利用（一个或多个）上转换纳米粒子进行传感

《Accounts of Chemical Research》：Sensing with (One or Many) Upconverting Nanoparticles

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**概述**
掺镧的上转换纳米粒子（UCNP）通过多光子吸收过程将近红外（NIR）光转换为可见光。这一特性使它们成为生物环境中传感和单粒子研究的有效工具。它们特征性的窄发射线、抗光漂白能力以及三价铒（Er3+）激发态之间的热耦合，尽管敏感度适中，但UCNP仍被视为细胞内热测量的实用平台。使用标准显微镜和廉价的NIR激发源可以测量其响应，从而使其他类型的纳米级温度计难以实现的实验成为可能。然而，在活细胞内使用UCNP也暴露出重要限制，因为细胞内介质化学性质复杂，可能改变形成热读数的发射特性。局部pH值、离子浓度、粘度或分子拥挤度的变化会移动能级或修改非辐射弛豫路径。因此，确立UCNP细胞内热测量的可靠性需要专门研究粒子稳定性、表面化学性质以及细胞质环境的影响。理解这些效应对于确定UCNP热测量是否能作为定量细胞内工具而不仅仅是加热的定性指标至关重要。UCNP还通过光学捕获技术实现了新的单粒子实验。聚焦的NIR光束可以使单个纳米粒子固定，同时激发其上转换发射，从而连续监测光谱变化、旋转动态和局部机械特性。这些研究提供了集合测量中隐藏的信息，如粒子间的辐射相互作用或粒子旋转/运动与局部粘度之间的耦合。然而，光学捕获也带来了挑战：作用在小于100纳米UCNP上的力很小，且捕获稳定性受激光诱导加热的强烈影响。增加掺杂浓度可以提高限制效果，但会增加热负荷，因此必须仔细平衡这种权衡。基于等离子体增强的方法由于额外的加热而不适用，这激发了对替代光子结构（如介电超表面）的兴趣，后者可以在保持低温的同时增强限制效果。总体而言，细胞内热测量和单粒子捕获展示了UCNP的优势和当前限制。它们的光学特性使其成为测量局部温度和机械响应的理想探针，但性能严重依赖于周围环境。在这篇综述中，我们总结了我们在现实生物和捕获条件下理解UCNP行为的努力。我们讨论了细胞内热测量响应的稳定性、光学捕获中的限制-加热平衡，以及单粒子测量在纳米尺度上研究光-物质相互作用的机会。这些考虑为基于UCNP的更可靠传感和操控策略指明了方向。

**特别问题**
作为《化学研究账户》（Accounts of Chemical Research）“上转换纳米粒子”特别问题的一部分发表。

**关键参考文献**
1. Vetrone, F.; Naccache, R.; Zamarron, A.; Juarranz de la Fuente, A.; Sanz-Rodriguez, F.; Martinez Maestro, L.; Martin Rodriguez, E.; Jaque, D.; Garcia Sole, J.; Capobianco, J. A. 使用荧光纳米温度计进行温度测量。ACS Nano 2010, 4, 3254–3258. (1) 上转换纳米粒子（UCNP）能够在25°C到热诱导死亡温度45°C的范围内测量细胞内的温度，展示了上转换在温度传感和成像中的多功能性。
2. Labrador-Páez, L.; Pedroni, M.; Speghini, A.; Garcia-Sole, J.; Haro-Gonzalez, P.; Jaque, D. 稀土掺杂红外发光纳米温度计的可靠性。Nanoscale 2018, 10, 22319–22328. (2) 基于镧的纳米粒子会因环境和实验因素（如周围介质的吸收和纳米粒子的自吸收）而经历光谱失真，因此需要特别注意以确保使用UCNP进行准确的温度传感。
3. Rodríguez-Sevilla, P.; Rodríguez-Rodríguez, H.; Pedroni, M.; Speghini, A.; Bettinelli, M.; Solé, J. G.; Jaque, D.; Haro-González, P. 通过光学镊子评估单个上转换纳米粒子的发光。Nano Lett. 2015, 15, 5068–5074. (3) 单个捕获UCNP的光学捕获显示其光谱发射轮廓与捕获的UCNP集合体相比发生了变化，这是由于粒子间的相互作用引起的自吸收，这一点在传感应用中需要考虑。
4. Rodríguez-Sevilla, P.; Zhang, Y.; de Sousa, N.; Marques, M. I.; Sanz-Rodriguez, F.; Jaque, D.; Liu, X.; Haro-González, P. 用于细胞内微流变学的上转换粒子的光扭矩。Nano Lett. 2016, 16, 8005–8014. (4) 通过适当解释活细胞中光学捕获UCNP产生的偏振发射，可以了解其旋转动力学和细胞内粘度。

**1. 引言**
自1966年Auzel首次描述上转换过程以来，(5,6) 上转换纳米粒子（UCNP）由于其独特的能力——将多个低能量的近红外（NIR）光子转换为高能量的紫外线（UV）或可见光（Vis）发射——已成为传感和成像的理想材料。虽然该领域最初专注于将镧离子（如Yb3+和Er3+）掺入玻璃(7?11)和基于光纤的系统(12,13)，但其发展得益于探索Er3+的固有温度传感能力和纳米材料合成技术的进步(7,8)，这使得可以更好地控制粒子大小、组成和光学性能(14?17)。除了在光动力疗法(PDT)中的早期应用(18,19)外，这些进展扩展了UCNP的应用范围，使其在光电子设备(20)、光遗传学(21)、超分辨率(22,23)、光热疗法(PTT)(24)、药物递送(25)、生物分子检测(26)、活细胞成像(27)、单粒子跟踪(28)和太阳能电池(29)等领域得到应用。
UCNP在传感领域表现出色，因为其工作原理简单，对环境变化敏感，这对基础研究和实际应用都有重要影响。然而，要真正理解UCNP的潜力，我们必须区分两种使用方式：一种是成千上万个纳米粒子同时发光的集合范围，另一种是单粒子范围，由于单个纳米粒子发出的信号微弱，这是一个具有挑战性的任务。因此，该领域的主要里程碑来自于连接这两种范围的成就：
- **细胞内温度传感**：UCNP实现了生理范围内的精确发光温度测量，使研究人员能够监测区分细胞生死的温度变化。
- **发光纳米温度计中的环境和实验扰动**：UCNP使得能够详细分析环境和实验因素如何影响温度读数的可靠性。扰动既来自周围介质的光学吸收，也来自UCNP自身的自吸收，因此需要仔细考虑以确保准确的温度传感。
- **单粒子与集合体UCNP之间的光谱差异**：比较集合体和单粒子UCNP的光谱特征可以揭示由于粒子间相互作用和自吸收引起的显著差异。光学捕获技术的进步对于测量和量化这些差异至关重要，因为研究人员现在可以通过逐步增加工作UCNP的数量从1个增加到多个来观察发光转变。
- **使用光学捕获的UCNP进行细胞内传感**：光学捕获和单粒子光谱学的结合使得可以通过偏振发射实时监测活细胞中单个粒子的旋转，从而远程测量粘度等参数。

这四项成就提供了关于如何进行和解释基于UCNP信号的发光实验的关键见解，在推动该领域发展方面发挥了重要作用。更重要的是，从这些研究中获得的知识已成为设计和部署UCNP用于各种传感应用的标准实践，超越了温度传感，扩展到了其他基于发光的测量。通过回顾这些发展，这篇综述追溯了该领域的演变，并强调了我们团队的贡献，这些贡献继续指导着使用集合体和单UCNP进行发光传感的持续进步。

**2. 使用上转换纳米粒子进行传感**
UCNP在传感方面的成功源于它们通过多光子吸收将NIR激发转换为高能量UV/Vis发射的能力。这种机制特别适合生物应用，因为NIR光被生物介质吸收较弱，确保了深度组织穿透并最小化背景干扰。(30) 通过使用镧离子制造UCNP，产生的窄而持久的发射带很容易与背景信号区分开来，并且对pH值、温度和介质组成的变化非常敏感，从而提供了有关其周围环境的宝贵化学和物理洞察。(31) 氟化钠掺杂Yb3+/Er3+（NaYF4:Yb3+/Er3+）是合成UCNP最常用的材料，因为NaYF4基质化学稳定，对激发和发射波长透明，并且声子能量低（约360 cm–1），从而最小化了非辐射损失并最大化了发光效率。(32,33) 其热测量机制可以通过980 nm低功率廉价激光二极管激发Yb3+来触发，实现来自Er3+的热耦合能级2H11/2和4S3/2的绿色上转换发射（图1a）。(34) 由于这些能级之间的能量差（ΔE）很小，它们的粒子分布遵循玻尔兹曼统计：(35)
$$ L_{IR} = \frac{I_{525}}{I_{545}} = C \cdot e^{-\Delta E_{kB \cdot T} $$
其中LIR是2H11/2 → 4I15/2和4S3/2 → 4I15/2跃迁的积分强度比，C代表简并度和自发发射率，kB是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，ΔE通常在650–750 cm–1范围内。(36) 这种自参考热测量方法因其稳健性和简单校准而得到广泛应用，使得NaYF4:Yb3+/Er3+和类似的上转换材料成为基于发光的温度传感的理想选择。

**图1**
(a) Yb3+/Er3+的部分能级图；(b) 920 nm激发下的上转换发射光谱；(c) NaYF4:Yb3+/Er3+ UCNP的热测量校准；(d) d-葡萄糖存在下的UCNP发射；(e) d-葡萄糖浓度的红色-绿色比率校准。(b, c) 改编自参考文献(1)，经美国化学学会许可，版权2010年；(d, e) 改编自参考文献(48)，经Elsevier许可，版权2025年。

**2.1. 细胞内的温度测量**
温度调节基本细胞活动，提供了基于微妙温度变化区分健康细胞和疾病细胞（例如癌细胞）的直接途径。虽然传统温度计缺乏在复杂细胞环境中操作所需的空间分辨率，但纳米技术通过发光纳米温度计提供了强大的解决方案。(37) 通过利用UCNP的温度依赖性光发射，可以在活细胞内进行远程温度测量。Vetrone等人首次在液体和HeLa宫颈癌细胞中优雅地展示了这一想法，使用聚乙炔胺封端的NaYF4:Yb3+/Er3+ UCNPs作为热纳米探针。(1) 结果得到的UCNP（平均直径18 nm）在26–63°C的温度范围内遵循玻尔兹曼定律（公式1）显示上转换发射（图1b），并且通过内吞作用在1.5小时后容易内化到永生化的人类癌细胞中。(38) 使用共聚焦显微镜和配备电阻加热器的金属平台，在不同温度下获取细胞的光学和荧光图像。通过分析荧光图像中的LIR（图1c），将加热器电压转换为细胞介质温度的精确测量值，在45°C观察到细胞死亡，这通过相应透射光学图像中出现的膜碎片得到证实。
由于UCNP的物理化学稳定性和对长时间光照的抗光漂白能力，(39) 它们被确立为细胞内热测量的重要工具。尽管最初的进展受到细胞毒性和特定细胞递送问题的阻碍，但后续研究表明适当的表面功能化是提高生物相容性和促进原位器官定位的有效策略。(40,41) 从这项开创性研究中获得的经验教训为现代热映射奠定了基础，目前用于选择性标记细胞膜和精确靶向溶酶体和线粒体(42,43)，进一步证明了基于Yb3+/Er3+的UCNP在活细胞复杂环境中的适用性。

**2.2. 生物传感**
尽管大多数使用UCNP进行传感的研究都致力于测量温度，但也有将其作为pH值或与其上转换发光相互作用的多种分析物的生物传感器的应用。(44,45) 我们团队最近的一个例子利用了Yb3+/Ho3+对的上转换发射的内滤效应来研究水溶液中Cu2+的浓度。(46) 随着对UCNP基本原理理解的不断深入，这一领域也在不断扩大。一个具有生物学意义的例子是由于糖尿病患病率的增加而检测生物液体中的葡萄糖水平。羟基的振动是已知的Er3+离子的淬灭剂，而糖类中含有多个这样的基团。这影响了Er3+的激发态的分布，从而影响了它们的上转换发射，使得UCNP能够被用作葡萄糖传感器。(47) 最近，López-Pe?a等人展示了Yb3+/Er3+对的上转换发射也可以用来检测泪液中的葡萄糖，使用了苯硼酸修饰的多孔硅基底和纸质基底(图1d,e)。(48) 我们的小组还探索了一种不同的淬灭机制，该机制利用了F?rster共振能量转移的原理来检测缺氧情况。(49) 一种非荧光的偶氮染料被结合到UCNP的表面，从而能够淬灭上转换发射。在生物缺氧/无氧环境中，酶的活性会增加，偶氮键会被还原性断裂，从而停止上转换的淬灭，使UCNP的发射重新恢复，进而作为缺氧的传感器(图2a,b)。这个例子展示了UCNP的另一个优势：根据它们的掺杂组合（例如NaGdF4:Nd3+/Yb3+/Tm3+），这些纳米粒子除了上转换发光外，还能产生强大且持久的红外发射。(50) 结合激发波长的变化，这为改进生物医学应用铺平了道路。(51?53)图2显示了(a) NaGdF4:Nd3+/Yb3+/Tm3+ UCNPs和(b) UCNP-BDP-azo在密封的HeLa细胞培养中的缺氧响应的共聚焦图像。(c) Yb3+/Tm3+的部分能级图，(d) SrF2:Yb3+/Tm3+发光温度计(975 nm激发)的上转换发射光谱，以及(e) 功率依赖性的强度比变化。(a, b) 从参考文献(49)复制，经皇家化学学会许可，版权2025年。(d, e) 从参考文献(2)改编，经皇家化学学会许可，版权2018年。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片2.3. 伪影远程温度传感的能力，加上这些材料在化学检测中的灵活性，促使人们采用UCNP进行发光温度测量(54)和即时诊断设备(55)。由于它们在纳米医学和微电子学中的应用前景广阔，基于UCNP的温度计很快被社区采用，但往往没有经过充分的验证。这种方法的局限性很快显现出来，因为使用UCNP进行的温度测量结果不如最初假设的那样可靠。(56,57) 在许多情况下，由于激发功率的变化(58)或来自非热耦合的Er3+态的发射(59)导致的光谱失真，产生了误导性的温度读数。这些问题不仅限于UCNP，反映了发光温度测量中的一个更广泛的问题。这一认识促使我们的小组首次系统地研究了实验和环境因素如何扭曲用于温度测定的发射光谱。在Labrador-Páez等人的研究中，(2)确定了几个关键的误差来源，包括发射带形状随激发功率密度的变化、纳米温度计自身对发射光的自吸收，以及周围介质（如溶剂或生物组织）对发光的再吸收。这些效应不仅减少了信号强度，还改变了光谱轮廓，使得假设强度比稳定的比率测量方法产生偏差。因此，即使实际热条件保持不变，也会观察到明显的温度变化，强调了在发光温度测量中需要仔细的实验设计和验证。激发功率伪影的产生是因为不同的发射态可能遵循不同的功率依赖性动态，例如Tm3+中的3H4 → 3H6（795 nm，两光子激发）和1G4 → 3H5（769 nm，三光子激发）(图2c)。因此，使用结合这两种发射带的强度比可能会导致高达49% mW–1的偏差(图2d,e)。使用SrF2:Yb3+/Tm3+ UCNPs的实验表明，即使在恒定激光功率下，激发密度的深度依赖性变化也会系统性地改变发射强度比。这导致了虚假的温度变化，对于分析的Tm3+带，表观的热等效噪声(TEN)达到了28.7 °C mm–1，对于其他系统则高达46.7 °C mW–1。当使用高数值孔径(NA)物镜时，这些伪影会被放大，这对细胞内温度测量尤为重要。自吸收伪影源于相邻纳米粒子由于吸收带和发射带之间的光谱重叠而重新吸收发射的光子。基于Nd3+的温度计因其在近红外区域的强发射而被广泛使用，但特别容易受到这种影响。增加胶体中的光程长度会扭曲光谱轮廓，产生与温度无关的深度依赖性变化，误差可达26 °C mm–1。这种效应在纳米粒子浓度高或光程长的情况下更为显著，这在组织、微流控装置和聚集的细胞内环境中很常见。环境吸收对生物应用构成了最大的挑战。水在1300 nm附近有强烈的吸收，与Nd3+在1320 nm的发射重叠。当发光通过水介质传播时，选择性吸收会重塑光谱，导致TEN值高达92 °C mm–1。在这种条件下，体外仅0.2 mm的深度变化就会导致温度误差接近15 °C，而在体内测量中，误差可能达到数十度。(2) 这些效应只是冰山一角。例如，在使用硫化银纳米粒子作为热探针时，水介质中Fe2+/3+等离子的存在可能会导致超过10 °C的温度偏差。(60) 在生物介质中，情况更加复杂，因为细胞活动可以改变发光温度计的局部环境，引入其光学响应的变异性。在使用绿色荧光蛋白（最常用的生物成像和传感发光材料之一)的研究中，已经清楚地观察到了这种细胞诱导的变化。(61) 总而言之，距离发光温度计能够用于可靠的体内测量还有很长的路要走，主要是因为光线穿过组织时会遇到许多障碍，影响光谱形状，从而影响光谱温度读数。(62) 这些由光和化学引起的偏差促使社区探索替代的发光温度测量策略。特别是那些不依赖于Er3+发射或比率强度测量的方法受到了关注。例如，基于寿命的方法通常对强度失真和环境吸收效应不太敏感，为在复杂实验条件下确定温度提供了一种更为稳健的方法。(63?66) 从这个意义上说，寿命温度测量被证明是一种很好的策略，可以绕过组织引起的光谱失真，甚至可以通过半导体纳米粒子的寿命来探测微波引起的脑部加热。(67) 依靠类似的方法是实现可靠温度读数的关键步骤，因为通过文献调查和绘制常用的Ln3+，几乎所有的纳米温度计用带都至少受到一个主要伪影的影响，只有接近1060 nm的Nd3+发射不受影响。(2) 这里的重点是，如果不进行必要的验证步骤，就不能信任发光温度测量。为了检查伪影，这些步骤必须包括：(i) 在不同激发功率下的光谱测量；(ii) 评估自吸收的深度依赖性评估；以及(iii) 考虑环境吸收的校准。其他策略包括提高温度灵敏度以减少TEN，开发更高效的发射体和探测器，以及优化光学系统。这对于为该领域提供关键校正至关重要，表明发光纳米温度计本质上并不可靠，未考虑的伪影可能会产生远超过生物相关变化的温度误差。3. 光学捕获光学捕获(OT)是一种远程、多功能且非侵入性的技术，是现代纳米科学的基础。这项诺贝尔奖获奖技术能够对从微观到纳米尺度的胶体对象进行三维(3D)操纵，允许隔离、控制移动和监测单个粒子，如发光纳米温度计。(68) 捕获依赖于使用高数值孔径物镜将激光束紧密聚焦，如图3a所示。OT的核心机制涉及由聚焦光束产生的光学力，这些力来源于光束光与被捕获粒子之间的动量交换或粒子极化与电场梯度之间的相互作用。这些光学力分为两个主要部分：散射力(Fscat)，沿着光束传播方向作用并推动粒子前进（与光强度成正比）；以及梯度力(Fgrad)，将粒子拉向强度较高的区域（即光学陷阱的中心）。为了实现稳定的3D捕获，将粒子吸入焦点的轴向梯度力必须足够强，以克服将粒子推向光方向的散射力（即Fgrad > Fscat）。(69)图3。(a) 用于UCNP的典型光学捕获实验设置示意图。(b) 随着越来越多的UCNP被捕获在激发光束下，发射强度的增加。(c) 不同照射时间后单个和多个SrF2:Yb3+/Er3+ UCNPs的发射光谱。(b, c) 从参考文献(3)改编，经美国化学学会许可，版权2015年。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片对于尺寸(d)远小于激光波长λ（d ? λ，处于瑞利范围内）的纳米粒子来说，它们表现为偶极子。(70) 在这个范围内，Fgrad对应于偶极子在非均匀电场中经历的力。在这个尺度上，光学力主要由粒子的电子极化率决定，尽管它也强烈依赖于静电性质，如粒子的zeta电位，而不仅仅是其体积。捕获纳米粒子，特别是那些d < 100 nm的粒子，具有挑战性，因为产生的光学力通常很弱（对于小于100 nm的UCNP通常低于0.01 pN），并且捕获势大致相当于系统的热能。(71) 此外，由热能驱动的纳米粒子的布朗运动随温度显著增加，使得粒子更容易从陷阱中逃逸，即使是轻微的温度升高也会破坏粒子的限制。(72) 因此，理解纳米粒子的扩散速度（它强烈依赖于温度）对于预测其动态至关重要。为了克服稳定性和力的限制，研究人员开发了两种主要策略。第一种方法依赖于表面修饰，例如，用热敏聚合物涂层（如聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PNIPAM)装饰UCNP，可以实现光学力提高10倍以上，从而实现高达45 °C的稳定捕获。(73) 第二种关键方法旨在减小捕获体积。通过使用由光学捕获的介电微球产生的光子纳米射流(PNJ)将激光束聚焦到衍射极限之外，这个过程增强了强度梯度，从而增加了捕获力（与传统方法相比，捕获力的强度提高了七倍）。我们的小组展示了PNJs如何在整个液态水温度范围(20–90 °C)内稳定捕获小至8 nm的UCNP纳米粒子。(74)3.1. 单个捕获纳米粒子的光谱变化OT是一个理想的平台，用于研究单个UCNP，因为紧密聚焦的激光束具有双重功能。在这种情况下，单个NIR光束同时产生了捕获和移动UCNP所需的梯度力，并作为激发源。这种组合不仅允许精确跟踪UCNP的位置，还提供了记录由可控数量的UCNP（从单个到多个UCNP）产生的发光信号的可能性。(75) 逐步将UCNP引入光学陷阱中，可以区分由单个与多个UCNP产生的信号，证明了粒子-粒子相互作用的存在。Rodríguez-Sevilla等人进行的研究通过引入一种方法来稳定固定并精确定位掺杂了Yb3+/Er3+ (SrF2:Yb3+/Er3+)的氟化锶UCNP分散在重水中，使用了980 nm的光学镊子，从而证实了这一原理。(3) 作者捕获了一个d = 8 nm的UCNP，从而获得了单个粒子的发射光谱，这是一个由于胶体悬浮液中的布朗运动而变得困难的任务。孤立的粒子在649 nm附近显示出一个主导的发射峰，对应于Er3+ 4F9/2 → 4I15/2的跃迁。在持续照射下，随着越来越多的UCNP被捕获在激发光束下，发射强度以阶梯状的方式增加(图3b)。随着更多的UCNP被捕获，发射光谱变得更宽，出现两个相似的峰，分别在650 nm和665 nm处(图3c)。这些变化归因于辐射自吸收（辐射捕获）现象，即一个纳米粒子发射的光子在被检测到之前被附近的UCNP（Upconversion Nanoparticles）重新吸收。这种现象在孤立粒子中是不存在的，但在被限制在陷阱内的粒子集合中则变得显著。这项工作提供了首个实验证据，表明粒子间的辐射相互作用可以影响胶体悬浮液中的UCNP发光，强调了在解释UCNP集合的光学响应时必须考虑辐射捕获这一被忽视的机制。尽管如此， optical trapping（OT）在研究单个UCNP方面具有显著优势，因为它揭示了通常在集合测量中隐藏的光物理性质。通过隔离单个纳米粒子，研究人员可以研究诸如激发功率依赖性和各向异性相关的发光等现象。这种方法还使得在纳米尺度上详细研究光稳定性、发光动态、偏振效应和粒子间能量传输成为可能。(76) 这些能力扩展了传感应用，包括检测离子、生物分子以及局部环境变化（如细胞内温度和粘度）。在单粒子水平上研究UCNP还能更深入地了解能量传输和上转换机制，最终提高基于发光的传感技术的可靠性和性能。(77)3.2. 粘度除了单粒子光谱学之外，OT还直接提供了对纳米粒子与其周围介质相互作用机械响应的访问。被捕获的UCNP表现为热驱动的谐振子，其运动编码了关于温度、粘度和粘弹性的局部性质信息。这一原理是光学微流变学的基础，后者利用发光微粒或纳米粒子的运动来提取局部流变参数。存在两种操作模式：主动式和被动式。主动式方法施加外部力（如光学捕获或旋转）来驱动粒子运动，而被动式方法则依靠布朗运动来探测机械响应。(78) 许多生物材料都是粘弹性的，可以用复杂剪切模量G(ω) = G′(ω) + iG″(ω)来描述，其中实部反映弹性能量存储，虚部表示粘性耗散。光学微流变学提供了不同的实验途径来测量特定频率范围内的G′(ω)和G″(ω)，这些频率范围由主动式方案中的施加运动或被动式方案中的热波动光谱设定。(78) UCNP非常适合这两种模式，因为同一个粒子可以被光学驱动或自由波动，其发光提供了对位置和方向的敏感且无背景的读数。一个典型的例子是Rodríguez-Sevilla等人的工作，他们利用六方NaYF4:Yb3+/Er3+ UCNPs中红色Er3+发光的强偏振依赖性，将单个光学捕获的UCNP转变成局部粘度探针。(4) 偏振光谱显示了非球形UCNP在线性偏振陷阱中的定向情况（图4a–c）。经过适当校准后，通过实验确定发射强度比I656/I664，可以远程确定UCNP在光学陷阱中的取向。这反过来又使作者能够绘制扭矩图谱，并将粒子的旋转动力学与周围粘度联系起来。从光谱变化中实时提取的UCNP在陷阱内90°旋转的转换时间，可用于获取局部粘度的值。在HeLa细胞内（图4d,e），主动扭矩驱动的旋转和被动分析的角波动都显示了平均细胞质粘度约为2.5 Pa s，且随着旋转频率的增加而降低，这与粘弹性、类似液体的细胞质特性一致。

图4。(a) 上转换发光光谱（980 nm激发）和π、α、σ偏振状态。强度比I656/I664作为偏振角函数的极坐标图，分别对应(b) 正面（σ）和(c) 侧面（α和π）配置。(d) UCNP在HeLa细胞内旋转的示意图。(e) UCNP在HeLa癌细胞内的旋转演变。(a–c, e) 改编自参考文献(4)，经美国化学学会许可，版权2016年。

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发光传感中的一个主要挑战是串扰，即不同的刺激（如温度、粘度或压力）会改变相同的光谱特征。在生物微流变学中，温度和粘度的同时变化或激光诱导的加热可能会使机械读数产生偏差。为了克服这一限制，我们小组的最新研究表明，单个旋转的NaYF4:Yb3+/Er3+微粒可以提供温度和粘度的独立测量。(79) 该策略利用了Er3+在808 nm激发下的光谱和偏振各向异性。热耦合能级发出的绿色光通过基于玻尔兹曼的强度比作为发光温度计，而偏振敏感的红色发光带（4F9/2 → 4I15/2）则作为发光速度计。当粒子被圆偏振光旋转时，红色带强度比Rr = I652/I665的时间演变直接报告角速度Ω，结合已知的光学扭矩，可以通过Ω ∝ P/η得到局部粘度η。这种双通道策略已在直接相关的微尺度流变学场景中得到验证。在微流体混合实验中，旋转的NaYF4:Yb3+/Er3+粒子通过Rr报告了恒定的局部温度，而随着更粘稠的聚丙烯酰胺溶液扩散到腔室中，其旋转速度减慢，从而仅通过红色带振荡实时追踪粘度增加。(80) 在第二个实验中，使用额外的1450 nm加热光束来提高被捕获粒子周围的聚丙烯酰胺溶液的局部温度；绿色和红色带的同步分析得出了微尺度粘度的温度依赖性，与整体粘度计数据相符。

4. 结论

在研究掺镧系UCNP超过15年后，我们发现它们仍然与最初研究时一样有吸引力。虽然它们的光学行为已经得到了更好的理解，制备方法也有所改进，但许多重要问题仍未解决，特别是当UCNP在细胞内使用或单独研究时。本文讨论的进展突显了已经取得的成果以及仍然存在的挑战。在细胞内温度测量方面，UCNP继续提供了一种简单且可重复的方法，适用于亚微米尺度。尽管它们的热灵敏度在发光纳米温度计中不是最高的，但基于玻尔兹曼的比率法直接且与标准显微镜兼容，使UCNP成为实时细胞内温度追踪的最现实选择之一。然而，细胞内环境复杂，可能会影响温度读数的光学响应。pH值、分子拥挤、粘度以及细胞质引起的表面变化等因素可能改变UCNP的发光。这些效应尚未完全理解，需要专门的研究。校准实验应在有和没有生命过程的情况下进行设计，而不仅仅是比较在不同实验室条件下获得的校准曲线。进展还将取决于针对长期稳定性、细胞内表面改性以及细胞囊泡或其他亚细胞结构内限制性的研究。只有这样，基于UCNP的细胞内温度测量才能被验证为可靠的定量方法。此外，激发波长的选择必须仔细评估。广泛使用的980 nm激发波长会被水吸收，可能导致局部加热，从而高估温度。因此，应探索非吸收的激发波长。一旦被细胞内化，UCNP通常会被限制在溶酶体内，它们之间的近距离可能导致粒子间相互作用。这些相互作用会显著扭曲发光信号，与孤立粒子相比有所不同。理解这些效应对于正确解释细胞内荧光数据至关重要。我们的工作通过制造混合纳米结构和技术来访问单个或少数UCNP的发光来解决这个问题。光学捕获研究显示，UCNP之间的辐射相互作用是显著的，并且会导致光谱失真，这在生物学研究中常常被忽视。单粒子光学捕获也暴露了一些局限性。捕获力比通常假设的要弱，并且随着温度的升高而降低稳定性。更高的掺杂浓度虽然提高了限制效果，但也增加了加热，形成了一个未解决的权衡。等离子体策略增强了捕获效果，但会导致过度加热，这需要探索诸如介电超表面等替代方法。总体而言，尽管UCNP的光学性质和功能限制已经得到了更好的定义，但它们在复杂环境中的行为仍不完全清楚。持续的研究将需要系统地研究细胞内效应、光力-加热平衡以及在不损害温度控制的情况下增强限制的光子策略。