《ACS Chemical Biology》：Site-Specific Immobilization of ZNRF3 Reveals the Importance of Target Structural Integrity on Macrocyclic Peptide Selections
编辑推荐：
噬菌体展示的大环肽文库已被证明是配体发现的高效手段，然而靶标固定方式及其结构完整性对筛选结果的影响尚未得到系统研究。以ZNRF3胞外域为模型，研究人员在三个具有不同溶剂暴露程度的苯丙氨酸残基（F217、F85、F156）上引入p-叠氮苯丙氨酸（AzF），从而通
噬菌体展示的大环肽文库已被证明是配体发现的高效手段，然而靶标固定方式及其结构完整性对筛选结果的影响尚未得到系统研究。以ZNRF3胞外域为模型，研究人员在三个具有不同溶剂暴露程度的苯丙氨酸残基（F217、F85、F156）上引入p-叠氮苯丙氨酸（AzF），从而通过位点特异性应变促进叠氮?炔环加成（SPAAC）固定实现对蛋白质结构的可控扰动。突变体的生化评估证实了高效的偶联效率和蛋白质的结构扰动，其中F156AzF突变体的活性降低最为显著。使用CX12C大环肽文库进行的噬菌体筛选表明，富集效率和序列多样性与结构保持程度相关：F217AzF和F85AzF产生了稳健且重叠的肽段库，而F156AzF仅产生少量且富集程度有限的序列。对高亲和力肽段的生物物理表征显示，来自结构完整固定方式的肽段最可能与野生型ZNRF3结合，其中亲和力最高的配体85?2（KD= 124 nM）来自共享肽库。本工作报道了一种在噬菌体筛选中选择性破坏蛋白质结构域的技术，同时证明了固定靶标的结构完整性是噬菌体展示成功的主要因素。维持结构完整性不仅影响肽段对天然靶标的序列组成和亲和力，也影响筛选本身的整体富集效率。虽然破坏性固定仍可能得到有用的配体，但保持天然构象的策略能够增强噬菌体富集并最大程度地识别具有生物学相关性的结合剂。
一、研究背景与问题
噬菌体展示技术是发现针对困难蛋白质靶点的高亲和力配体的重要平台，尤其在大环肽文库的筛选方面已取得显著成果。然而，在筛选流程的最初步骤——蛋白质靶标在固相载体上的固定方法——对后续筛选结果的影响尚未被系统评估。传统固定策略（如免疫捕获、生物素?链霉亲和素捕获、直接共价偶联等）均存在局限：免疫捕获和生物素?链霉亲和素捕获中使用的包被蛋白（如抗体、链霉亲和素）本身可能成为脱靶结合源，导致假阳性；而非位点特异性的赖氨酸生物素化或直接共价偶联可能破坏蛋白质的三级结构，尤其是当关键赖氨酸参与盐桥或配体结合时。这些固定方式本质上是“结构盲”的，可能扭曲蛋白质表位或将靶标固定于非天然构象，从而降低所筛选肽段识别天然状态蛋白质的可能性。因此，在噬菌体展示中，靶标蛋白质的结构完整性是一个重要但未被量化研究的问题。
针对这一空白，本研究选择ZNRF3（一种跨膜E3连接酶）的胞外域（ectodomain）作为模型靶标，探究靶标结构完整性对噬菌体展示筛选大环肽配体的影响。ZNRF3胞外域可结合R?spondin，其胞内RING结构域可泛素化Frizzled和LRP5/6受体，该拓扑结构使其成为基于抗体的蛋白降解靶向嵌合体（AbTACs）的理想可募集连接酶。先前研究已成功利用该结构域筛选到结合ZNRF3的大环肽配体，这为本研究提供了良好的模型基础。
二、关键技术方法
研究人员采用位点特异性非天然氨基酸掺入技术，在ZNRF3胞外域的三个苯丙氨酸残基（F217、F85、F156）处引入p?叠氮苯丙氨酸（AzF），利用其与DBCO（二苯并环辛炔）功能化磁珠进行铜催化无关的应变促进叠氮?炔环加成（SPAAC）反应，实现靶标的位点特异性固定。这三个位点根据其溶剂可及性进行选择：F217位于柔性loop区完全暴露，F85部分溶剂暴露但其侧链埋藏并与其他残基相互作用，F156则完全埋藏在蛋白质折叠核心内部。通过该策略，可对蛋白质结构进行不同程度的可控扰动。随后，使用CX12C二硫键环化噬菌体展示文库，分别针对这三个AzF突变体进行三轮独立的噬菌体筛选（生物淘选），每轮均包含负筛选步骤以去除非特异性结合噬菌体。筛选后的肽段库通过下一代测序（NGS）进行序列分析，并通过生物层干涉术（BLI）对代表性合成肽段进行结合亲和力测定。
三、研究结果
1. 突变体ZNRF3胞外域蛋白的制备与验证
通过琥珀密码子（UAG）突变在三个位点引入AzF，经高分辨质谱（HRMS）确认AzF的成功掺入。荧光标记和结合实验表明，不同突变体与DBCO的偶联效率及与R?spondin 2（RSPO?2）的结合亲和力存在差异：F217AzF与野生型（WT）结合亲和力相当（KD约42 nM），而F85AzF和F156AzF的结合亲和力分别下降约7倍和9倍。圆二色光谱显示各突变体整体二级结构得以保持，但F156AzF在β?sheet核心区有轻微扰动。这些数据证实了通过位点特异性AzF掺入可实现可控的结构扰动，且扰动程度与位点的埋藏深度相关。
2. ZNRF3突变体的噬菌体生物淘选
SPAAC固定效率检测证实所有AzF突变体在DBCO磁珠上的负载量均显著高于野生型对照。噬菌体筛选结果显示，富集效率和序列多样性与靶标结构完整性密切相关：F217AzF和F85AzF产生了大量高丰度序列（分别有45和27个序列丰度>0.1%），且两者序列重叠度高；而结构完整性最差的F156AzF仅产生4个丰度>0.1%的序列，且与另外两个突变体的序列重叠度很低。作为对照，通过NHS（N?羟基琥珀酰亚胺）活化磁珠对野生型ZNRF3进行非位点特异性赖氨酸偶联的筛选结果与F156AzF类似，呈现低富集、序列分散的特征。这表明靶标结构完整性或固定方式的结构破坏性会显著影响噬菌体筛选的富集效果。
3. 结合ZNRF3的肽段表征
对筛选得到的肽段进行结合验证发现，来自结构相对完整的F217AzF和F85AzF突变体的肽段更可能结合野生型ZNRF3（例如，在各自top 5序列中分别有3/5和2/5显示可测亲和力），而来自F156AzF的top 5序列中仅1/5显示结合。进一步，从不同重叠类别中选取高丰度肽段进行BLI测定，结果显示：所有三个突变体共有的序列类别中，虽然包含了最高亲和力的配体85?2（KD= 124 nM），但也存在非特异性结合序列；而仅由两个突变体共享的序列类别中，结合肽段的比例更高（9/12）。这些数据表明，靶标结构完整性较高的筛选更可能产出具有功能性的结合肽段，但序列丰度与结合活性之间并非简单线性关系，需通过结合实验验证。
四、讨论与结论
综合以上结果，本研究的并排筛选证明靶标结构完整性是噬菌体展示成功与否的关键决定因素之一。在完全埋藏的F156位点进行特异性偶联所产生的、能识别天然ZNRF3折叠的功能性大环肽数量，显著少于在溶剂暴露的F217或部分暴露的F85位点的偶联，后两者更好地保持了蛋白质折叠核心。靶标的结构破坏会负面影响噬菌体展示，并大幅降低富集功能性配体的概率。尽管如此，即使是从高度扰动的F156AzF变体中也能发现少量强效结合剂，这表明严重的固定伪影并不会完全消除、但会显著降低发现功能性配体的机会。因此，本研究的实用启示有二：最优策略是选择能保持天然结构的固定方法，而位点特异性修饰策略允许对结构扰动进行精确评估；当此类策略不可用时，更具破坏性的方法仍可能产生有用命中，但需进行严谨的下游验证并相应调整对命中频率的预期。这一结论与抗体发现中的长期实践相呼应：基于肽段的免疫原通常是非结构化的，因此与其亲本蛋白质在结构上解偶联，往往需要大量筛选才能找到识别全长抗原的抗体。同样，基于蛋白质片段的噬菌体筛选应谨慎使用，因为这类似于F156AzF的情景——仅凭序列同一性并不能保证结构保真度，且代价是真正功能性配体的产出率较低。
虽然本研究以ZNRF3胞外域为模型系统，但“固定靶标的结构完整性可作为富集效率和下游结合剂相关性的主要决定因素”这一核心观点，预期可推广至其他蛋白质类别，其中固定过程可能影响取向、表面可及性和构象稳定性。在实际应用中，其他靶标特异性因素（如蛋白质大小、内在折叠稳定性、表面电荷分布等）也可能调节固定伪影的严重程度。未来应用此策略时，可结合正交稳定性读数，并选择扰动最小、同时能控制取向的固定位点和化学方法。
本文发表于《ACS Chemical Biology》。
