鉴定来自Plasmodiophora brassicae的疑似二硫化物异构酶效应子的宿主靶标，揭示了根肿病发病机制的新机制

《Agriculture Communications》：Identification of host targets for putative disulfide isomerase effector from Plasmodiophora brassicae reveals novel mechanisms of clubroot pathogenesis

　　张志军|王丹|苏同冰|Niaz Ahmed Wahocho|王伟红|辛晓云|张斌|赵秀云|张德双|于杨军|张凤兰|李培荣|余双沧
北京蔬菜研究所，北京农业科学院，北京，100097，中国

**摘要**
病原体分泌的效应蛋白在抑制宿主免疫和促进感染中起着关键作用。在这项研究中，我们从根肿病病原体Plasmodiophora brassicae中鉴定并表征了一种假定的二硫键异构酶效应蛋白Pb001683，这种病原体对十字花科作物构成了重大威胁。过表达Pb001683的转基因植物表现出对P. brassicae的敏感性增加，这支持了其在致病性中的作用。亚细胞定位分析显示Pb001683定位于宿主细胞的内质网（ER）和细胞核中。共免疫沉淀结合质谱（CoIP-MS）分析鉴定了353种与Pb001683相关的候选宿主蛋白，表明其可能具有广泛的宿主靶标网络。基因本体论（GO）富集分析表明这些蛋白参与羧酸代谢过程和氧酸代谢过程。通过裂解荧光素酶试验进一步验证了Pb001683与BrCYP83A1之间的相互作用。此外，活性氧（ROS）测定显示过表达Pb001683的植物比对照植物具有更高的ROS水平。总体而言，这些发现为根肿病发病机制提供了新的见解，并强调了通过靶向效应蛋白-宿主相互作用来增强作物抗性的潜在策略。

**1. 引言**
根肿病是一种全球普遍存在的土传疾病，由专性生物寄生菌Plasmodiophora brassicae引起，该菌属于Rhizaria类群[1]。感染根部后，P. brassicae会引发特征性的根瘤形成，导致根部显著肥大。这种异常增大会干扰植物吸收水分和养分的能力，从而导致生长受阻、叶片黄化和地上组织过早衰老[2]。这导致产量和质量显著下降，全球损失估计在10%到15%之间，从而影响农业生产力和经济可持续性[3],[4]。

植物具有先天免疫系统，包括病原相关分子模式（PAMP）触发的免疫（PTI）和效应蛋白触发的免疫（ETI）。当细胞表面模式识别受体（PRRs），如受体样激酶（RLKs）和受体样蛋白（RLPs）识别PAMPs时，PTI被激活。这些PRRs在早期病原体检测和免疫激活中起着关键作用，提供重要的第一道防线[5]。研究表明，野生物种Hirschfeldia incana可能是多种病害抗性基因R的潜在来源。基于其含有抗性基因类似物（RGA）结构域的克隆病害抗性基因同源物（CDRHs），它可能是对霜霉病、核盘菌茎腐病、白锈病、镰刀菌萎蔫病和黑胫病的抗性来源[6]。在根肿病抗性方面，已在芸苔属基因组中分离出两个抗性基因（A08染色体上的Crr1a和A03染色体上的Cra）。这两个基因编码TIR-NLR蛋白，能抵抗特定类型的P. brassicae，突显了它们在靶向病害管理中的潜力[7],[8],[9]。然而，这种病原体特异性限制了它们在田间的持久性。因此，研究参与病原体致病性的效应蛋白和植物抗性是至关重要的。

像P. brassicae这样的真核生物寄生菌通过修改宿主的形态或生理机能来部署效应蛋白，从而抑制宿主免疫并促进感染[10],[11],[12]。值得注意的是，P. brassicae中近一半的预测蛋白在其他物种中没有同源物和可识别的功能结构域，它们的功能尚不明确[1],[13],[14]。此外，与其它真核生物类群相比，包含plasmodiophorids的Rhizaria类群的基因组资源仍然有限，这突显了进行功能分析以阐明P. brassicae及其效应蛋白生物学的必要性[15],[16]。近期在基因组和转录组技术方面的进展有助于鉴定P. brassicae中的候选效应蛋白[1],[13],[17],[18],[19],[20],[21],[22]。利用第三代纳米孔测序（ONT），研究人员最近组装了一种广泛分布的P. brassicae病原体的基因组，鉴定出效应蛋白候选物如Pb010018并评估了它们的功能[23]。其中一种效应蛋白SSPbP53是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，被发现能与类似木瓜酶的半胱氨酸蛋白酶XCP1相互作用，在病害进展中起关键作用[24]。这些发现强调了基因组和转录组方法在推进病原体毒力机制理解和确定病害管理潜在靶标方面的价值。为了更好地理解P. brassicae的致病机制，有必要进一步研究其候选效应蛋白的作用和分子机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 根肿病材料及植物接种
从中国湖北省长阳县霍山乡一块田地里采集的受感染的 Chinese cabbage 根部分离出休眠孢子。根据既定标准，该病原体被鉴定为生理小种4[30],[31]。休眠孢子悬浮液浓度为1 × 10^7孢子/mL，每株植物施加1 mL悬浮液于拟南芥（Arabidopsis thaliana）根部周围的土壤中。每种处理包括三个独立的生物学重复实验，每个重复实验至少有15株植物。接种后21天（dpi）使用Williams分类系统评估病害严重程度[32]。

2.2. 植物生长条件
拟南芥（A. thaliana）和本氏烟（Nicotiana benthamiana）在受控温室环境中生长，光照/黑暗周期为12小时/12小时，温度为23°C，相对湿度为60%。

2.3. 使用酵母分泌系统验证信号肽（SP）
为了验证Pb001683的预测SP，我们采用了之前描述的方法[33]。将Pb001683的SP序列通过EcoRI和XhoI限制位点连接到pSUC2载体中的酵母 invertase 基因上。重组质粒转入酵母菌株YTK12，并接种到CMD-W培养基（含有0.67%不含氨基酸的酵母氮源、0.075%色氨酸缺失补充剂、2%蔗糖、0.1%葡萄糖和2%琼脂）上。随后将阳性菌落转移到YPRAA培养基中，其中含有1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%乳糖和2 μg/mL抗菌素A。通过PCR和2,3,5-三苯四唑（TTC；Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）测定确认了invertase的分泌活性，方法参照之前的描述[34]。TTC测定中观察到的颜色变化作为酶活性的指标。

2.4. 亚细胞定位
将Pb001683的全长cDNA亚克隆到pCAMBIA2300载体中，然后将重组质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株中。内质网（ER）标记载体HDEL-mCherry和核标记载体NLS-mCherry也被引入GV3101菌株中。使用共聚焦激光扫描显微镜（Nexcope NCS系列，Nexcope，中国宁波）观察荧光信号。在LB培养基中添加卡那霉素和利福平，于28°C和220 rpm条件下培养根癌农杆菌20小时。细菌悬浮液以5000 rpm离心10分钟，然后重新悬浮在浸润缓冲液（0.2 M 2- morpholinoethanesulfonic acid，pH 5.6；1 M MgCl2；100 mM acetosyringone）中，并调整至OD600为1.0。携带Pb001683-GFP的根癌农杆菌与携带HDEL-mCherry和NLS-mCherry的根癌农杆菌以等体积混合（1:1），然后浸润到本氏烟叶的背侧。加入等量的P19悬浮液以抑制基因沉默。细菌混合物在室温下孵育2-3小时后浸润到本氏烟叶中。浸润后48小时检测荧光信号。

2.5. 裂解荧光素酶互补试验
裂解荧光素酶试验按照之前的研究协议[35]进行。Pb001683和BrCYP83A1的全长序列分别克隆到pCAMBIA-Nluc或pCAMBIA-Cluc载体中。将这些构建体导入根癌农杆菌GV3101中，然后将得到的悬浮液共浸润到本氏烟叶中。浸润后，叶子孵育3天，再用Beetle Luciferin（Promega，美国麦迪逊）喷洒，并在黑暗中放置5分钟以促进荧光检测。使用Vilber Fusion-FX7成像系统（Marne-la-Vallée Cedex 3，法国）捕获荧光信号，曝光时间为3-5分钟。

2.6. 共免疫沉淀结合质谱（CoIP-MS）测定
使用anti-FLAG抗体进行CoIP-MS测定。免疫沉淀的蛋白质进行质谱分析。正常免疫球蛋白G（IgG）作为阴性对照。Pb001683-GFP融合蛋白通过根癌农杆菌介导的转化在转基因拟南芥植物中表达。将转基因叶片在液氮中研磨成细粉，并在500 μL蛋白提取缓冲液（Conway Century，北京）中匀浆。裂解液在冰上孵育30分钟后，以12,000 rpm离心10分钟，然后在4°C下与anti-GFP单克隆抗体偶联的琼脂糖珠（MBL，日本东京）孵育过夜。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次后，洗脱结合的蛋白质，通过SDS-PAGE分离，并用Coomassie Brilliant Blue染色显色。提取特定的蛋白质条带，并通过武汉博远生物科技有限公司进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析。使用Cytoscape（v3.9.1）构建并可视化蛋白质相互作用网络。

2.7. 活性氧（ROS）检测
从5周大的拟南芥叶片中切取直径4毫米的叶片圆片，在蒸馏水中过夜培养。去除多余水分后，将圆片浸入荧光检测缓冲液（0.02 mM luminol，10 μg/mL chitin，和20 μg/mL horseradish peroxidase；均来自Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）中，置于96孔板中。使用TECAN Infinite F200微孔板读取器（TECAN，瑞士M?nnedorf）在490 nm激发下，535 nm处测量荧光，持续20分钟。

2.8. 使用RT-qPCR的转录组分析
根据制造商的说明，使用RNAprep Pure Plant Plus试剂盒（TIANGEN，北京）从受感染根部组织中提取总RNA。通过HiScript III RT SuperMix试剂盒（Vazyme Biotech Co., Ltd., 南京）进行逆转录合成cDNA。使用基因特异性引物进行逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）。为了量化P. brassicae的生物量，使用了三个独立的引物对，分别针对不同的P. brassicae基因：Pb00454（Pb00454-F: GTTGCACGAGTACCTTGTCGTTGGG；Pb00454-R: GACAGGAAGTACCAGAAACGGGAGC）、PbTest1（PbTest1-F: GCCTACAGGAGCTGGTCCTTCC；PbTest1-R: CCTTGTCCGTTGTTACCATACCC）和PbActin（PbActin-RT-F: CACCGACTACCTGATGAA；PbActin-RT-R: CAGCTTCTCCTTGATGTC）。P. brassicae的相对丰度以拟南芥ACTIN基因（At-ACTIN-F: GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG；At-ACTIN-R: AACGACCTTAATCTTCATGCTGC）为基准进行归一化。每个实验包括三个生物学重复。

**3. 结果**
**3.1. P. brassicae Pb001683 SP的功能验证**
预测了P. brassicae的SP，其氨基酸1-21被鉴定为假定的SP（图1a）。结构建模进一步表明Pb001683采用全β构象（图1b）。为了实验验证SP的功能，进行了酵母分泌试验。携带预测SP的融合构建体使酵母能够在乳糖培养基上生长，符合分泌功能，而阴性对照则不能支持生长。实验结果显示，表达Pb001683 SP或Avr1b SP的酵母细胞在CMD-W（对照）和YPRAA（选择）培养基上都能快速生长，证实了分泌活性（图1c）。相比之下，表达Mg87或空pSUC2载体的酵母细胞在YPRAA培养基上无法增殖，证明了试验的特异性。在这一试验中，功能性SP活性刺激了invertase的分泌，将2,3,5-TTC转化为不溶性的红色1,3,5-三苯甲酰斐林（TPF）。表达Pb001683 SP或Avr1b SP的酵母细胞显示出明显的红色，而表达Mg87或空载体的酵母细胞没有颜色变化（图1d）。**P. brassicae效应蛋白Pb001683的鉴定和功能验证**

(a) 使用SignalP 5.0预测Pb001683中的分泌性SP，突出显示了第1-21位氨基酸。

(b) Pb001683蛋白的结构模型，由SWISS-MODEL生成，显示出全β折叠结构。

(c) 在酵母中验证Pb001683 SP的功能。携带Pb001683 SP、Avr1b SP（阳性对照）、Mg87（阴性对照）或空载载体（阴性对照）的重组pSUC2质粒被转入酵母菌株YTK12中。在CMD-W（对照）和YPRAA（选择）培养基上评估生长情况。仅表达Pb001683 SP和Avr1b SP的酵母在YPRAA培养基上生长。

(d) 使用TTC还原试验检测 invertase的分泌活性。表达Pb001683 SP或Avr1b SP的酵母将TTC还原为不溶性的红色TFP，而Mg87和空载载体对照组则没有这种活性。

(e) 通过农杆菌介导的短暂表达在N. benthamiana中研究P. brassicae Pb001683的亚细胞定位。绿色荧光表示Pb001683蛋白，红色荧光对应于内质网标记HDEL-mCherry和核标记NLS-mCherry。绿色和红色信号的共定位证实Pb001683蛋白同时位于内质网和细胞核中。

我们构建了一个带有GFP标签的Pb001683载体，并通过农杆菌介导的转化将其短暂导入N. benthamiana中。共聚焦激光扫描显微镜显示Pb001683蛋白定位于内质网和细胞核中（图1e）。

**3.2 Pb001683过表达增强了转基因拟南芥（A. thaliana）对P. brassicae的敏感性**

为了评估Pb001683在根肿病发生中的作用，将野生型（Col-0）和Pb001683转基因植株接种P. brassicae，并在21天后评估病害症状。接种后的Col-0植株的根出现明显的水肿，这是根肿病的特征（图2a）。此外，受感染的Col-0植株的叶片出现紫色变色（图2b）。

**3.3 在植物中鉴定与宿主相互作用的蛋白**

在转基因拟南芥（A. thaliana）中进行CoIP-MS分析。目标蛋白在输入样品中的存在及其在IP馏分中的富集，以及在IgG对照中的缺失，证实了免疫沉淀的成功（图3a）。

**3.4 感染P. brassicae的拟南芥（A. thaliana）中DEPs的蛋白相互作用网络和富集分析**

为了进一步表征通过CoIP-MS鉴定的蛋白，选择了在处理组（效应蛋白特异性抗体IP，记为1683IP）和对照组（IgG对照抗体IP，记为1683IgG）中表达量增加的353个蛋白，构建了蛋白相互作用网络。基于基因本体论（GO）的分类显示这些蛋白参与了多种细胞成分、生物过程和分子功能（图4a）。

**3.5 效应蛋白Pb001683与宿主蛋白的相互作用**

为了探索分泌蛋白抑制宿主防御的分子机制，我们使用CoIP-MS筛选了与Pb001683相互作用的宿主蛋白。在候选蛋白质中，鉴定出Ubiquinol氧化酶1a (AOX1A)、富含亮氨酸重复序列（LRR）的蛋白质、吲哚葡萄糖苷O-甲基转移酶4 (IGMT4)和细胞色素P450 83A1 (CYP83A1)作为关键相互作用蛋白。通过裂解荧光素酶互补测定验证了这些相互作用。Pb001683与BrCYP83A1之间的相互作用得到证实，因为Pb001683-Nluc和BrCYP83A1-Cluc的共表达恢复了荧光素酶活性（图5a）。最终，将这些分子见解整合到育种计划中，可能会为培育出对根肿病具有持久抗性的作物铺平道路。5. 结论 总之，我们证明了芥菜假单胞菌（P. brassicae）的效应蛋白Pb001683是一种分泌蛋白，它会增强拟南芥（A. thaliana）对病原体的易感性。蛋白质组学分析确定了353种与Pb001683相互作用的宿主蛋白，并进一步验证了其与BrCYP83A1的相互作用。功能实验表明，Pb001683的表达会导致活性氧（ROS）的积累增加，这表明其在调节宿主免疫信号传导中发挥作用。综上所述，这些发现为理解芥菜假单胞菌的致病机制提供了新的见解，并突显了Pb001683作为提高十字花科作物抗病性的潜在目标的重要性。

作者贡献声明：
张德双：数据验证
于阳军：研究指导
张斌：方法学设计
赵秀云：资源提供
于栓仓：研究指导与概念构思
王丹：软件开发
苏同兵：资金筹集
张凤兰：文章撰写、审稿与编辑
李佩荣：文章撰写、审稿与编辑、研究指导及资金筹集
张志军：文章初稿撰写
辛晓云：数据管理
Niaz Ahmed Wahocho：文章撰写、审稿与编辑
王伟宏：资源提供

数据获取
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取，具体申请方式将另行通知。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系，这些因素可能影响到本文报告的研究结果。