项目管理和资金获取、概念构思。
- Linru Zhang：撰写-初稿、方法学、实验研究、数据分析、数据管理。
- Gaiping Zhang：撰写-审阅与编辑、资金获取、概念构思。
- Haocheng Wan：方法学、实验研究、数据分析、数据管理。
- Mingyang Li：软件应用、方法学、实验研究、数据分析、数据管理、撰写-审阅与编辑。
- Yan Shi：数据分析。
- Menghan Zhou：方法学、实验研究、数据分析。
- Man Hu：方法学、实验研究。
- Xinwei Li：数据分析。
- Wenrui He：可视化、验证、资源准备。
- Yuhang Zhang：方法学、实验研究。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。