在纳米孔限制条件下，PEG（聚乙二醇）的线圈-球形结构与场驱动的线圈-团块结构之间的转变

《ACS Measurement Science Au》：Coil–Globule versus Field-Driven Coil–Blob Transitions of PEG under Nanopore Confinement

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聚乙二醇（PEG）在其下临界溶解温度（LCST）以上会经历线圈-球状转变，这是因为水合作用减弱所致。虽然这种行为通常通过化学修饰或共溶剂来调节，但纳米尺度限制提供了一种替代的物理方法来影响聚合物的性质。在这里，我们使用基于纳米孔的大小区分作为聚合物完全限制的指示器，通过检查不同分子量的聚乙二醇（1500、2000 和 3400 g·mol–1）在两种具有不同几何结构和表面性质的 β-桶蛋白纳米孔（α-溶血素（α-HL）和 Aerolysin（Ael）中的温度依赖性传输，来追踪单个聚合物层面的驱动构象转变，温度范围为 5–45 °C。尽管温度不影响纳米孔的结构，但它显著调节了 PEG-纳米孔相互作用的动力学。在 α-HL 中，较大分子量的 PEG 的阻塞持续时间随温度显著增加，使得在 25 °C 以上可以区分 PEG 2000，在 45 °C 时可以区分 PEG 3400，这与受限引起的线圈-球状转变和降低的表观 LCST 一致。相比之下，在 Ael 中，所有分子量的 PEG 的阻塞持续时间随温度降低，在高施加电压下只能区分小分子量的 PEG。尽管我们的观察是从传输动力学推断出来的，而不是直接的结构测量，但这种行为表明了场驱动的、类似团块的聚合物限制，其中链是由电场强制进入纳米孔的，而不是由热力学稳定的。这些对比现象可以通过使用尺度论点和统一的自由能框架来解释聚合物限制。

引言
聚乙二醇（PEG）由于其化学简单性、可调的分子量和已表征的溶液性质，长期以来一直是纳米孔研究的模型聚合物。(1) 在水溶液中，PEG 表现出热响应行为，其特征是下临界溶解温度（LCST），在此温度以上，聚合物-水的相互作用减弱，导致线圈-球状转变。(2?4) 传统上，调节这种转变依赖于化学修饰、共聚或添加共溶剂，这些方法会增加系统的复杂性，并且经常牺牲可持续性。(5,6) 一种替代且几乎没有探索的方法是通过纳米尺度限制来调节聚合物的相行为，其中几何形状和界面相互作用提供了纯粹的物理控制手段。从基础角度来看，构象转变也控制着蛋白质的折叠和展开，并受到温度和空间限制的强烈影响。在蛋白质中，温度的升高通常通过破坏分子内相互作用来促进展开；而在热响应聚合物（如 PEG）中，温度可以通过 LCST 诱导链的塌陷。尽管这些热响应相反，但展开的蛋白质和柔性的聚合物在受限条件下共享一个共同的物理描述。在这两种情况下，受限的几何形状都会驱动从线圈到团块状的构象转变。(7,8) 这一对应关系表明纳米限制是构象转变的通用控制参数，并为基于纳米孔的传感和蛋白质测序技术中的分子捕获、转移动态和信号分辨率建立了物理框架。

历史背景
在纳米尺度限制中，PEG 首次被用作分子探针，通过比较加入多分散 PEG 溶液后体系电解质电导率的变化来估计纳米孔的尺寸。(9) 这种方法依赖于 PEG 从纳米孔中的空间排斥，导致体系电导率与纳米孔电导率之间的不匹配，并成功估计了 α-溶血素（α-HL）纳米孔的半径（约 1.3 nm）。(10) 随后的研究揭示了纳米孔的不对称性，这与 α-HL 的晶体结构一致。(11) 这些早期分析假设 PEG 与纳米孔之间的特定相互作用可以忽略不计，(12) 但后来的大量研究证明了 PEG 在蛋白质纳米孔内的尺寸依赖性分配和扩散，包括 Alamethicin。(13?17) 随后，PEG 成为探索纳米尺度限制下聚合物分配基本物理的强大系统，特别是在相对较高的盐浓度下。(18?31) 在接近饱和的 KCl 浓度（4 M）下，PEG-α-HL 相互作用会产生明确的离子电流阻塞。(32) 在一个中等分子量范围内，阻塞深度和停留时间随聚合物尺寸增加，而对于较大的 PEG，阻塞幅度饱和，停留时间减小。(32) 值得注意的是，阻塞幅度可以用来构建单分子“质谱”，具有单体级别的分辨率，从而能够识别多分散混合物中的个别 PEG 物种。(33) 对于每种物种，停留时间遵循具有聚合物尺寸特征值的单指数分布，这与一级结合过程一致。这些发现共同建立了基于纳米孔的大小区分作为可靠的单分子分析框架。(33) 在这些高盐条件下，α-HL 已经被证明能够在低施加电压下分辨出多达 25 种不同的 PEG 寡聚物，这些寡聚物平均含有 34 个重复单元（约 1500 g·mol–1），范围从 PEG 24 到 PEG 48。(33) 要实现单体分辨率，需要整个链进入纳米孔，并且每个单体都有足够的离子电流敏感性，以便独立贡献到阻塞信号中。这一策略后来也被用于水溶性聚合物，(34?39) 尽管由于分子结构、大小、化学性质和结合亲和力的变化，其广泛适用性仍然具有挑战性。因此，大量的努力集中在将基于纳米孔的大小区分扩展到其他分析物上，包括金属簇、(40) 短 DNA 片段、(41) 同源肽、(42) 异源肽、(43?48) 以及糖胺聚糖、(49,50)，并且扩展了非离子聚合物的可检测尺寸范围。一种方法是使用另一种 β-桶蛋白纳米孔 Ael，在高盐浓度下，它可以区分比 α-HL 更小分子的 PEG 寡聚物，并在高负电场下将单体分辨率扩展到更广泛的尺寸范围。(36) 其他策略，如 DNA 发夹偶联，已经能够检测到非常小的 PEG（约 140 g·mol–1），尽管不是在大小区分的背景下。(51) 相反，通过提高温度在 α-HL 中实现了对较大 PEG 的检测。(38) 在较高温度下，可以区分在室温下无法分辨的 PEG，这种现象归因于 PEG 的溶解度降低和温度引起的聚合物压缩，有利于其进入和限制在纳米孔中。在这里，我们引入基于纳米孔的大小区分光谱作为聚合物完全限制的敏感和定量指示器，据我们所知，这种方法之前未曾被用来追踪单个聚合物层面的驱动构象转变。我们研究了温度和在纳米尺度限制下的驱动力如何共同调节非离子聚乙二醇（PEG）在蛋白质纳米孔中的线圈-球状转变与场驱动的线圈-团块转变。特别是，我们探讨了这种温度诱导的 PEG 尺寸区分增强是反映了 PEG 在限制下的内在属性，还是取决于纳米孔的几何结构和相互作用格局。通过直接对比这两种在几何形状和静电特性上有显著差异的纳米孔，我们展示了 PEG 通过纳米孔的传输可以根据纳米孔的几何结构分为两种不同的情况：一种是由完整链限制引起的热力学稳定的线圈-球状转变，另一种是由施加的电场主导的场驱动的线圈-团块转变。我们使用统一的自由能框架和尺度论点来合理化这些机制，包括将聚合物随机行走与量子粒子轨迹进行类比，这在定性上捕捉了不同聚合物和纳米孔之间测量的限制自由能。

结果和讨论
温度对孔的结构完整性和有效尺寸的影响
在研究温度对非离子聚合物（PEGs）通过 α-HL 和 Ael 纳米孔传输的大小区分的影响之前，我们首先检查了温度变化是否会影响孔本身的结构完整性和有效尺寸（图 1），以及通过 α-HL 和 Ael 的离子传输（图 SI 1 和 SI 2，表 SI 1）。为此，我们在 3 M KCl 溶液中进行了两个纳米孔的电导率-温度测量，温度范围为 5 至 45 °C。图 1 显示了 α-HL 和 Ael 纳米孔的电导率作为温度的函数。在这两种情况下，当温度从 5 °C 升高到 45 °C 时，开放孔电流大约增加了 2.5 倍，这与体电导率非常吻合。3 M KCl 的体电导率约为 σ(5 °C) ≈ 165 mS/cm 和 σ(45 °C) ≈ 385 mS/cm，得到的比率约为 2.3，与通过纳米孔测量得到的比率非常接近。有趣的是，这一趋势可以用一个简单的尺度论点来解释。电导率 σ 与离子迁移率 μ 成正比（σ ∝ μ），而离子迁移率又与溶剂粘度 η 成反比。因此，σ(T) ∝ 1/ η(T)，两个温度 T1 和 T2 的电导率比率可以表示为 ??(??2)??(??1)≈??(??1)??(??2)σ(T2)σ(T1)≈η(T1)η(T2)。

图 1. 纳米孔的完整性以及离子传输的有效能量屏障的测量。(a) α-HL（圆圈）和 Ael（三角形）纳米孔的电导率作为温度的函数。(b) α-HL 纳米孔电导率的对数 ln(G) 作为逆温度的函数。(c) AeL 纳米孔电导率的对数 ln(G) 作为逆温度的函数。实线对应于形式为 y = bx + a 的线性拟合。对于 α-HL，b = ?1994 ± 28.6，a = 7.7047 ± 0.0961；对于 AeL，b = ?2198 ± 55.7，a = 7.9538 ± 0.191。开放孔电导率测量重复了三次。误差条代表三次独立实验的标准偏差。误差条比使用的符号小；它们不太明显。

使用已知的水的粘度 η(5 °C) ≈ 1.5 mPa·s 和 η(45 °C) ≈ 0.6 mPa·s，可以得到 ??(45C?)??(5C?)≈??(5C?)??(45C?)≈1.50.6≈2.5σ(45C°)σ(5C°)≈η(5C°)η(45C°)≈1.50.6≈2.5，这与通过纳米孔测量得到的值非常吻合。电导率对温度的依赖性略显非线性，α-HL 的平均增加约为每 °C 2%，Ael 的平均增加约为每 °C 2–3%。这种行为与体电解质电导率的温度依赖性非常接近，强烈表明在这个范围内温度不会改变孔的结构或尺寸。为了进一步量化温度依赖性，使用 Arrhenius 模型对图 1 中的实验数据进行了拟合 ??～??0exp(?Δ????B??)G～G0exp?(?ΔEkBT)（图 1b,c），得到了离子进入纳米孔的有效能量屏障 ΔE，对于 α-HL 约为 ΔE = 6.7 ± 0.1 kBT，对于 Ael 约为 ΔE = 7.4 ± 0.2 kBT。使用一个简单的尺度论点，其中孔长度 l 和半径 r 被视为主要几何参数，能量屏障可以估计为 Δ??≈??B??????ΔE≈kBTlr。尽管这个简化表达式忽略了电静力相互作用和离子在孔入口处经历的电势梯度，但它预测的能量屏障大约为 5–8 kBT。这个估计与从 Arrhenius 拟合中提取的值相符。之前也有报道其他纳米孔中离子进入的能量屏障类似，包括在 1 M KCl 和 40 mV 下线粒体 TOM 通道的 ΔE ≈ 6 kBT，(52) 以及在 120 mV 应用电压下 Aerolysin 纳米孔的 ΔE ≈ 5 kBT，(53)，进一步支持了我们分析的有效性。

用于识别和量化多分散 PEG 中不同物种大小区分的指标
图 2a 显示了用于探测不同摩尔质量的 PEG 与 α-HL 和 Ael 纳米孔相互作用的实验装置示意图。图 2b 显示了 PEG 与纳米孔相互作用时记录的典型电流 trace。用于识别和量化这里研究的多分散 PEG 的大小区分的指标基于散点图的形状及其对应的直方图（图 2c），这些数据来自对 PEG 引起的电流阻塞事件的统计分析（图 2b）。平均开放孔电流值 I0 = 138.36 ± 3.26 及其标准偏差 σ0 是通过对开放孔电流 trace 的高斯拟合得到的。电流阻塞的检测基于双阈值方法：(42,54) 当纳米孔电流值小于第一个电流阈值 Th1 = I0 – 4σ0 时，电流阻塞事件开始；当纳米孔电流恢复到大于 Th1 的值时，事件结束。如果事件期间的平均电流值大于第二个电流阈值 Th2 = I0 – 5σ0，则该事件不被视为 PEG 引起的电流阻塞而被拒绝。散点图中的每个点对应于单个聚合物链与纳米孔相互作用产生的单个电流阻塞。用于识别和量化多分散PEG中存在的不同PEG物种的指标。(a) 用于探究不同摩尔质量的PEG与α-溶血素（左）和aerolysin（右）纳米孔相互作用的实验装置示意图。(b) 在KCl 3 M Tris 25 mM pH = 7、+50 mV和25°C的条件下，通过含有多分散PEG 1500 g·mol-1（34个单体）的α-溶血素纳米孔记录的典型电流随时间的变化曲线。左侧轴表示电流I的值，右侧轴表示相对电流I/I0的值。电流曲线的放大图显示了不同幅度和持续时间的典型电流阻塞现象。(下图) 典型电流阻塞事件的示意图。PEG与纳米孔的相互作用表现为电流从开孔电流I0部分且暂时降至阻塞电流Ib。电流阻塞持续时间Δt对应于PEG与纳米孔相互作用的持续时间。(c) (上图) 相对阻塞电流Ib/I0值的直方图（黑线）；(下图) 根据相对电流绘制的电流阻塞点散点图（红点）。直方图显示至少存在18个不同的群体，这些群体对应不同的优选相对阻塞电流值，从而可以量化多分散PEG中存在的不同PEG物种，范围从PEG (24)到PEG (41)。绿线是对参考群体（PEG 28）的高斯拟合。箭头有助于区分不同的群体。典型的相对平均残余电流Ib/I0直方图的组距为0.002。(d) 在Ael（空心圆）和α-HL（黑圆）的情况下，电流Ib/I0值作为单体单元（μ）的函数。当散点图显示出明显且分离良好的点群时，可以实现尺寸区分（图2c）。每个群体对应一个特定的PEG物种，其特征是一个名义上的相对电流值Ib/I0，其中Ib是阻塞期间的平均残余电流，I0是开孔电流（图2d和表SI 2）。为了识别多分散样品中存在的不同PEG物种，我们使用了由28个单体组成的单分散聚合物PEG 28（1251 g·mol–1）的相对电流值Ib/I0作为参考，这遵循了先前的研究(33,35,36)。由于PEG 28在散点图中的位置是已知的，因此它可以作为校准点，以单分子分辨率分配所有PEG物种的位置。散点图中PEG 28群体的位置由绿色箭头标示，其他物种的位置由黑色箭头标示(图2c)。通过使用高斯拟合从相对电流直方图中提取PEG物种的Ib/I0值(图2)。对于α-溶血素，参考值Ib/I0 = 0.2607 ± 0.0003，与参考文献(35)一致；而对于aerolysin，参考值Ib/I0 = 0.4370 ± 0.0003。利用这个参考值，可以以单分子分辨率识别和量化多分散样品中存在的所有PEG物种(图2和表SI 2)。相反，当没有观察到明显的群体（分布广泛）时，则无法实现尺寸区分。此外，纳米孔能够以亚道尔顿的精度区分质量相同的聚合物(55)。已经证明，在高盐浓度的条件下，无论是α-HL还是aerolysin形成的纳米孔都能够区分相差一个单体单位（1 μ）的短链多分散聚乙二醇（PEG）分子(33,36)。具体来说，在4 M KCl溶液中，Aerolysin纳米孔能够区分短链多分散PEG 34 μ（1500 g·mol–1）溶液中的31种PEG物种，范围从PEG 17 μ（748 g·mol–1）到PEG 47 μ（2068 g·mol–1），最佳跨负电压为-120 mV(36)。而在相同的盐浓度（4 M KCl）下，α-HL纳米孔只能在最佳跨正电压+40 mV的情况下区分短链多分散PEG 34 μ（1500 g·mol–1）溶液中的25种PEG物种，范围从PEG 24 μ（1056 g·mol–1）到PEG 48 μ（2112 g·mol–1）(33)。有趣的是，通过提高温度，使用α-HL纳米孔可以区分大分子PEG的尺寸范围扩展到PEG 77 μ（3400 g·mol–1）(38)。为了检查温度效应是PEG/α-HL系统特有的还是更普遍的现象，我们决定比较研究不同平均摩尔质量的多分散PEG混合物（PEG 1500 g·mol–1、PEG 2000 g·mol–1和PEG 3400 g·mol–1）在3 M盐浓度下通过α-HL和Aerolysin纳米孔的尺寸区分效应，每个纳米孔的最佳应用电压分别为α-HL的+50 mV和Aerolysin的-100 mV或-140 mV（除非另有说明）。所有测量都是使用电生理实验进行的（实验配置见图2a和SI 1）。通过向跨室添加PEG分子来探测PEG-α-HL相互作用，而通过向顺室添加PEG来研究PEG/Aerolysin相互作用（图2a）。在我们的实验条件下，当PEG添加到Aerolysin的跨室时没有观察到显著的电流阻塞，这与先前的报告一致(25,36)。选择高盐浓度（3 M KCl）、聚合物添加侧以及应用电压（α-HL为+50 mV，Aerolysin为-100 mV或-140 mV）是为了促进强烈的PEG-纳米孔相互作用，并允许与早期研究直接比较(35,38,56)。图3a显示了在3 M KCl溶液中，三种不同温度下记录的PEG 1500 g·mol–1与α-HL相互作用的典型电流轨迹。相应的阻塞持续时间与相对残余电流（Ib/I0）的散点图分别展示在图3b和SI 3中。图3c总结了PEG 1500 g·mol–1与α-HL和Aerolysin相互作用的阻塞频率和阻塞持续时间的温度依赖性。如记录的电流轨迹所示，PEG分子在整个研究温度范围内都能与两个纳米孔相互作用。对于Aerolysin在-100 mV时，虽然观察到了清晰的电流阻塞，但阻塞持续时间与Ib/I0的散点图并没有显示出明显的群体（图SI 3b）。相比之下，在-140 mV时出现了不同的群体（图SI 3c）。对于α-HL，在所有研究温度下都观察到了明确定义的群体。这些群体对应于多分散PEG 1500 g·mol–1样本中存在的不同分子物种。对于两个纳米孔，阻塞频率随温度呈指数增长（热波动占主导），而平均阻塞持续时间则呈指数下降。温度的升高可能会减少阳离子的结合，从而导致聚合物-纳米孔相互作用减弱，这与Reiner等人的先前的工作一致(56)。图3显示了温度对PEG 1500 g·mol–1通过α-HL和Aerolysin纳米孔尺寸区分的影响：(a) PEG 1500 g·mol–1通过α-HL和Aerolysin纳米孔的典型单通道电流轨迹。(b) PEG 1500 g·mol–1通过α-HL和Aerolysin纳米孔的阻塞持续时间与相对残余电流Ib/I0的散点图。(c) PEG 1500 g·mol–1在-100 mV（白色三角形）和-140 mV（黑色三角形）下的阻塞持续时间和阻塞频率，作为温度的函数。所有记录都在pH = 7的25 mM Tris缓冲的3 M KCl溶液中进行。PEG 1500 g·mol–1被添加到α-HL的跨室，应用电压ΔV = +50 mV；而PEG 1500 g·mol–1被添加到Aerolysin的顺室，应用电压ΔV = -140 mV。误差条代表三个独立实验的标准偏差。记录的事件数量在1000到20,000个之间。对于所有实验，我们验证了孔径电导随温度的变化遵循图1和表SI 1中呈现的校准曲线。这确保避免了由于缓冲液蒸发引起的任何效应。具体来说，对于α-HL，在40°C的温度区间内，阻塞频率大约增加了20倍，而对于Aerolysin则增加了约6倍。相反，对于Aerolysin，在相同的温度范围内，平均阻塞持续时间大约减少了14倍，而对于α-HL仅减少了2倍。因此，随着温度的升高，PEG通过α-HL引起的阻塞逐渐缩短，而在Aerolysin的情况下减少得更快。结果，随着温度的升高，Aerolysin散点图中PEG引起的群体的分辨率逐渐降低。对于α-HL，尽管随着温度从5°C升至45°C，群体之间的距离逐渐接近，但在最高研究温度下仍然可以区分不同的群体。相比之下，对于Aerolysin，强烈的温度诱导的阻塞持续时间缩短导致了分辨率的显著损失。最后，虽然在低温（5°C）下，PEG 1500 g·mol–1通过Aerolysin在-100 mV下引起的平均阻塞持续时间与通过α-HL观察到的相当，但在相应的Aerolysin-100 mV散点图中无法区分出明显的群体（图SI 3b）。有趣的是，将应用电压增加到-140 mV可以恢复群体的分辨率（图3b），这突出了电场在增强Aerolysin纳米孔尺寸区分中的关键作用。已经证明，在高盐浓度（3 M KCl）下使用α-HL纳米孔的实验中，提高温度可以区分多分散PEG 3400 g·mol–1溶液中的各个分子物种。在室温下，这种区分是不可实现的，主要是因为聚合物链无法完全适应纳米孔(38)。在较高温度下出现尺寸区分的原因归因于PEG溶解度的降低和PEG链的温度诱导塌陷，导致更紧凑的构象能够进入纳米孔。为了确定这种温度诱导的尺寸区分效应是PEG-α-HL系统特有的还是更普遍的纳米孔独立现象，我们使用α-HL和Aerolysin纳米孔进行了PEG 2000 g·mol–1和PEG 3400 g·mol–1的尺寸区分温度依赖性的比较研究。图4a和5a分别显示了在3 M KCl溶液中，PEG 2000 g·mol–1和PEG 3400 g·mol–1在跨正电压+50 mV和跨负电压-140 mV下与α-HL和Aerolysin相互作用的典型电流轨迹。相应的阻塞持续时间与相对残余电流（Ib/I0）的散点图分别展示在图4b（PEG 2000 g·mol–1）和图5b（PEG 3400 g·mol–1）中。阻塞频率和阻塞持续时间的温度依赖性总结在图4c和5c中。对于两种PEG尺寸和两个纳米孔，事件频率随温度升高而增加，这与之前观察到的PEG 1500 g·mol–1的行为一致（图3）。对于α-HL，温度的升高显著提高了PEG引起的电流阻塞的分辨率。在25°C以上，多分散PEG 2000 g·mol–1样本中的个别PEG物种的尺寸区分开始出现；而在PEG 3400 g·mol–1中，只有在45°C时才观察到尺寸区分（图4b和5b）。相比之下，在-100 mV的Aerolysin纳米孔下，在此温度范围内未检测到PEG 2000 g·mol–1或PEG 3400 g·mol–1的尺寸区分（图SI 4和SI 5）。相反，在Aerolysin中，只有在25°C以下观察到尺寸区分，在最低研究温度（5°C）下，高电压ΔV = -140 mV时区分效果最佳（图4b和5b）。温度对PEG 2000 g·mol–1通过α-HL和Ael纳米孔大小分离的影响：(a) PEG 2000 g·mol–1通过α-HL和Ael纳米孔的典型单通道电流迹线。(b) PEG 2000 g·mol–1通过α-HL和Ael纳米孔的阻塞持续时间与相对剩余电流Ib/I0的散点图。(c) PEG 2000 g·mol–1通过α-HL（圆圈）和Ael（白色和黑色三角形分别代表?100和?140 mV）引起的阻塞持续时间及阻塞频率随温度的变化。所有记录均在pH = 7的3 M KCl溶液中进行，使用25 mM Tris缓冲。PEG 2000 g·mol–1加入α-HL的传递侧并施加电压ΔV = +50 mV，而PEG 2000 g·mol–1加入Ael的亲和侧并施加电压ΔV = ?140 mV。误差条代表三次独立实验的标准偏差。记录的事件数量在1000到20,000个之间。

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图5 温度对PEG 3400 g·mol–1通过α-HL和Ael纳米孔大小分离的影响：(a) PEG 3400 g·mol–1通过α-HL和Ael纳米孔的典型单通道电流迹线。(b) PEG 3400 g·mol–1通过α-HL和Ael纳米孔的阻塞持续时间与相对剩余电流Ib/I0的散点图。(c) PEG 3400 g·mol–1通过α-HL（圆圈）和Ael（白色和黑色三角形分别代表?100和?140 mV）引起的阻塞持续时间及阻塞频率随温度的变化。所有记录均在pH = 7的3 M KCl溶液中进行，使用25 mM Tris缓冲。PEG 3400 g·mol–1加入α-HL的传递侧并施加电压ΔV = +50 mV，而PEG 3400 g·mol–1加入Ael的亲和侧并施加电压ΔV = ?140 mV。误差条代表三次独立实验的标准偏差。记录的事件数量在1000到20,000个之间。

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从定量上看，两种纳米孔的阻塞频率对温度的依赖性有显著差异，并且这种依赖性强烈依赖于PEG的大小。对于Ael纳米孔，PEG 1500 g·mol–1的阻塞频率在40 °C区间内增加了约6倍（见图3c），PEG 2000 g·mol–1增加了16倍（见图4c），PEG 3400 g·mol–1增加了43倍（见图5c）。对于α-HL纳米孔，相应的增加幅度分别为PEG 1500 g·mol–1约20倍，PEG 2000 g·mol–1约9倍，PEG 3400 g·mol–1约30倍。阻塞持续时间对温度的依赖性也显示了纳米孔和聚合物大小之间的明显差异。对于Ael纳米孔，所有PEG的阻塞持续时间都随温度升高而减少，PEG 1500 g·mol–1在40 °C内减少了14倍，PEG 2000 g·mol–1减少了7倍，而PEG 3400 g·mol–1几乎不受温度影响（见图3c、4c和5c）。相比之下，PEG 1500 g·mol–1在α-HL中的阻塞持续时间随温度升高而减少，而较大PEG在Ael中的阻塞持续时间却随温度升高而增加。具体来说，PEG 2000 g·mol–1在40 °C内阻塞持续时间增加了约1.6倍，PEG 3400 g·mol–1增加了近两个数量级（约86倍）（见图4c和5c）。

这些对比趋势揭示了α-HL和Ael中PEG-纳米孔相互作用机制的根本差异。在α-HL中，高温促进了聚合物的压缩和滞留时间的延长，这对于大分子的尺寸分离至关重要。而在Ael中，大分子的尺寸分离仅在低温和高施加电压下实现，此时电场克服了与部分插入相关的熵障，使得整个链被限制并延长了滞留时间。这种行为表明，α-HL中的PEG限制是热力学稳定的，而在Ael中则是通过场诱导的力实现的。

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纳米孔结构的强烈依赖性突显了孔几何形状和静电场在控制聚合物静态和动态中的关键作用，尽管在其他条件相同的情况下也是如此。值得注意的是，两种纳米孔的驻留时间对电压的依赖性有显著差异。在α-HL中，驻留时间对电压呈现非单调依赖性，在40 mV附近达到最大值后开始减少，这与先前的报告一致。相比之下，在Ael中，我们也观察到类似的非单调行为，但最大值发生在更高的电压（约?180 mV）（见图SI 6和SI 7）。在这两种纳米孔中，大分子无法被分离的原因是由于限制不完全，部分聚合物留在孔外，像一个熵弹簧一样阻碍进一步进入（见图6顶部）。

众所周知，特别是在高盐浓度下，PEG可以通过与醚氧原子的配位来结合阳离子，通常涉及聚合物主链上的多个氧原子。因此，PEG表现为一种带弱电荷且柔性的聚合物，施加的电场通过克服熵恢复力来促进其进入。对于一个由N个分子组成的理想链，其线圈尺寸可表示为R = aN^(1/2)。对于PEG 3400 g·mol–1（N = 77），这导致R ≈ 3 nm，超过了aerolysin孔的直径（D ≈ 1.7 nm）。这表明仅凭热波动不足以将聚合物完全限制在孔内（见SI第6和第10节）。然而，在足够强的电场下，聚合物可以克服相关的自由能障碍并占据整个孔体积。假设被限制的聚合物采取“珍珠项链”构象，即直径与孔直径相当的一系列小球体（见图SI 8），每个小球体的分子数量为g = (D/a)^2 ? 26，从而产生轴向扩展R∥ = (N/g)D ? 5 nm，小于孔的长度L ≈ 8 nm（见图6底部）。这表明，在场诱导的限制下，整个PEG 3400链可以被aerolysin容纳，前提是R∥ < L，这对于尺寸分离是关键的。

如果我们假设PEG链表现为排除体积的线圈，那么每个小球体的分子数量变为g = (D/a)^(5/3) ? 15，导致轴向扩展R∥ ? 9 nm，略长于孔的长度。这种情况是可能的，因为它很好地解释了我们的实验观察结果。具体来说，Ael中多分散PEG 3400的散点图显示，在高Ib/I0值处存在低质量物种的群体，表明较大质量的物种仍被排除在外。在更高的电压ΔV = ?200 mV下，这些高Ib/I0群体消失（见图SI 7），因为它们的驻留时间减少了，而较大质量PEG物种的驻留时间则继续增加，直到大约?180 mV。然而，在这种范围内没有观察到明显的尺寸分离，因为阻塞达到了饱和状态。总的来说，这些观察结果表明，Ael中的聚合物限制主要是由施加的电场驱动的，而不是由线圈-球体转变引起的，因为在室温或更低温度下尺寸分离得以恢复。相比之下，在45 °C下使用α-HL进行的实验显示，在低Ib/I0值处有明确的群体，这与孔内较大PEG 3400物种的折叠构象一致。

需要注意的是，理想链模型和排除体积线圈描述之间的选择原则上可以通过评估Flory指数γ来确定，该指数可以从扩散限制的捕获率k0（即在无电压施加情况下的捕获率）得出。通过测量不同分子量的PEG的k0，并将捕获率作为链长N的函数绘制出来，可以预期一个比例关系k0 ～ D^diffusion ～ N^(-γ)。然而，在这里研究的分子量范围内，拟合的精度不足以明确确定指数。在之前的工作中，使用了几种PEG大小的数据，数据使用γ = 3/5进行了拟合。

这里提到的线圈-小球体转变是预期之中的，鉴于系统的物理特性。这些特性包括聚合物大小与孔直径的比例R/Dpore、聚合物的高灵活性（表现为与单体大小相当的持久长度lp ? a）、aerolysin孔的长轮廓长度Dpore/lp，以及聚合物的弱电荷性质。这些性质与未折叠蛋白质的相似，后者在纳米孔相互作用期间被报道为采取小球体状构象。这样的构象阻止了严格的单文件传输，从而复杂化了蛋白质中的氨基酸序列读取或当聚合物作为分子存储支持时的信息恢复。要实现对柔性聚合物的单文件配置，需要满足几何和能量限制：孔径必须接近聚合物的持久长度，并且必须施加一个强大的外力来拉伸链。这种驱动力可能来自电泳传输（如本工作中所示）、电渗透流（Jc ～ kBTη），或者在半稀释聚合物溶液中的渗透压Π（Π ≈ kBTξ^3），其中ξ表示聚合物网络的网孔大小。对于固态纳米孔，临界溶剂流或渗透压驱动的传输更为适用，因为它涉及可以迫使聚合物进入狭窄孔的大压力。在后一种情况下，当网孔大小满足ξ ≤ Dpore时，预计聚合物会穿透。对于ξ ? Dpore ? 1 nm，估计的压力Π ≈ 40 bar对于含有聚合物溶液的一侧的脂质膜来说太大而无法承受。

将受限的聚合物视为熵弹簧（见支持信息部分S7中的熵弹簧模型），并假设在限制力f下的延伸R?遵循线性响应关系R? = (N/a^23kBT)，这里kB是玻尔兹曼常数，T是绝对温度。相对延伸R? = R? / (N^1/2a) ≈ 0.6，因此我们估计f ? 1.8 kBT/N ≈ 2^(-12)，这与单分子实验中通常涉及的力相当。有趣的是，一个简单的比例论证也得出了相同的估计：以kBT作为相关能量尺度，孔径Dpore作为相关长度尺度，可以得到R? ≈ 2^(-12N)，这与上述计算结果一致。热力学参数与PEG-纳米孔相互作用有关，是从解离常数koff(s–1) = 1/τoff的温度依赖性中提取的。Eyring过渡态公式为koff = kBTh^exp(?ΔG/τoff)，其中ΔG = ΔH – TΔS，ΔS量化了与聚合物限制相关的构象自由度的损失。表SI 3显示，对于两种纳米孔，解离焓ΔH随着PEG分子量的增加而系统性地减少，表明较长聚合物在限制下的稳定性增强，这与滞留时间的增加一致。尽管较大的聚合物在限制下预期会经历更大的熵惩罚，但这种效应被更强的焓贡献所补偿。特别是，较长的PEG链提供了更多的醚氧位点用于阳离子配位，从而实现了协同稳定。因此，聚合物-离子-孔相互作用占主导地位，这与观察到的滞留时间增加一致。

在α-HL中，ΔH变为负值，ΔS强烈为负，表明解离受熵限制，以及限制引起的LCST降低。相比之下，aerolysin主要表现出正的ΔH，这与场稳定的限制而非热力学驱动的限制一致。结合活化自由能ΔG是从结合常数kon的斜率α中提取的，通过绘制ln kon与1/T的图像得出，假设Arrhenius行为（见图SI 12–14）。ΔG由结合活化自由能ΔG = αkB得出，例如对于最大的PEG（3400），在α-HL中ΔG ? 27 kBT，在AeL中ΔG ? 9 kBT。限制能量ΔGconf（见支持信息中的第S10节）可以通过一个简单的比例论证来评估，考虑到活化自由能随着链长的增加而线性增长ΔGconf(N) ～ N，因此ΔGconf可以直接从驻留时间的斜率中得出，假设Arrhenius行为。在α-HL的情况下，这项分析得出Δ????B??=0.08??ΔGkBT=0.08N；而在Ael的情况下，Δ????B??=0.05??ΔGkBT=0.05N。对于PEG 3400，当N=77时，其在α-HL中的ΔG约为6.2 kBT，在AeL中为3.8 kBT。有趣的是，基于随机行走和量子粒子轨迹类比的简单尺度论证能够定性地捕捉到不同聚合物和孔道的限制自由能。（60）理想链在直径为D的孔道中的限制自由能遵循以下规律：??conf～??B??????2??2。这种尺度关系源于海森堡不确定性原理对限制能量的1/D2依赖性，以及理想链在纳米孔道中包含????2??2大小的颗粒。通常，如果一个由单体a组成的理想柔性PEG链包含77个单体，且这些单体的大小为0.35纳米，当这个链被限制在直径为1.7纳米的孔道中时，其限制自由能Econf约为4 kBT，这与此处测量的PEG 3400的自由能非常吻合。为了进一步评估孔道几何形状和静电效应的影响，我们研究了当聚合物从α-HL纳米孔道的顺式侧（前厅侧）引入时的传输情况（图7）。在这些条件下，在较高温度下没有观察到明显的阻塞现象。尽管PEG的阻塞持续时间随温度升高而增加，但这种效应比从反式侧添加PEG时要弱得多，即使水的化合作用会随温度降低而减弱。这些观察表明，进入孔道的一侧——与不同的限制程度（通过反式侧的限制较高，通过顺式侧的限制较低）以及不同的静电环境（表面电荷分布）有关——是大型PEG区分大小的关键决定因素。

图7. 大型PEG的尺寸区分与几何形状和静电效应的关系：(a) PEG 3400在顺式侧（白色圆圈）和反式侧（黑色圆圈）通过α-HL的阻塞持续时间随温度的变化。误差条代表三次独立实验的标准差。(b, c) 在25°C（b）和45°C（c）时，PEG 3400通过α-HL的阻塞持续时间与相对残余电流Ib/I0的散点图。红色点表示从反式侧添加的PEG，黑色点表示从顺式侧添加的PEG。实验在3 M KCl、25 mM TRIS、pH=7、-50 mV（顺式侧）或+50 mV（反式侧）的条件下进行。

高分辨率图像

PEG在α-溶血素和aerolysin中的限制效应在统一的自由能框架内可以解释，即Δ??=Δ??hydration???Δ??+Δ??confinement+Δ??surface。在α-溶血素中，狭窄的β-桶状几何结构对线圈构象施加了显著的熵惩罚，ΔGconfinement > 0，而有利的聚合物-孔道相互作用提供了稳定的表面贡献ΔGsurface < 0。随着温度的升高，PEG的水合作用减弱，降低了有利的水合作用焓ΔHhydration，使得限制和表面项在自由能平衡中占主导地位，从而使最小值向紧凑的球形构象偏移。这种限制引起的LCST（玻璃化转变温度）的降低促进了整个链在孔道中的占据，实验上表现为阻塞持续时间的显著增加，从而在较高温度下增强了大型PEG的尺寸区分能力。相比之下，在aerolysin中，限制自由能项的平衡不同：尽管几何限制仍然显著，但由于水合作用的减弱，聚合物-孔道相互作用不足以稳定折叠构象。因此，所有大小的PEG的阻塞持续时间都随着温度的升高而减少，这反映了聚合物的动力学行为加快，而不是热力学稳定。因此，在aerolysin中，全链限制主要在低温和高施加电压下实现，此时强电场迫使聚合物进入孔道并克服了不利自由能平衡。这些结果揭示了两种不同的限制机制——α-溶血素中的热力学驱动限制和aerolysin中的场诱导限制——表明温度诱导的线圈到球形转变以及增强的尺寸区分能力是特定于纳米孔道的，而不是普遍性的（图SI 16）。

未来研究可以通过探索不同类型的纳米孔道（包括生物纳米孔和固态纳米孔）以及Hofmeister系列中变化的盐种类，在宽浓度和温度范围内，精确调节聚合物的溶解度和限制。这样的研究将有助于我们更好地理解限制条件下的LCST降低。

结论

在这项工作中，我们研究了温度、驱动力和纳米级限制如何共同调节非离子聚乙二醇（PEG）在蛋白质纳米孔中的传输和尺寸区分。通过比较不同摩尔质量（1500、2000和3400 g·mol–1）的PEG与两种具有不同几何形状和表面电荷的β-桶状纳米孔（α-溶血素和aerolysin）在宽温度范围内的相互作用，我们证明了温度以高度特定于纳米孔的方式调节PEG的行为。我们发现，温度的升高不会改变纳米孔的结构，但会显著影响PEG-纳米孔的相互作用动力学。在α-溶血素中，较高温度显著增加了较大PEG的阻塞持续时间，使得PEG 2000在25°C以上、PEG 3400在45°C时能够有效区分尺寸。尽管我们的观察是基于传输动力学而非直接的LCST测量得出的，但这一行为与限制引起的LCST降低一致，即在较高温度下PEG的水合作用减弱，使得限制和表面相互作用项在自由能平衡中占主导地位，有利于紧凑构象和整个链在孔道中的占据。相比之下，aerolysin表现出相反的温度依赖性：所有大小的PEG的阻塞持续时间都随着温度的升高而减少，表明聚合物的动力学行为加快，而不是热力学稳定。在这种情况下，只有在低温和高施加电压下才能实现全链限制，此时强电场迫使聚合物进入孔道。这些对比行为可以在一个统一的自由能框架内得到合理解释，该框架平衡了水合作用、熵、限制和表面相互作用的贡献。我们的结果揭示了两种不同的限制机制：α-溶血素中的热力学驱动限制和aerolysin中的场诱导限制。重要的是，我们没有发现任何证据表明在α-溶血素中从顺式侧进入孔道时会发生经典的体相中的线圈到球形转变。相反，在高度限制和高盐条件下，温度依赖的局部脱水和纳米孔特定的相互作用景观决定了PEG的停留时间和传输动力学。

实验部分

使用的聚合物

本研究中使用了平均摩尔质量为1500、2000和3400 g·mol–1的多分散聚乙二醇（PEG）。最终PEG浓度保持在100 μM以下，以确保实验处于稀释状态，远低于聚合物的重叠浓度。假设水是PEG的良好溶剂，使用以下关系估计了重叠浓度：???(??cm3)=??(??mol)×43????3g(cm3)×??A(mol?1)=??(??mol)×43??(??6??√·??0.6)3(cm3)×??A(mol?1)≈6N?0.8，其中Na表示摩尔数，Rg表示聚合物在水溶液中的回转半径。回转半径的计算公式为??g(nm)=0.146N0.6Rg(nm)。PEG的摩尔质量、使用的聚合物尺寸、实验浓度和估计的重叠浓度总结在表1中。

表1. 实验数据摘要

| PEG种类 | N | Rg (nm) | C* (w/v) (%) | CPEG (α-HL) (%) | CPEG (Ael) (%) |
|---------|------|---------|------------|------------|
| 1500 | 34 | 1.18 | 350.75 × 10–23 | 2000 | 451.40 |
| 2000 | 45 | 1.40 | 28×10–4 | 3400 | 77 |
| | | | 1.93 | 184×10–2 | 6.8×10–4 |

N表示重复单元的数量，Rg表示聚合物在水溶液中的回转半径，C*表示聚合物的重叠浓度。CPEG (α-HL)是在α-HL纳米孔实验中使用的最终聚合物浓度，而CPEG (Ael)是在AeL纳米孔中使用的最终聚合物浓度。单个PEG重复单元的摩尔质量为44 g·mol–1。

Aerolysin的生产

Aerolysin是一种来自Aeromonas hydrophila的孔形成毒素，以前体蛋白proaerolysin（ProAeL）的形式产生，ProAeL会形成可溶性的二聚体。重组野生型ProAeL在Esherichia coli BL21中使用pET22b-PA载体生产。ProAeL在IPTG诱导后产生并定位在细菌的周质中。含有可溶性ProAeL二聚体的周质部分通过渗透冲击提取。由于重组蛋白C末端带有His标签，ProAeL进一步使用Ni-Sepharose MiniSpin柱进行亲和层析纯化，并通过加入imidazole进行洗脱。重组ProAeL的纯度（约99%）通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Coomassie blue染色确定。ProAeL的浓度通过280 nm处的光吸收值估计。ProAeL（3 μg）在25 mM HEPES、pH 7.5的条件下用0.25单位的胰酶-琼脂糖处理30分钟，在25°C下激活。

纳米孔记录

所有实验（α-HL或Aerolysin）均使用了一种垂直的脂质双层电生理装置（Warner Instruments，Hamden, CT，USA）。脂质双层是通过在Teflon支撑物上涂覆并自发稀化一层二苯酰磷脂（DPhPC，Avanti Polar Lipids，Alabaster, AL，USA）形成的，膜孔径为150 μm，将顺式和反式室分隔开。膜两侧的水溶液含有1 mL 3 M KCl，缓冲在25 mM TRIS中，pH为7（Merck，Darmstadt，Germany）。使用两个匹配的Ag/AgCl电极（Alfa Aesar，Ward Hill，MA，USA）在膜上施加毫伏电压并测量离子电流。顺式室定义为虚拟地。形成脂质双层后，将α-HL或活化的aerolysin以约50 ng/mL的最终浓度添加到顺式室中。一旦形成单个纳米孔，将PEG溶液添加到反式室（PEG - α-HL）或顺式室（PEG - AeL）中。

单通道电流记录使用Axopatch 200B膜片钳放大器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）在全细胞模式下进行，配备CV-203BU头端。信号使用内部的4极贝塞尔滤波器在10 kHz的截止频率下过滤。数据以100 kHz的速率使用DigiData 1440 A/D转换器（Molecular Devices）数字化，并由Clampex 10.2软件（Molecular Devices）控制。溶液温度由Peltier装置控制，该装置连接到一个双极温度控制器（CL-100，Warner Instruments）和液体冷却系统（LCS-1，Warner Instruments）。

数据分析

数据分析使用Igor Pro 6.12A软件（WaveMetrics，OR，USA）和内部程序（图SI 17）进行。该方法依赖于对多分散PEG引起的电流阻塞特性的统计分析，涉及至少数百（通常是数千）个事件。在纳米孔电流与时间记录中检测每个单独的电流阻塞是基于单电流阈值（Th）方法。当电流幅度小于Th时检测到阻塞事件，直到其值再次大于Th。阻塞的开始定义为电流首次增加的点，之后逐渐减小到Th以下；阻塞的结束定义为电流最后一次减小到Th以上的点。这定义了用于计算阻塞特征量的点范围，如停留时间tb、平均残余电流值Ib和残余电流的标准差σb。这里，Th = I0 – 5σ0，其中I0和σ0分别是开放孔电流分布的高斯拟合的平均值和标准差。

平均阻塞持续时间通过用单指数函数拟合阻塞持续时间分布来确定。平均阻塞频率通过用单指数函数拟合连续事件之间的时间间隔分布来确定（见图2和SI 17）。