天然肽的酶促溴化用于通过Suzuki–Miyaura偶联进行后期结构多样化

《ACS Chemical Biology》：Enzymatic Bromination of Native Peptides for Late-Stage Structural Diversification via Suzuki–Miyaura Coupling

　　

： 黄素依赖性卤化酶 (FDHs) 为芳香族化合物的位点选择性卤化提供了一种生物催化方法，但其在肽的后期功能化中的应用仍然有限。本文研究表明，原本针对更大小分子骨架优化的色氨酸 (Trp) 7-卤化酶 RebH 及其工程化变体 4V，能够在广泛的序列和位置背景下溴化肽基-Trp残基。通过对不同底物序列的广泛分析，研究人员定义了实现 RebH 活性的特征，并揭示了 4V 扩大的序列耐受性。研究人员应用 4V 对多种生物活性肽骨架（包括抗菌肽、细胞穿透肽和G蛋白偶联受体激动剂）进行酶促溴化，无需进行序列修饰。这些溴化肽可作为 Suzuki–Miyaura 偶联的底物，从而能够安装赋予新功能特性或调节这些肽生物活性的修饰。研究结果扩展了 FDHs 的底物范围，并将溴化启用的交叉偶联确立为生物活性肽后期多样化的一种通用方法。

论文解读文章

研究背景与意义

蛋白质和肽的残基特异性修饰在化学和生物学中具有广泛应用，包括共价抑制剂、功能探针、抗体-药物偶联物和化学蛋白质组学工具的开发。其中，色氨酸 (Trp) 因其独特的反应性、在蛋白质组中相对稀有以及存在于许多生物活性肽类中，成为选择性修饰的一个有吸引力的靶点。然而，在未受保护的肽和蛋白质中选择性修饰 Trp 仍然具有挑战性。大多数针对 Trp 的化学修饰方法依赖于其亲核性，并存在与半胱氨酸 (Cys)、组氨酸 (His) 和/或酪氨酸 (Tyr) 的交叉反应性问题。目前的策略在引入用于形成C-C、C-N和C-O键的通用合成手柄（如芳基卤化物）方面存在关键局限，而这些手柄能够实现模块化的下游功能化。特别是芳基溴化物和芳基碘化物，是通过钯 (Pd) 催化交叉偶联进行后期结构多样化的有吸引力的中间体，这在药物化学和生物偶联中是一个强大且广泛使用的平台。

酶促卤化，特别是黄素依赖性卤化酶 (FDHs) 催化的卤化，提供了一种在温和、水相条件下生成芳基卤化物作为交叉偶联底物的补充策略。虽然已发现许多可卤化游离 Trp 的 FDHs，但其中只有一部分能够修饰肽中的 Trp 残基，通常需要 Trp 位于末端之一或在存在能够实现底物识别的引导序列的情况下。近期鉴定的来自 chlorolassin 生物合成基因簇的肽 FDH (ChlH) 通过卤化不同肽底物中的内部 Trp 残基扩展了此范围。然而，ChlH 对氯化高度特异，不能有效催化溴化或碘化，这限制了其安装芳基溴化物或芳基碘化物作为结构多样化合成手柄的实用性。

为了扩展 FDHs 的合成潜力，已应用定向进化和基因组挖掘方法来鉴定具有理想特性的生物催化剂。其中，色氨酸 7-卤化酶 RebH 已被广泛改造以改善其热稳定性、改变其区域选择性，并将其底物范围扩展到包括 Trp 类似物、更大的芳香族骨架以及药物发现中使用的芳香族片段化合物。然而，大多数工程努力都集中在小的有机分子上，而 RebH 变体作用于肽的能力仍未得到充分探索。本研究旨在评估 RebH 及其变体 4V 在肽底物上的卤化能力，并将其与 Suzuki–Miyaura 交叉偶联结合，开发一种用于含 Trp 生物活性肽后期结构多样化的通用化学酶促方法。该研究发表在《ACS Chemical Biology》上，有望扩展 FDHs 的应用边界，为肽类药物和探针的合成提供新工具。

关键技术方法概述

本研究主要运用了以下关键技术方法：首先，研究人员利用基于液相色谱-高分辨率质谱 (LC-HRMS) 的筛选平台，系统评估了野生型 RebH 及其工程变体 4V 对不同长度、序列和 Trp 位置的一系列模型肽底物的溴化活性。其次，通过合成包含 38 种二肽和 98 种三肽的肽库，进行了大规模的序列耐受性筛选，以确定影响酶活性的肽序列和结构特征。第三，运用柔性肽对接 (FlexPepDock) 等计算方法，结合 RebH 的晶体结构，对肽底物与酶的相互作用进行建模分析。最后，建立了化学酶促偶联流程：先利用 4V 对多种未经修饰的生物活性肽（如抗菌肽 (RW)₃、细胞穿透肽 Transportan 和 μ-阿片受体激动剂内吗啡肽-1）进行酶促溴化，随后对溴化产物进行 Suzuki–Miyaura 交叉偶联反应，引入不同的芳基基团。产物的结构与活性分别通过核磁共振 (NMR)、质谱以及针对抗菌活性、细胞摄取和受体激动活性的生物学功能测定进行验证。

研究结果

RebH 和 4V 在肽底物上具有稳健的溴化活性

研究人员首先测试了 RebH 和 4V 对一系列在 N 端、C 端或中间位置含有 Trp 的模型肽的溴化能力。出乎意料的是，研究发现无论是 RebH 还是 4V 对所有测试的肽都具有显著的活性，并保持了 C7 位点的选择性。当 Trp 位于 C 端时，两种酶都表现出较高的转化率，而 4V 在某些短肽上表现出更高的二溴化倾向。当 Trp 位于 N 端时，整体活性较低。对于中心含有 Trp 的肽，两种酶均能高效地实现单溴化。通过柔性肽对接模拟，研究人员提出当肽链延伸超过一定长度（如 N 端延伸超过4个或 C 端延伸超过3个残基）时，额外的残基会突出于活性位点之外，不再影响酶活性。这些结果表明，RebH 和 4V 具备在多种肽底物，包括非末端 Trp 上进行溴化的能力。

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底物肽序列和结构特征对 RebH 和 4V 活性的影响

为了深入探究肽序列对酶活性的影响，研究人员合成了包含所有 20 种标准氨基酸（除自身外）与 Trp 组成的二肽库以及 98 种三肽库进行系统筛选。结果显示，对于 N 端 Trp 二肽，RebH 的活性范围较窄，主要偏好 C 端为小亲水侧链的序列；而 4V 则表现出更广泛的序列耐受性。对于 C 端 Trp 二肽，RebH 和 4V 的活性普遍更高，4V 同样展现出更优的活性。在三肽筛选中，研究人员发现酶活性受到 Trp 位置、邻近残基性质以及 C 末端官能团（羧酸盐或羧酰胺）的显著影响。例如，4V 普遍更偏好 C 端为羧酰胺的肽，这可能与其活性位点中 N467T 和 N470S 突变改变了氢键特性有关。这些数据全面定义了 RebH 和 4V 的序列偏好，为预测和应用其活性提供了依据。

4V 催化未修饰生物活性肽的后期溴化

基于在模型肽上观察到的广泛活性，研究人员进一步评估了 4V 对 7 种更复杂的、未经任何序列重设或修饰的商业化生物活性肽的溴化能力。这些肽包括 GPCR 配体、细胞穿透肽和抗菌肽，长度在 4 到 30 个氨基酸之间，含有 1 个或多个 Trp。尽管这些底物更具挑战性，4V 对所有测试的肽都表现出活性，单溴化产物的转化率在 8% 到 38% 之间。活性高低与模型肽筛选中确定的有利序列 motif 相关，例如 (RW)₃因含有 RW/WR motif 而转化率最高。对含有多个 Trp 的 (RW)₃的胰蛋白酶消化分析表明，4V 的溴化具有位点选择性，主要发生在 C 端的 Trp 上。这证明了 4V 能够对具有天然序列的生物活性肽进行位点选择性后期修饰。

4V 实现对抗菌肽的后期多样化以调节其活性

研究人员以抗菌肽 (RW)₃为例，展示了 4V 催化溴化结合 Suzuki–Miyaura 偶联用于肽结构多样化的完整流程。他们合成了单溴化的 (RW)₃及其与 3-三氟甲基苯基硼酸偶联的衍生物。抗菌活性测定表明，溴化使 (RW)₃对大肠杆菌的最小抑菌浓度 (MIC)、最小杀菌浓度 (MBC) 和半数抑制浓度 (IC₅₀) 降低了约 4 倍。进一步引入 3-三氟甲基苯基后，活性得到更大幅提升（IC₅₀降低约 23 倍）。类似地，(RW)₄溴化后抗菌活性也提高了约 2 倍。这些结果证明了该策略能够有效调节生物活性肽的功能。

4V 催化的肽功能化用于生成细胞肽摄取的荧光探针

研究人员将该策略应用于细胞穿透肽 Transportan。他们通过 4V 溴化其 Trp 2 位点，再与萘-1-硼酸进行 Suzuki–Miyaura 偶联，合成了萘基修饰的 Transportan (Nap-TN)。该修饰引入了基于萘-Trp 的荧光团，且不改变肽的净电荷。细胞成像实验显示，Nap-TN 能够有效被人骨肉瘤细胞摄取，并在细胞核中积累荧光信号，而游离的荧光团或未修饰的 Transportan 则无此现象。这表明该策略可以在不损害 CPP 功能的前提下，将其转化为成像探针。

4V 催化的 μ 阿片受体激动剂多样化以调节其活性

最后，研究人员将该策略应用于内源性阿片肽内吗啡肽-1，一个 μ 阿片受体激动剂。他们通过 4V 溴化其 Trp 3 位点，并与一系列芳基硼酸偶联，制备了 6 种 L 型 Trp 的衍生物。同时，利用 4V 也能作用于 D 型 Trp 的特性，从 [D-Trp 3]内吗啡肽-1 出发合成了相应的 6 种立体化学对照衍生物。通过在表达 μ 阿片受体的 HEK293T 细胞中测定其对环磷酸腺苷产生的抑制能力来评估生物活性。结果显示，溴化类似物的活性与未修饰肽相似，而通过偶联引入更大体积芳基的类似物，其效力随着基团增大而降低，所有 D 型 Trp 类似物则几乎失去活性。这证明了该策略可用于快速构建活性可调的肽类似物库及其立体化学对照。

讨论与结论总结

肽是一类重要的治疗分子，其生物活性可通过化学结构的改变进行调节。虽然肽治疗剂的侧链修饰通常通过在固相肽合成过程中掺入修饰的构建单元来实现，但酶促后期修饰代表了一种有吸引力的补充策略。尽管几种天然 FDHs 可作用于肽底物，但其活性通常需要特定的引导序列或标签，这限制了这些酶在肽后期功能化中的实用性。

本研究发现，与之前报道相反，RebH 在肽上具有稳健的活性，其效率受肽序列和结构特征调控。由于许多 RebH 变体先前已被改造出来，其新揭示的肽活性为设计肽选择性卤化酶提供了一个独特且易于操作的平台，并开启了将现有 RebH 变体应用于肽的前景。对 RebH 变体 4V 的大规模筛选定义了 RebH 和 4V 的序列耐受性，发现 4V 通常具有更高的转化率和更宽的序列范围。RebH 和 4V 的比较表明，底物结合盖及其相邻环是序列耐受性的重要决定因素。

研究人员将 4V 与 Suzuki–Miyaura 偶联结合，用于未修饰生物活性肽的后期化学酶促功能化。尽管在许多底物上转化率有限，但该策略无需引入保护基团或标签，并能为下游生物学测定提供足够的材料。利用这一化学酶促策略，研究人员调节了抗菌肽和 GPCR 激动剂的生物活性，并生产了一种经过修饰以实现荧光成像的功能性细胞穿透肽。尽管本研究聚焦于 Suzuki–Miyaura 偶联，但先前工作表明，由 RebH 或其他 FDHs 生成的芳基溴化物是通用的化学手柄，能够通过多种交叉偶联策略实现功能化，包括 Sonogashira 偶联、Buchwald–Hartwig 胺化和烷氧基化。在此基础上，本研究策略因此有潜力通过形成 C-C、C-N 和 C-O 键来实现肽的多样化。总之，本研究结果从概念和实践上扩展了 FDH 催化卤化在肽化学和化学生物学中的应用范围。