儿童哮喘的非靶向代谢组学分析：探索人为化学物质与血清代谢组之间的关系

《Environmental Epidemiology》：Untargeted metabolomic profiling of childhood asthma: An exploratory analysis of anthropogenic chemicals and the serum metabolome

　　摘要
背景：哮喘是儿童中最常见的慢性疾病，尽管进行了大量研究，但其病因、与环境因素的关联以及潜在机制仍不明确。

方法：我们研究了预防和哮喘及螨虫过敏出生队列中628份血清样本（165例病例，463例对照组）中哮喘与代谢特征之间的横断面关系，这些样本来自8岁、12岁和16岁的儿童。代谢特征通过高效液相色谱-高分辨率质谱法进行检测。采用逐一分析单个特征的方法，将哮喘状态（即当前是否患有哮喘）与每个特征的测量强度进行回归分析；这种方法进一步扩展到了按年龄分层的分析中。我们还使用Mummichog软件探索了生物途径。此外，我们评估了具有显著相互关联的外源性混合物（特别是多氟烷基物质[PFAS]）与哮喘之间的关联。

结果：高效液相色谱-高分辨率质谱法检测到了55,444个代谢特征，其中包括38种已鉴定的外源性化合物（15种PFAS、14种农药、4种酚类、4种邻苯二甲酸酯和1种其他化合物）和460种内源性代谢物。总体而言，我们观察到个别环境化合物与儿童哮喘之间存在有限且不稳定的关联。在按年龄分层的分析中，发现单环己基邻苯二甲酸酯与哮喘呈正相关，而单乙基磷酸酯与哮喘呈负相关，但这些发现并未一致达到多重检验的阈值。作为混合物的PFAS与哮喘无关（P = 0.67，比值比 = 1.00）。途径分析表明，酪氨酸代谢途径可能与哮喘及某些环境化合物有关。

结论：在这项探索性的代谢组学分析中，我们发现测得的环境化合物与儿童哮喘之间的强烈关联证据有限。尽管如此，仍观察到一些特定于年龄的信号和途径级别的模式，尤其是涉及酪氨酸代谢的信号，这些可能有助于指导未来的假设驱动研究。

本研究的有益之处：
首先，它采用了无偏的高效液相色谱-高分辨率质谱法，同时捕获了数千个代谢特征，减少了选择性报告，从而更广泛地评估了可能与哮喘病因相关的代谢过程。这种方法还允许同时评估多种人为来源的化学物质。其次，通过在探索性分析中突出可能与哮喘和环境暴露相关的代谢途径，本研究为未来研究哮喘的潜在机制提供了线索。这些贡献有助于填补对哮喘环境决定因素理解的空白，并展示了非靶向代谢组学分析在研究多种环境暴露与人体代谢组之间复杂关系方面的价值。

引言
哮喘是儿童中最常见的慢性疾病，其特征是气道的慢性炎症。全球范围内，儿童的哮喘患病率估计约为9%，但地区间差异很大，从印度勒克瑙的不到1%到哥斯达黎加的29%不等，荷兰的哮喘患病率约为6%。20世纪下半叶哮喘患病率大幅上升后，近年来趋于稳定。尽管进行了大量研究，关于儿童哮喘的病因尤其是环境暴露的作用仍知之甚少。先前的研究报告了哮喘与农药、邻苯二甲酸酯和多氟烷基物质（PFAS）等化合物暴露之间的潜在联系，但证据尚无定论，且不同人群间的研究结果存在冲突。

使用非靶向高效液相色谱-高分辨率质谱法（LC-HRMS）对血清样本进行全面分析，可以同时评估数百种内源性和外源性化合物及其与哮喘的关系，从而减少选择性报告。此外，LC-HRMS捕获的代谢信息有助于了解与哮喘相关的生物过程。在这项研究中，我们利用来自预防和哮喘及螨虫过敏出生队列的628份血清样本数据，检测了8岁、12岁和16岁儿童哮喘状态与55,444个代谢特征之间的横断面关系。这些特征包括38种外源性化合物（15种PFAS、14种农药、4种酚类、4种邻苯二甲酸酯和1种其他化合物）和460种内源性代谢物。由于检测到的特征数量众多，这项分析具有探索性，旨在识别可能与哮喘和环境暴露相关的潜在代谢信号和途径。为了评估潜在的年龄相关差异，我们分别对各年龄组进行了分析，并评估了哮喘与已鉴定PFAS混合物之间的关联，并进行了途径分析以探索与哮喘及检测到的外源性化合物相关的代谢途径。

研究人群：
预防和哮喘及螨虫过敏出生队列的研究已在之前详细描述过。简而言之，参与者于1996-1997年间从荷兰三个不同地区（北部、中部和西部）的产前诊所招募，基线时共有3963名儿童。从基线开始，父母和儿童本人每年（8岁以下每年一次，8岁以后大约每三年一次）被要求完成问卷调查。在8岁、12岁和16岁时，通过临床检查收集了血清样本。

嵌套病例-对照研究：
这项嵌套病例-对照研究针对的是那些在8岁、12岁和/或16岁时有血清数据的荷兰父母的子女。8岁、11岁和16岁的哮喘病例被定义为至少满足以下三个条件中的一个：过去12个月内有喘息现象、曾被医生诊断为哮喘、过去12个月内服用过哮喘药物。对照组定义为在整个随访期间（直至16岁）无哮喘症状。所有来自病例的可用血清样本都被选入本研究。对照组血清样本（n = 463）在性别和随访轮次上与病例血清样本（n = 165）相匹配。具有重复样本的病例尽可能与同一对照组在相同时间点匹配。血清样本的采集时间为2005年至2014年。

代谢组学分析：
样本处理：
采血后，样本在室温下静置30分钟以使其凝固，然后离心分离血清和细胞。血清转移到Sarstedt冷冻管中，并立即储存在-80°C，直到转移到实验室并进行后续分析。分析前，样品按照既定方案处理，使用LC-HRMS进行非靶向血清代谢组学分析。具体来说，分析前将血清样本在4°C解冻，然后加入90 μL含有13C标记内标物的乙腈提取30 μL血清。处理后的样品涡旋2分钟，在4°C下平衡30分钟，再在4°C下以3,220 × g的离心速度离心45分钟。取两份上清液（各30 μL）转移到含有60 μL水（C18）或60 μL 1:1乙腈/水（亲水相互作用液相色谱）的96孔板中，涡旋2分钟后放入冷藏自动取样器中。样品以三次重复的方式进行分析，采用亲水相互作用液相色谱和C18疏水反相色谱，在正电喷雾和负电喷雾电离模式下进行，共进行了四次分析（Thermo Scientific Vanquish Duo LC系统 & Q Exactive HF-X Orbitrap MS系统）。为保持代谢组实验的数据质量，在每个96孔板的开始、结束和每20个样本处放置了QA/QC样本（包括两个合并血清样本的重复分析）；每次研究运行开始和结束时分析了NIST SRM 1950标准品；每批样本开始和结束时也分析了方法空白样本。QA/QC分析每天使用TraceFinder自动化工作流程完成，并由至少两名不同人员验证。质量控制后，使用apLCMS和XMSanalyzer提取代谢物特征。最终得到了63,129个可通过质量和保留时间识别的特征。排除在不到30%的样本中检测到的特征后，剩余55,444个特征。通过将检测到的m/z值和保留时间与包含多种环境和内源性化合物的1200个标准品数据库进行比较，确认了化合物的身份（Schymanski级别1）。代谢物鉴定的准确性通过m/z值和保留时间的匹配来确定，容忍度分别为5 ppm和15秒。

统计分析：
特征插补：
样本处理后，对于无法检测到的特征值，采用了类似Lubin等人的方法进行插补。该方法假设无法检测到的值是由于仪器的检测限造成的，而非干扰分析物的影响。具体来说，我们为每个特征（逐一处理）拟合参数模型，其中包含哮喘状态、性别、年龄的残差项、随访轮次（以及随访轮次与其他固定效应预测因子之间的双向交互作用），批次的随机截距项和受试者的随机截距项。随访轮次变量及其与其他变量的交互作用项采用高斯先验进行正则化，平均值为零，标准差为三，以在随访轮次数据稀疏时对较大系数进行适当调整。我们将检测限定义为一批样本中观察到的最小（对数转换后）强度值。然后，从该拟合模型的后验中随机抽取70个值（即低于批次调整后检测限的100% - 最小检测阈值），为每个具有无法检测到值的特征生成70个插补数据集。

批次校正强度值：
使用ComBat进行批次校正后，仍有一些特征存在批次效应（n = 52,456 [94.6%]）。因此，对于具有无法检测到值的特征，通过从后验中抽取70个随机值（即批处理调整后检测限的100% - 最小检测阈值）来调整其强度值。

单特征与哮喘的关联：
我们使用Firth的逻辑回归模型估计样本的哮喘状态与每个特征强度之间的关联（逐一处理特征）。每个模型以哮喘为结果，对数转换后的特征强度为感兴趣的预测因子，匹配变量（性别和随访轮次）的指示器和剩余年龄（实际年龄减去用于匹配的整数年龄）为协变量。按年龄（8岁、12岁和16岁）分层后的分析仅包括对数转换后的特征强度和性别作为预测因子。使用Rubin规则合并了不同插补数据集中的每个特征的逻辑回归结果。通过Benjamini–Hochberg程序将假发现率（FDR）控制在每项分析和每个化合物组（外源性和内源性）的10%。已鉴定特征的结果可以直接解释，而未鉴定特征的结果仅用于途径分析（见“途径分析”部分）。

外源性混合物与哮喘的关联：
对于在相关图上显示显著相互关联（ρ> ≈0.3）的外源性化合物类别，我们使用g-computation方法估计混合物成分与哮喘的联合关联。换句话说，我们拟合了一个简单的逻辑回归模型，包括混合物的所有成分，并通过计算混合物各成分的边际效应来估计哮喘的风险。通过简单逻辑回归，该边际效应等于混合物各成分回归系数的总和。有关我们实现的更多细节，请参见补充方法I（https://links.lww.com/EE/A427）。这项研究使用了Mummichog工具（通过MetaboAnalystR实现）。Mummichog可以直接从特征表预测功能活性，而无需对这些特征进行特定的识别。特征与哮喘状态之间的关系、特征的m/z值和保留时间，以及用于生成该特征的电喷雾离子化模式被作为输入参数。Mummichog的参数设置为1000次排列、质量容忍度为5 ppm，以及混合分析模式。在FDR（假发现率）为10%时被认为是显著的特征，或者如果这样只能得到不到1%的特征，则选择P值处于1%百分位的特征来评估通路富集。在一种折中方法中，我们还评估了已识别的外源化合物与内源特征（无论是已识别的还是未识别的）之间的关系，并使用这些结果对每个识别的外源化合物进行通路分析。详情请参见补充方法II：https://links.lww.com/EE/A427。每个通路分析的结果都使用了Benjamini–Hochberg程序进行了多重检验调整，FDR为10%。这一过程分别针对哮喘通路和外源化合物通路进行了处理。

为了评估在4年期间我们对外源化合物的测量数据的变异性，我们使用了在12岁和16岁随访时有重复测量的参与者的数据，计算了每个已识别外源化合物的组内相关系数（ICC）（见图S1：https://links.lww.com/EE/A427）。简而言之，我们为每个已识别的外源化合物拟合了“特征插补”部分中描述的相同类型模型，并通过将随机受试者截距方差除以随机受试者截距方差加上残差误差方差来计算ICC，从而将批次方差视为一个干扰因素。更多细节可以在补充方法III中找到：https://links.lww.com/EE/A427。

### 研究人群
总共共有628份血清样本纳入了这项研究。这些样本来自523名受试者；其中99名受试者提供了两次随访的血清样本，3名受试者提供了所有三次随访的样本，421名受试者提供了一份血清样本（详见图S1中的文氏图：https://links.lww.com/EE/A427）。研究样本的特征在表1中展示。总体而言，大多数血清样本来自男孩（占56%）。共有165份血清样本来自病例组，463份来自对照组。在628份血清样本中，118份样本收集于8岁时，200份采集于12岁时，310份采集于16岁时。详细的队列信息（例如喘息表型）可以在Wijga等人的研究中找到：11。

### 血液代谢组评估
在55,444个特征中，有38种外源代谢物（人体无法产生的化合物的代谢物）能够通过与我们数据库中的1200个标准品进行匹配而被可靠地识别。这些代谢物属于四个化学类别（15种PFAS、14种农药、4种酚类、4种邻苯二甲酸酯和1种其他化合物）。此外还识别出687个特征，这些特征对应于460种独特的内源代谢物。表S1a和S1b（https://links.lww.com/EE/A427）包含了已识别化合物的完整列表以及检测到这些化合物的样本比例，而图S2（https://links.lww.com/EE/A427）显示了所有特征中未检测到这些化合物的比例分布。

### 单个代谢特征与哮喘的关系
在已识别的外源化合物中，单环己基邻苯二甲酸酯（MCHP）与哮喘的关联最为显著（比值比[OR] = 3.79，未调整的95%置信区间[CI] = 1.59, 9.06，P值 = 0.003），尽管在控制FDR为10%后，这种关联并不具有统计学显著性（FDR调整后的P值 = 0.104）。虽然多种内源化合物与哮喘状态有关，但在控制FDR后，没有一种化合物的关联具有统计显著性（最小FDR调整后的P值 = 0.847）。图1中的火山图显示了这项分析中P值和OR的完整分布。

### 年龄分层分析
在按年龄分层的分析中，单乙醇酸酯在8岁时与哮喘有统计学上的显著关联（FDR调整后的P值 = 0.046，OR = 0.10，未调整的95% CI = 0.03, 0.4），但在12岁和16岁时则没有显著关联（12岁：FDR调整后的P值 = 0.496，OR = 1.89，未调整的95% CI = 0.91, 3.96；16岁：FDR调整后的P值 = 0.998，OR = 0.69，未调整的95% CI = 0.23, 2.09）。在16岁时，MCHP具有统计学意义（FDR调整后的P值 = 0.053，OR = 12.68，未调整的95% CI = 2.67, 60.16），但在8岁和12岁时没有这种关联（8岁：FDR调整后的P值 = 0.672，OR = 0.46，未调整的95% CI = 0.10, 2.23；12岁：FDR调整后的P值 = 0.102，OR = 8.11，未调整的95% CI = 1.72, 38.29）。在不同的年龄阶段，多种内源化合物与哮喘有关联，但在控制FDR后，没有一种化合物的关联具有统计显著性（FDR调整后的最小P值分别为8岁时的0.190、12岁时的0.522和16岁时的0.937）。分层分析的火山图可以在图S3中找到：https://links.lww.com/EE/A427。所有外源化合物的结果详见表S2：https://links.lww.com/EE/A427。

### 外源混合物与哮喘的关联
在外源化合物之间的相关性通常较低（相关性介于0到0.2之间），除了PFAS化合物组，该组内的化合物之间表现出显著的相关性（许多相关性大于0.3）（见图S4：https://links.lww.com/EE/A427）。这种PFAS化合物混合物与哮喘状态的联合关联并不具有统计学显著性（P = 0.67，OR = 1.00），这与任何单一化合物都没有显著关联的结果一致（最小P值为全氟丁烷磺酸的0.07）。

### 通路分析与哮喘和环境化合物
基于我们观察到的非内源代谢特征与哮喘之间的关联，在FDR为10%的情况下，酪氨酸代谢通路在通路富集分析中与哮喘状态相关（表S3f：https://links.lww.com/EE/A427）。基于15种农药与代谢特征之间的关联，在FDR为10%的情况下，有35条生物通路被认为得到了富集。与最多农药化合物相关的通路是亚油酸代谢（n = 6/14）、亚油酸酯代谢（n = 6/14）以及从花生四烯酸通路形成的前列腺素（n = 5/14）（表S3a：https://links.lww.com/EE/A427）。测量的PFAS化合物在FDR为10%的情况下与37条生物通路相关。最常见的关联是亚油酸酯代谢（n = 9/15）、亚油酸代谢（n = 8/15）和丁酸代谢（n = 8/15）（表S3b：https://links.lww.com/EE/A427）。测量的酚类化合物与13条生物通路相关，但没有一条通路与多种酚类化合物相关（表S3c：https://links.lww.com/EE/A427）。测量的邻苯二甲酸酯化合物在FDR为10%的情况下与14条生物通路相关。最常见的关联是与雄激素和雌激素的生物合成及代谢（n = 2/4）、精氨酸和脯氨酸代谢（n = 2/4）以及C21-类固醇激素的生物合成及代谢（n = 2/4）（表S3d：https://links.lww.com/EE/A427）相关。单乙醇酸酯与9条生物通路相关（表S3e：https://links.lww.com/EE/A427）。外源化合物异丙卡巴、乙胺嘧啶、2-氨基六氟丙醇和单-2-庚基邻苯二甲酸酯也与酪氨酸通路相关。通路分析的完整结果见表S3：https://links.lww.com/EE/A427。

### 外源化合物测量的时间变异性
在4年期间（12岁和16岁），外源化合物的组内相关系数（ICC）中值为0.09（IQR，0.17），表明这两个时间点之间的暴露存在显著差异。农药和PFAS类别的化合物的ICC最低（ICC中值 = 0.07），而酚类化合物的ICC最高（ICC中值 = 0.23）。总体上，大多数化学类别内的ICC估计值差异较大。其中，涕灭威砜化合物的ICC估计值最高，为0.53。详细结果见图S5：https://links.lww.com/EE/A427。

### 讨论
在这项针对8岁、12岁和16岁儿童的血清代谢组谱和环境化合物的横断面分析中，我们发现个别外源化合物与哮喘之间的强关联证据有限。在分层分析中出现了某些与年龄相关的信号，包括16岁时MCHP的阳性关联和8岁时单乙醇酸酯的阴性关联。然而，这些发现在校正多重检验后并不始终具有显著性，因此应谨慎解释。酪氨酸代谢通路在通路富集分析中与哮喘和几种环境化合物相关，这提示可能存在一种值得进一步研究的代谢背景。因此，我们的发现主要提供了假设生成的信号，而不是确凿的关联证据。观察到的哮喘与酪氨酸代谢通路之间的关联与之前的一项研究结果一致，该研究指出哮喘儿童中酪氨酸通路发生了改变。酪氨酸代谢涉及将酪氨酸氨基酸分解并转化为黑色素色素或神经递质（如多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素）。这条通路在甲状腺激素的合成和儿茶酚胺的生成中也起着重要作用。先前的研究发现，患有自身免疫性甲状腺疾病的受试者患哮喘的几率高于对照组，但甲状腺激素在哮喘病理生理学中的确切作用尚不清楚。儿茶酚胺是在应激下由身体产生的，并且还参与呼吸频率和支气管收缩。有趣的是，酪氨酸代谢还与空气污染暴露和哮喘儿童的皮质类固醇抵抗性有关。在我们的研究中，与酪氨酸代谢相关的外源化合物（即异丙卡巴、乙胺嘧啶、单-2-庚基邻苯二甲酸酯、2-氨基六氟丙醇）之前在儿童哮喘研究中未被发现，这可能表明它们是新的哮喘风险因素。关于邻苯二甲酸酯暴露与哮喘之间关联的证据并不一致。实验研究表明邻苯二甲酸酯可能在过敏致敏中起作用，而流行病学研究则报告了聚氯乙烯地板与儿童哮喘之间的关联。相比之下，测量生物样本中邻苯二甲酸酯的生物监测研究通常显示出不一致的关联结果。在我们的分析中，我们发现邻苯二甲酸酯相关化合物与哮喘之间的关联证据总体有限。然而，在年龄分层分析中，MCHP与哮喘呈阳性关联，尽管在校正多重检验后这一发现并未始终保持显著性，因此应视为探索性结果。我们还观察到8岁时单乙醇酸酯与哮喘之间的负相关。据我们所知，这种化合物与呼吸健康之间的关系之前尚未被研究过。我们对PFAS、农药和酚类的发现与当前的证据一致。例如，Van Holst等人指出，关于儿童哮喘与PFAS水平之间关联的令人信服的证据很少。同样，研究农药和酚类化合物的流行病学研究也通常报告了不一致的结果。然而，鉴于哮喘的临床表型异质性和可能的缓解期与复发期，研究其病因是具有挑战性的。这使得将缺乏证据视为无效应的证据变得困难。我们的分析显示，几种生物机制与所研究的外源化合物有关。总共52条生物通路与这些化合物相关。其中最为核心的是亚油酸代谢（n = 17种化合物）、亚油酸酯代谢（n = 17）、丁酸代谢（n = 15）、β-丙氨酸代谢（n = 11）、白三烯代谢（n = 11）以及从花生四烯酸通路形成的前列腺素（n = 11）。除了丁酸代谢（与脂肪酸合成相关）和β-丙氨酸代谢途径（与饮食相关）之外，其他所有代谢过程都与炎症有关。炎症是环境疾病的典型特征，而炎症和脂肪酸在哮喘的发生中起着核心作用。这些发现表明，研究中的外源性化合物可能通过影响这些代谢途径并促进（慢性）炎症来导致哮喘。尽管不同化合物之间的生物学关联存在相似之处，但也存在显著差异。例如，邻苯二甲酸盐与多种激素途径相关，包括雄激素和雌激素的生物合成与代谢以及C21-类固醇激素的生物合成与代谢。有趣的是，已有研究表明邻苯二甲酸盐会破坏内分泌功能，这增加了我们对路径分析结果的信心。

我们的研究有几个优势：首先，我们同时评估了哮喘与多种外源性和内源性化合物之间的关系，并使用了客观的定量测量方法，这减少了选择性报告结果和自我报告偏见的可能性。其次，我们在考虑多种化合物同时暴露的混合环境中评估了它们与哮喘的关联，从而可能更准确地反映现实世界的暴露情况。此外，我们的路径分析使我们能够从众多未鉴定的特征中提取潜在的生物学活性信息。

然而，也有一些局限性需要注意：由于测试的代谢特征数量众多，且属于非针对性代谢组学分析的探索性质，某些观察到的信号可能是偶然现象，因此需要在独立队列中进行验证。首先，目前尚不清楚血清中单一指标所反映的暴露时间长度。先前的LC-HRMS分析显示，在数月内收集的个体血清样本中，重复测量结果之间具有较好的一致性；但对于外源性化合物而言，4年内的ICC值较低，表明我们的测量结果对长期平均值的反映不够准确。使用单一暴露指标时不可避免存在测量误差，这可能会稀释潜在的长期暴露效应。其次，我们对混合物与哮喘关联的评估并未探讨混合物中各成分之间的相互作用或成分与哮喘之间的非线性关系，因为担心数据稀疏和过度拟合的问题。尽管如此，我们认为假设线性关系是一个合理的起点。此外，在所有关于哮喘的分析中，我们将样本视为独立的，即没有考虑同一个体不同血清样本之间的相关性。由于病例和对照组之间的身份固定，无法采用多层逻辑回归等常见方法，因为在这些多层模型中不存在个体内病例状态的变化。这种处理方式可能导致标准误差被低估。最后，无法排除未观察到的混杂因素（如饮食和酪氨酸代谢）的影响。

在这项探索性的代谢组学研究中，我们发现个别环境化合物与儿童哮喘之间的强烈关联证据有限。尽管经过多重检验校正后大多数关联均无统计学意义，但仍识别出一些与年龄相关的信号和路径级模式，尤其是在酪氨酸代谢方面。这些发现应谨慎解读，但可能为未来的假设驱动型和纵向研究提供有用的线索。

**利益冲突声明**：作者声明与本报告的内容不存在任何利益冲突。

**致谢**：我们非常感谢在PIAMA研究中负责数据收集和管理工作的所有人员。