在3D打印辅助下制造的微纳器件，能够在高密度成纤维细胞培养环境中揭示出层次化与时间相关的机械传感现象

《ACS Nano》：3D-Printing-Assisted, Microfabricated Devices Reveal Hierarchical and Temporal Mechanosensing in High-Density Fibroblast Culture

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理解细胞如何在多个方向、长度尺度和时间尺度上整合机械力仍然是机械生物学中的一个基本挑战。这在伤口愈合的背景下尤为重要，因为成纤维细胞向肌成纤维细胞转变的时间和持续时间可以决定愈合的结果。在这里，我们发现组织中的成纤维细胞通过一个层次化的时间级联反应来响应应力的方向各向异性：首先是单个细胞的伸长（24小时），接着是集体排列（48小时），然后驱动α-平滑肌肌动蛋白的表达和肌成纤维细胞的转变（96小时）。为了实现这一发现，我们开发了一种改进的水凝胶辅助立体光刻弹性体（HASTE）原型平台，该平台加入了一种洗涤剂，可以提高聚二甲基硅氧烷弹性体对模板琼脂水凝胶的润湿性。这使得我们能够快速原型化具有微米级精度复杂的三维（3D）微柱阵列。使用这些微柱阵列与具有各向同性（8柱）和各向异性（4柱）边界条件的工程微组织，我们发现细胞在整体组织重组之前就能感知并响应应力方向。计算模型基于初始应力各向异性而非应力大小来预测稳态激活模式，而我们的实验表明达到这种状态需要在不同时间尺度上运行的连续的机械敏感过程。即使预期大量的细胞-细胞接触可能会掩盖基质介导的机械信号，这种时间层次结构仍然存在。我们的发现表明，成纤维细胞的机械感知涉及通过渐进的细胞和组织重组编码的机械记忆。这些结果为了解伤口愈合、纤维化以及工程功能性组织替代品提供了见解。

1. 引言
机械生物学中的一个基本问题不仅在于细胞感知哪些机械信号，还在于它们如何随时间和长度尺度整合这些信号以做出命运决策。活细胞存在于动态环境中，在这种环境中，通往机械平衡的路径可能与最终状态本身同样重要。这种机械感知的时间方面仍然知之甚少，尤其是在三维组织中，细胞必须在重塑其机械环境的同时协调它们的反应。

成纤维细胞就是这一挑战的例子。在伤口愈合和组织修复过程中，成纤维细胞在向肌成纤维细胞转变时会整合来自环境的机械线索，这一过程的特点是收缩性和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的增加。虽然这种成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变有助于伤口闭合，但其失调会导致纤维化。大量的文献已经证明，细胞外基质（ECM）的物理性质，特别是基质弹性和整体组织张力，是驱动这一转变的关键机械信号。然而，这些结果也可能取决于转变的时间，这种转变在短期的实验和伤口愈合时间内可能是可诱导的，并且可以持续存在。在二维培养中，TGF-β1或机械应变可以在几小时内诱导出原肌成纤维细胞特征，并在大约1-3天内检测到α-SMA的转录/蛋白质整合以及收缩性的增加，而在持续的刺激下，应力纤维的成熟和力的产生会在大约3-7天内进行。在体内的伤口修复中，肌成纤维细胞通常在受伤后的几天内在肉芽组织中出现，并在最初的1-2周内占据主导地位，如果愈合解决，则它们会消退；如果持续时间超过这个窗口，则与纤维化和疤痕收缩有关。这些时间线汇集了TGF-β信号传导、机械转导和基质环境的综合效应；持续的线索延长了肌成纤维细胞的状态，而它们的撤退则导致失活/凋亡和α-SMA应力纤维的丢失。然而，这些研究通常只关注机械输入的标量指标，如ECM硬度或张力大小，而没有考虑应力的方向性。即使在静止、未激活的状态下，成纤维细胞也是伸长的细胞。最近的研究表明，成纤维细胞不仅对机械应力的大小作出反应，也对力的方向性或各向异性作出反应。导致这种机械响应的时间序列尚未被确定，而且这些反应尚未在细胞-细胞接触与细胞-基质相互作用竞争的高密度组织中进行研究。

在这些组织中，集体收缩性、基质压缩和细胞-细胞相互作用可能会掩盖局部机械线索的作用，从而可能减弱张力各向异性的影响。或者，细胞可能保留了对应力方向性的内在敏感性，即使在大规模组织重组的情况下，这种敏感性仍然继续调节表型转换。为了解决这个问题，我们开发了一个能够在中施加强度各向同性或各向异性应力场的微制造平台。使用基于立体光刻印刷和水凝胶辅助成型的快速原型化方法，我们创造了用于在含有成纤维细胞的胶原基质上施加各向同性或各向异性边界条件的可变形微柱阵列。这些设备允许精确控制组织应力场。通过改变细胞密度和培养时间，并将实验观察与计算建模相结合，我们研究了细胞如何在模拟真实组织结构的条件下感知和响应各向异性机械环境。

我们的结果表明，张力各向异性控制着成纤维细胞激活过程中的不同事件序列：早期细胞伸长和排列的变化先于组织尺度的压缩，并最终导致与肌成纤维细胞转变相关的收缩蛋白上调。这些效应在不同的细胞密度下都很明显，并且即使在存在高水平的细胞-细胞接触和基质重塑的情况下也能持续存在。总的来说，这些发现表明应力各向异性是三维组织中成纤维细胞命运的关键调节因子，并为理解几何形状和力学如何协调修复和疾病过程中的成纤维细胞行为提供了框架。

2. 结果
2.1. Triton X-100修饰使得复杂3D微柱阵列的高保真制造成为可能
研究机械边界条件如何影响细胞行为需要对组织几何形状和机械约束进行精确控制。虽然微制造的组织量规（“micro-TUGs”）已被证明有助于测量细胞产生的力，但其制造通常需要成本高昂的光刻技术，并且设计灵活性有限。为了克服这一限制，我们采用了最近开发的HASTE（水凝胶辅助立体光刻弹性体）技术来创建类似于Legant等人首次描述的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微柱（图1a）。

图1
图1. 表面活性剂修饰的水凝胶成型技术能够可靠地制造出具有突出帽的高纵横比微柱。(a) HASTE（水凝胶辅助立体光刻弹性体）制造过程的示意图。3D打印的母模用作正模来创建琼脂水凝胶负模，然后用来浇铸PDMS装置。向琼脂（橙色）中添加0.2%的Triton X-100可以降低与疏水性PDMS之间的界面张力，从而使PDMS完全渗透到狭窄的模具特征中。(b) 比较不同方法制造的微柱结果的明场图像。没有Triton X-100时，PDMS无法完全填充模具腔体，导致微柱畸形或缺失且帽不完整。加入0.2%的Triton X-100后，可以一致地制造出具有完整突出帽的均匀微柱阵列（直径300 μm）。刻度尺：左，5 mm；右，100 μm。(c) 多批次的制造成功率量化（n = 10组基于微柱的装置，每组装置至少有96个单独的微柱，来自四个不同的PDMS批次）。Triton X-100的修饰提高了装置的成功率（p < 0.0001）。

HASTE使用3D打印的母模和水凝胶中间模具，实现了快速的设计迭代和复杂几何形状的成本效益型原型化。然而，制造具有突出帽的高纵横比微柱——这对于防止组织在收缩过程中的脱离至关重要——却是一个关键的技术挑战。疏水性PDMS预聚物难以渗透到水凝胶模具的狭窄通道中，导致特征不完整和制造失败频繁。我们假设这是由于亲水性琼脂和疏水性PDMS之间的界面能量不匹配，而在琼脂水中加入洗涤剂可以降低这种界面能量，从而改善PDMS对琼脂负模的总体润湿性。因此，我们将温和的洗涤剂Triton X-100以0.2%的浓度加入琼脂水凝胶中。这大大降低了疏水性PDMS与水凝胶之间的界面张力，显著提高了装置的成功率：标准的琼脂模具生产的微柱形状不佳或不完整，而Triton X-100修饰的模具则始终产生具有完整突出帽的明确阵列（图1b,c）。

立体光刻3D打印的灵活性，结合我们改进的成型协议，使我们能够方便地控制组织几何形状和微孔设计（图2f）。这种能力使我们能够研究不同的机械边界条件，特别是各向同性（8柱）与各向异性（4柱）配置，如何影响3D组织中的成纤维细胞行为和命运决策。

图2
图2. 含有成纤维细胞的胶原微组织在悬挂在柔顺微柱之间时经历细胞介导的压缩。(a) 示意图显示了4天培养过程中的渐进式组织重塑。嵌入胶原（1.5 mg/mL）中的成纤维细胞产生收缩力，使基质压缩，导致柔顺PDMS微柱（弹性模量130 kPa）向内变形。组织在24小时内从孔表面脱离，仅固定在突出的微柱帽上（使用BioRender创建）。(b–d) 4天培养后组织悬浮和微柱接触的环境扫描电子显微镜（E-SEM）验证。(b) 顶视图显示跨越8个柱子的压缩组织及其特征形态。(c) 侧视图。(d) 45°倾斜视图显示组织厚度和微柱帽周围的三维组织结构。(e) 光学相干断层扫描（OCT）横截面图像确认组织悬浮情况并量化组织厚度（100–200 μm）和孔内的垂直位置。微柱显示为垂直柱子，柱子之间可见组织桥接。(f) HASTE制造平台提供的设计多样性。不同微柱配置的代表性示例，包括4柱（中心各向同性/外围各向异性）、8柱（中心各向同性/外围各向异性）以及针对特定机械边界条件的定制几何形状。每种设计都保持相同的孔直径（3.26 mm）和微柱尺寸（直径200 μm，高度1.125 mm），同时改变空间排列。刻度尺：1 mm。

2.2. 工程微组织再现了成纤维细胞介导的胶原压缩和重塑
为了研究机械边界条件如何影响成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变，我们开发了一个3D培养系统，该系统捕捉了细胞与其细胞外基质在组织重塑过程中的动态相互作用。在伤口愈合过程中，成纤维细胞产生收缩力，重组胶原，形成一个机械反馈循环，驱动表型变化，包括细胞极化和α-SMA的上调。我们的微柱平台旨在施加受控的机械约束，同时允许细胞自由重塑其局部环境。当NIH/3T3成纤维细胞被嵌入我们的微孔中的I型胶原凝胶（1.5 mg/mL）中时，它们立即开始收缩并通过肌动蛋白-肌球蛋白产生的力重塑基质（图2a）。这种细胞介导的压缩逐渐增加了基质密度和纤维排列，特别是在细胞密度高的区域，那里增强的细胞-细胞机械通信放大了集体收缩性。重要的是，柔顺的微柱（弹性模量约为130 kPa）在组织收缩时向内变形，提供了机械阻力以及组织产生力的视觉显示。

环境扫描电子显微镜（E-SEM）显示，组织在24小时内完全从PDMS孔的底部和侧面脱离，仅固定在微柱的突出帽上（图2b–d）。这种悬浮配置通过光学相干断层扫描（OCT）成像得到确认（图2e），确保机械信号主要通过组织本身传递，而不是通过粘附到刚性基底上。组织在柱子之间形成了连续结构，压缩程度和柱子变形在4天的培养期间逐渐增加。我们制造方法的多功能性使我们能够系统地探索不同几何约束如何影响组织力学。通过改变微柱的数量和排列，我们可以在保持相同培养条件和初始组织体积的情况下施加各向同性（8柱）或各向异性（4柱）边界条件（图2f）。这种快速原型化不同几何形状的能力对于剖析应力场方向性如何影响成纤维细胞行为至关重要，这在后续实验中得到了验证。

2.3. 计算模型预测应力各向异性而非应力大小控制成纤维细胞的激活
为了理解机械线索如何在工程组织中调节成纤维细胞的形态和激活，我们使用多尺度连续模型来模拟应力场，并预测两种几何形状不同的微组织配置中的细胞激活状态：一种由四个边界柱子定义（4柱），另一种由八个柱子定义（8柱）。在这个模型中，组织被视为一系列代表性体积元素（RVEs）的连续体，每个RVE由一个活跃的收缩细胞和胶原基质组成（材料和方法，支持信息）。从我们在圆形微孔中开始的相同初始圆形形状开始，我们的模拟首先展示了4柱和8柱组织设计的组织形状演变（图3a）。我们通过实验确认，我们的微组织确实以模型预测的方式发生压缩（见图4）。图3显示，计算建模表明，控制成纤维细胞激活模式的原因是应力各向异性，而非应力大小。（a）模拟了8柱（上图）和4柱（下图）配置下的组织压缩和应力场演变。颜色图表示应力各向异性（η = tanh[(σ1/σ2 – 1)/2]）。8柱几何结构在组织中心产生各向同性应力场（蓝色），而在边缘产生周向各向异性应力（红色）；4柱几何结构在整个组织中主要产生各向异性应力，其中沿相对柱子之间的水平轴的各向异性最大。（b）假设细胞以各向同性方式感知应力大小的经典模型（方程1中的各向异性反馈项fa = 0）预测8柱组织中心的张力最大，4柱组织中心的张力最小。（c）相比之下，考虑各向异性的模型（方程1，包含大小和各向异性反馈项fm和fa）预测4柱中心的肌动蛋白收缩活性最高，而8柱中心的活性最低。因此，8柱中心是一个关键测试区域，在这里两种模型的预测结果相反（详见图6中的实验验证）。（d）完整模型预测的组织应力表明，各向异性驱动的细胞收缩会在4柱中心放大局部张力，这与经典模型（b）预测的应力梯度相反。图(b–d)中的应力和激活值是沿穿过相对柱子之间组织中心的水平截面（线A–B）绘制的。

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图4显示，细胞密度依赖性的组织压缩验证了几何形状控制的力学计算预测。（a）代表性明场图像显示，在培养24小时后，4柱和8柱边界条件下的组织压缩程度不同。组织在直径为3.26毫米的相同圆形孔中以四种初始细胞密度（0.25、0.5、1.0和20 × 10^6个细胞/毫升）接种。较高的细胞密度导致更大的基质压缩，当细胞密度 ≥ 10^6个细胞/毫升时，4柱配置的压缩程度优于8柱配置。刻度尺：1毫米。（b）基于2D投影面积测量的组织压缩量化。数据显示为平均值 ± 标准误差（n = 8个组织，代表3次独立实验）。在低密度下，两种几何结构的压缩程度都很小。随着细胞密度的逐渐增加，压缩程度增强，当细胞密度 ≥ 10^6个细胞/毫升时，4柱组织的最终面积明显小于8柱组织（***p < 0.001，****p < 0.0001，双因素ANOVA及Holm–Sidak事后检验）。高密度下4柱设备中压缩程度的增加支持了各向异性边界条件增强细胞收缩活性的模型预测。

接下来，我们使用这些模型来预测每种设计中组织内部产生的机械应力场。这些组织中的机械应力方向性因柱子几何形状而显著不同。在8柱配置中，组织的中心区域经历各向同性应力场，其中主应力在所有方向上相等。然而，边缘区域显示强烈的周向各向异性，张力沿边界呈切向排列。相比之下，4柱配置产生各向异性应力场，特别是在中心区域，其中张力在相对柱子之间呈水平方向排列。只有相邻柱子之间的小区域显示出部分各向同性。

随后，我们使用常规模型（包括预应力/预应变公式以及商业有限元软件中常见的常规力学模型）分析了组织内部产生的应力大小。这些模型隐含地假设“应力感应元件”即成纤维细胞以空间各向同性的方式感知应力场。然后，我们将结果沿穿过相对柱子之间组织中心的水平截面（线A和B）绘制出来。这些经典模型预测4柱配置的中心区域张力最高，而8柱配置的中心区域张力最低（见图3b）。鉴于已知成纤维细胞的激活程度随张力增加，这些经典模型预测8柱组织中心的细胞应比4柱组织中心的细胞更活跃。

然而，我们的模型预测了完全相反的成纤维细胞激活模式。在4柱组织中，中心区域表现出最高的成纤维细胞激活程度，而在8柱配置中，中心区域的激活程度最低（见图3c）。这种反转是因为我们的模型不仅考虑了应力大小，还考虑了应力各向异性作为细胞激活的调节因素。在我们的模型中，细胞收缩的平均值ρkk通过两种反馈机制增加：一种由平均应力大小σkk驱动，另一种由局部应力场的各向异性σa驱动：
???????=??ˉ?+??mσkk?+??aσa
（1）
其中ρ??是基线细胞收缩性（无张力时），fm和fa是分别调节细胞收缩性对应力场大小和各向异性响应的模型参数（见支持信息）。应力场的各向异性σa定义为应力张量的主应力值之差：
??a=???tanh(1/(???????1))
（2）
其中σ?和σ?是应力张量的第一和第二主分量。这种公式预测在应力场各向异性的区域，细胞激活程度会增加，并促进细胞收缩。由于这种各向异性驱动的收缩，4柱组织中心的细胞变得更加活跃，从而在该区域产生更大的局部张力（见图3d），这与经典模型（图3b）预测的应力梯度相反。

总的来说，我们的模拟表明，成纤维细胞的激活不仅受拉伸应力大小的调节，更受应力场各向异性的影响。在接下来的章节中，我们将在一个伤口压缩的实验模型中验证这些模型预测，在该模型中，细胞密度很高且会发生显著的整体基质重塑。

2.4. 各向异性边界在高细胞密度下增强组织压缩
我们首先测量了不同细胞密度下组织形态和压缩的变化。在微孔中培养24小时后，记录了不同细胞密度的3D成纤维细胞-胶原蛋白组织的压缩面积（见图4a,b）。不同密度下的投影面积显示，组织经历了逐步压缩，响应了柱子创建的边界。重要的是，在这个早期时间点，以最低密度（2.5 × 10^5个细胞/毫升）接种的细胞尚未开始显著压缩胶原基质，而较高密度的细胞已经显示出显著的基质压缩，且随着细胞体积密度的增加，总体压缩程度更高（见图4b和S1）。当初始细胞接种密度超过10^6个细胞/毫升时，我们观察到基于4柱的组织所占的面积小于基于8柱的组织。重要的是，即使当我们规范化连接柱子的多边形的可用面积时，4柱组织在4天培养后产生的压缩在xy平面内更为明显（见图S2和S3）。尽管存在这种压缩差异，但对中心区域局部细胞密度（DAPI强度）的定量分析显示4柱和8柱组织之间没有显著差异（见图6e,f），表明压缩程度并未转化为组织中心细胞密度的差异，而在组织中心激活差异最为明显。

2.5. 应力各向异性驱动从单个细胞伸展到集体组织排列的时间级联机械感知过程
为了理解成纤维细胞如何在不同尺度上整合机械各向异性，我们改变了细胞密度以分析细胞自主感知、细胞间机械通讯和集体力生成的贡献。在细胞边界可以在3D共聚焦堆栈中明确分辨的密度下（2.5 × 10^5至10^6个细胞/毫升），分析了细胞骨架形态（F-actin）（见图5a–c）；即使在细胞骨架网络大量重叠的密集培养中也能可靠量化的核形态（DAPI），并在所有密度下进行分析，以过渡到用于分化研究的高密度条件（见图5d,e）。令人惊讶的是，即使在细胞团块压缩可以忽略不计且组织未能跨越柱子的低细胞密度下，单个成纤维细胞也对边界施加的应力场表现出更高的伸展（见图5a–c）。这种伸展具有方向性：4柱组织中心的细胞显示出显著更高的长宽比，相比之下8柱中心的细胞为3.1 ± 1.6（4.7 ± 2.6，p < 0.001，细胞密度为5 × 10^5个细胞/毫升），表明单个细胞可以在任何明显的组织重组发生之前检测并响应机械各向异性。

图5显示，机械感知的时间层次结构揭示了单个细胞的伸展先于集体排列以响应应力各向异性。（a–c）24小时时不同初始细胞密度的代表性细胞形态。（a）代表性免疫荧光图像显示4柱和8柱组织中心的F-actin。箭头：伸长的细胞。刻度尺：50微米。（b）量化4柱组织在所有密度下的细胞长度，显示伸展程度增加。（c）细胞长宽比分析确认在各向异性（4柱）与各向同性（8柱）应力场下的伸展程度更大。（d, e）核形态反映了24小时时所有接种密度下的细胞伸展模式。（d）代表性DAPI染色的细胞核。刻度尺：20微米。（e）跨细胞密度的核长宽比量化，显示了依赖于几何形状的差异。（f, g）（f）细胞的集体排列和（g）核的集体排列滞后于单个细胞的伸展。尽管24小时时细胞伸展存在显著差异，但在所有测试的密度下，排列（R值）在两种几何形状之间没有差异。R值的范围从0（随机方向）到1（完美排列）。（h–j）延长培养显示集体组织的出现。（h）48小时（10^6个细胞/毫升）时的代表性图像，显示4柱组织中的细胞排列与8柱组织中的混合方向。（i）细胞R值的时间演变显示48小时内在4柱组织中的逐渐排列。（j）核排列遵循类似的时间模式，确认了协调的组织级重组。数据以平均值 ± 标准误差表示（n ≥ 4个组织，来自3次独立实验）。统计显著性：*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001，通过双因素ANOVA及Holm–Sidak事后检验进行成对比较。

细胞密度与机械感知之间的关系揭示了不同细胞过程的独特缩放行为。单个细胞的伸展从最低密度（2.5 × 10^5个细胞/毫升）到中等密度（5 × 10^5个细胞/毫升）略有增加，然后趋于平稳：10^6个细胞/毫升的细胞显示出与半数密度下的细胞相似的伸展程度（见图5a–c）。相比之下，组织压缩随细胞密度连续增加，每个密度增量都显示出递增，没有饱和（见图4）。这表明单个细胞的机械感知通过不同于整体组织力学且更敏感的机制运作。

我们观察到了细胞将机械各向异性转化为有序组织结构的时间层次结构。在24小时时，尽管4柱和8柱几何形状之间的单个细胞伸展存在明显差异，但两种配置的集体排列程度相似，这反映在图5f,g中的低R值上。然而，将培养时间延长到48小时后，特别是在各向异性环境中，观察到了显著的重组：4柱组织发展出强烈的单轴排列，而8柱中心基本保持各向同性（见图5h–j和S4）。在36小时的中间时间点分析捕捉到了这一转变过程，其中排列R值开始在两种几何形状之间分化。从个体伸展（≤24小时）到集体排列（24–48小时）的时间级联表明，机械感知通过顺序的、依赖于尺度的过程运作。最初，单个细胞通过局部基质相互作用检测应力各向异性，并沿主应力方向伸展。这一初级响应几乎不需要细胞间的协调，并且在细胞基本隔离的低密度下也能发生。随后，伸长的细胞进行旋转重新定向，使其长轴对齐，从而建立组织级结构。这一次级过程涉及渐进的细胞间机械通讯和基质重塑，产生了放大初始各向异性信号的正面反馈。即使在高细胞密度（10^6个细胞/毫升）下，这种机械感知层次结构仍然存在，在这种情况下，预计细胞间的广泛接触可能会占据主导地位。在2.5 × 10^5到10^6个细胞/毫升的4倍细胞密度范围内，保持依赖于几何形状的响应表明，应力各向异性感知是一种在多种组织环境中都稳健运作的基本细胞能力。更高的细胞密度加速了这一过程，但并未改变其时间顺序，这表明从个体细胞对机械刺激的感知到集体响应的转换反映了细胞在不同时间尺度上处理和整合机械信息的内在限制。为了确认在较低密度下观察到的形态级联反应也适用于用于分化研究的高密度条件，我们量化了所有细胞密度下的核形态，包括2 × 10^7个细胞/毫升。在所有可测量的密度下，核的长宽比与细胞长度都成正相关，并且在24小时的时间点上，高密度条件下的核长度差异更为明显（图5d,e），这与更密集的组织中机械信号传递加速的观点一致。直接成像显示在2 × 10^7个细胞/毫升的密度下存在广泛的细胞-细胞接触（图S5），而活死染色显示细胞死亡率可以忽略不计（图S6）；高密度微组织的免疫荧光染色证实了细胞骨架的组织结构以及肌成纤维细胞标志物的表达（图6）。这些数据验证了这种密度条件对于研究机械感知级联反应的最终阶段是生理上相关的。

图6：应力各向异性驱动了与计算预测一致的空间模式化的肌成纤维细胞分化。(a–c) 在培养96小时后整个组织的代表性最大强度投影（初始密度：2 × 10^7个细胞/毫升），显示了(a) α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，红色），(b) F-肌动蛋白（绿色）和(c) 细胞核（DAPI，蓝色）的空间分布。热图叠加显示了相对荧光强度。注意在4-post组织和两种几何形状的外围区域，α-SMA和F-肌动蛋白的表达增强，这符合计算模型预测的高应力各向异性区域（参见图3a）。(d) 中心（“C”）和外围（“P”）感兴趣区域（ROIs）的高倍 magnification 视图，显示了相当的细胞密度，但组织结构存在差异。(e) 外围 ROIs 中荧光强度的量化显示4-post和8-post组织之间的α-SMA和F-肌动蛋白表达相当（n.s.，无统计学显著差异），这与两种几何形状下组织边界处相似的应力各向异性一致。细胞核密度（DAPI）确认了相当的细胞数量。(f) 在中心 ROIs 中的量化显示4-post组织与8-post组织之间的α-SMA和F-肌动蛋白表达显著不同（*p < 0.05），这表明是应力各向异性而非细胞密度驱动了肌成纤维细胞的分化。数据代表每次实验中n = 8个组织的平均 ± SEM 值，共进行了3次独立实验。统计分析采用非配对双尾t检验。图像以5.09微米间隔的100个z切片获取，并显示为最大强度投影。比例尺：(a–c) 500微米；(d) 50微米。

高分辨率图像下载 MS PowerPoint 幻灯片2.6：在形态级联反应之后，应力各向异性最终导致肌成纤维细胞分化增强

在确定了应力各向异性驱动从单个细胞伸长到集体排列的顺序性形态变化之后，我们研究了这种机械感知级联反应是否最终决定了成纤维细胞的表型命运。成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变（FMT）是一个关键的表型转换，其特征是α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的上调以及F-肌动蛋白应力纤维的形成增强。(29?32) 与我们观察到的时间层次结构一致，FMT标志物的变化相对于形态变化是延迟的。在24小时时，尽管细胞已经因应力各向异性而显著伸长，但在多个细胞密度下，4-post组织和8-post组织中心的α-SMA表达没有差异（图S7）。这种时间上的不匹配表明，虽然细胞能够迅速感知并形态上响应机械各向异性，但驱动表型转换的转录和翻译机制需要额外的时间或持续的机械刺激才能启动。

为了捕捉机械诱导的FMT的完整过程，我们将分析延长到了96小时，使用了高密度组织（2 × 10^7个细胞/毫升），在这种情况下，形态重组和机械反馈都会达到最大。活死（Calcein-AM/Ethidium Homodimer）染色证实3T3成纤维细胞在整个较长期培养过程中仍然存活，排除了细胞死亡可能存在的空间差异作为混淆因素（图S6），而小麦胚芽凝集素染色证实了这种培养格式中形成的高水平细胞-细胞接触（图S5）。这种延长的培养揭示了与我们计算预测完全一致的几何形状依赖的表型差异。在4-post组织的中心区域，我们的模型预测应力各向异性最大，我们观察到α-SMA的强度显著高于应力几乎各向同性的8-post中心（4-post：101 ± 25 A.U. 对比 8-post：74 ± 13 A.U., p = 0.0253；图6a,f）。F-肌动蛋白应力纤维也显示出类似的增强，在各向异性区域比在各向同性区域的强度更高（4-post：76 ± 16 A.U. 对比 8-post：56 ± 15 A.U., p = 0.0315；图6b,f）。空间分析进一步验证了我们的各向异性驱动激活模型。在4-post和8-post组织的外围区域，模型预测由于组织边界周围的周向张力而应力各向异性相当，我们观察到的α-SMA（4-post：108 ± 28 A.U. 对比 8-post：120 ± 22 A.U., p = 0.39）和F-肌动蛋白表达（4-post：92 ± 30 A.U. 对比 8-post：80 ± 23 A.U., p = 0.43；图6a,e）的水平没有统计学差异。这种空间模式（4-post中心和所有外围区域的激活都高，而8-post中心激活低）无法用细胞密度差异来解释，因为细胞核的整体染色（DAPI强度）在两个区域之间是相当的（4-post：48 ± 14 A.U. 对比 8-post：41 ± 5 A.U.;, p = 0.23; 图6e,f），也不能用仅基于应力大小的经典模型来解释。

初始机械感知（24小时时的细胞伸长）与完全表型转化（96小时时的α-SMA上调）之间的72小时延迟表明，FMT代表了多阶段机械转导级联反应的最终结果。从快速的形态响应到逐渐的集体重组，再到最终的表型转变，这一过程展示了细胞如何在不同时间尺度上整合机械信号以做出命运决策。持续各向异性应力驱动FMT的需求对于理解正常伤口愈合（瞬时的机械线索促进适当的修复）和病理性纤维化（持续的机械各向异性可能使细胞保持在激活状态）具有重要意义。这些结果确立了应力各向异性而非单纯的应力大小是3D组织中成纤维细胞激活的主要机械驱动因素。即使在细胞-细胞相互作用广泛且基质重塑明显的密集组织中，机械应力的方向性仍然决定着细胞的命运，这突显了组织几何形状在调节成纤维细胞生物学中的基本重要性。

3. 讨论
我们的结果显示，成纤维细胞对应力各向异性的感知通过一个分层的时间级联反应进行，其中单个细胞的伸长先于集体排列，而集体排列又先于肌成纤维细胞的分化。这种从几小时到几天的时间进程表明，细胞在做出表型决策时整合了不同时间尺度上的机械信息。即使在细胞-细胞接触广泛和基质重塑可能掩盖来自组织边界的机械信号的 high 密度组织中，各向异性感知仍然存在。这些发现确立了应力方向性，而不仅仅是应力大小，是3D组织中介导成纤维细胞命运的根本调节因素。

3.1. 时间层次结构揭示了多尺度机械感知机制
我们识别出的时间层次结构始于单个细胞的伸长（≤24小时），然后是集体排列（24–48小时），最后是表型转换（72–96小时）（图7）。这一序列的几个特点支持了机械依赖性，而不是独立过程的偶然时间重叠。这种排序在细胞密度40倍的变化范围内是严格不变的，更高的密度虽然加速了进程，但从未重新排序。每个阶段都在其前一个阶段建立之后才出现：排列只有在细胞伸长后才会出现，而依赖于几何形状的α-SMA表达只有在排列维持后才会出现。此外，每个阶段都在不同的长度尺度上运作。这些从细胞自主伸长发展到细胞-细胞协调，再到组织水平的机械反馈。这表明了一个逻辑链，其中每个阶段为下一个阶段创造了必要的机械条件。要确定因果依赖性，需要分阶段的干扰实验；例如，在24小时抑制伸长并评估下游的排列，或者在48小时破坏排列并测量分化。然而，我们观察到的一致的时间不变性和尺度进展与越来越多的证据一致，即细胞在不同的时间尺度上采用多种机械感知机制。

图7：机械感知的时间级联反应揭示了应力各向异性如何在3D组织中驱动渐进的成纤维细胞激活。示意图时间线说明了细胞对各向异性（4-post）与各向同性（8-post）机械边界条件下的反应层次顺序。出现了三个不同的阶段：(i) 早期阶段（0–24小时）：单个细胞检测到应力各向异性并沿主要应力方向伸长，不受整体组织压缩或细胞密度的影响。(ii) 中间阶段（24–48小时）：伸长的细胞进行集体重新定向以建立组织级别的排列，需要细胞-细胞之间的机械通信和基质重组。(iii) 后期阶段（48–96小时）：持续的各向异性应力暴露最终导致肌成纤维细胞分化，其特征是α-SMA的上调和应力纤维的形成增强。在各向同性条件下，这一进程被抑制。更高的细胞密度虽然加速了进程，但并未改变这一时间顺序，这表明细胞必须在多个时间尺度上整合机械信号才能决定表型变化。关于4-post和8-post配置下不同细胞反应背后的应力各向异性的定量空间分布，请参见图3a中的计算应力场图：4-post几何形状在整个中心区域产生高各向异性，而8-post几何形状在中心产生几乎各向同性的应力场，各向异性仅限于外围。

这些时间动态还表明，机械转导通过不同的、顺序的过程进行，因此与越来越多的证据一致，即细胞在不同时间尺度上采用多种机械感知机制。(22,33,34) 我们的多密度实验设计揭示了这一层次结构如何随着细胞环境的变化而变化：在低密度（2.5 × 10^5个细胞/毫升）时，单个细胞自主检测远场各向异性并在没有组织级别连接的情况下伸长；在中等密度（10^6个细胞/毫升）时，伸长的细胞通过细胞-细胞之间的机械通信进行集体排列；在高密度（2 × 10^7个细胞/毫升）时，力生成和反馈达到最大，级联反应发展到其功能终点——肌成纤维细胞分化。即使在无法分辨单个细胞边界的密集组织中，核形态也是可量化的，并且所有密度下都遵循相同的依赖于几何形状的模式，这证实了在较低密度下识别的层次结构也适用于生理相关的组织条件。最初的快速伸长可能反映了细胞对局部基质力的即时细胞骨架重组，这可能是通过拉伸激活的通道或整合素聚集介导的。随后的集体排列阶段需要细胞-细胞之间的机械通信和协调的基质重塑，(27,35?38) 形成了我们之前描述的细胞收缩性与ECM组织之间的正反馈循环。(22) 最后，延迟的肌成纤维细胞转变表明涉及需要持续机械刺激的转录程序，这与已知的机械诱导基因表达动力学一致。(39?42) 我们观察到即使在整体组织压缩最小的密度（2.5 × 10^5个细胞/毫升）下，细胞也能感知到各向异性，这表明单个细胞可以通过胶原蛋白网络检测到远场的机械边界。这一发现支持了理论预测，即纤维状ECM网络可以将机械信息传递超过典型的细胞-细胞间距。(26,33,43) 在高密度（10^6个细胞/毫升）下，尽管细胞-细胞之间的机械网络变得明显（图S5），各向异性感知的持续存在表明，即使局部细胞产生的力可能占主导，边界施加的应力场仍然影响细胞行为。实际上，更高密度下细胞核形态的依赖于几何形状的差异被放大（图5d,e），表明细胞-细胞接触增强了沿各向异性应力轴的集体力传递。这一发现与细胞-细胞接头传递方向性机械信息的解释一致，正如在上皮单层中观察到的那样，其中钙黏蛋白介导的接头可以在多个细胞长度上传递牵引力。(44) 针对细胞-细胞粘附的靶向干扰可能会在未来研究中解决这个问题，使用保持组织级别机械完整性的方法。

3.2. 在成纤维细胞激活中调和应力大小和各向异性
我们的各向异性感知模型正确预测了与假设各向同性应力感知的模型相反的成纤维细胞激活模式。我们强调，我们的模型满足了所有经典力学的控制方程；它的独特之处在于它假设细胞在应力各向异性下上调收缩性，而不仅仅是应力大小（方程1）。这种修改后的本构定律通过标准的力学平衡预测，在4柱组织中心的细胞由于高度各向异性的应力场而变得更加具有收缩性，产生的局部力增加了组织级别的张力（图3d），这与传统各向同性感知模型预测的应力梯度相反（图3b）。通过多种独立的实验结果验证了这一预测：α-SMA表达的空间模式与预测的各向异性图相匹配，在4柱中心激活增强，在8柱中心激活减弱，在两种几何结构的边缘激活程度相当，那里的周向各向异性相似。这种预测的各向异性与观察到的激活之间的多点空间一致性，特别是两种几何结构之间中心到边缘的梯度反转，无法通过应力大小、压缩或细胞密度差异来解释，这为模型的核心假设提供了有力支持。直接映射局部应力场，例如使用基于FRET的分子张力传感器或测量局部基质应变（55），将在未来的工作中为模型提供重要的额外验证。经典模型（图3b）与我们的各向异性驱动模型（图3c,d）之间的比较有效地分离出了各向异性反馈项（fa）的贡献。经典模型仅考虑应力大小，在方程1中相当于将fa设置为0。这些模型之间预测的激活模式的反转表明，决定成纤维细胞激活的定性空间分布的是各向异性项，而不仅仅是应力大小。这在8柱组织的中心最为明显，那里的应力大小最大（经典模型预测），但各向异性最小：经典模型预测激活达到峰值，而我们的模型预测激活达到局部最小值。这一预测得到了我们实验测量的证实（图6）。我们的模型在预测空间模式（中心与边缘）和表型结果（α-SMA表达）方面的成功，支持了其基本假设，即成纤维细胞整合了应力大小和各向异性来调节其收缩性。该模型能够使用相对简单的现象学关系捕捉这些行为，表明各向异性感知可能是肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架的一个基本特性，可能源于应力纤维和微管倾向于与主应力方向对齐的固有倾向。（18,22,28）尽管在实验系统中无法独立改变模型的双重反馈项（fm和fa），但经典模型仅考虑应力大小的预测与包含各向异性的完整模型之间的比较为各向异性项的贡献提供了有力的检验。8柱组织的中心是一个关键的区分区域：经典（仅fm）模型预测该区域的激活达到最大值，而完整模型预测激活达到最小值。在该区域观察到低α-SMA表达（图6f）仅与各向异性反馈起主导作用的模型一致。未来使用独立改变大小和各向异性的几何结构进行的研究，例如具有相同各向异性但不同边界硬度的组织，或将允许更精确地量化fm和fa的相对权重。另一种重要的解释是，4柱组织和8柱组织之间观察到的差异并非来源于应力各向异性，而是来源于机械约束程度、最终压缩程度或局部细胞密度的差异。有几条证据反对这种解释。首先，组织内的激活空间模式与我们的各向异性模型相符，但与基于约束的解释相矛盾：4柱组织和8柱组织在边缘区域的α-SMA表达没有差异，这与两种几何结构边缘预测的各向异性相当，但与全球约束模型相反，后者会预测在更受约束的8柱结构中激活普遍较低。其次，4柱组织和8柱组织的中心区域之间的局部细胞密度没有显著差异（图6e,f），排除了密度增加作为混杂因素的可能性。第三，即使在最低的接种密度（2.5 × 10^5细胞/毫升）下，成纤维细胞也能检测到应力各向异性，此时整体压缩可以忽略不计，且组织不会跨越柱子（图5a–c），表明各向异性感知先于并独立于基质密度增加。第四，细胞伸长和组织压缩随细胞密度的变化而变化（图4和5），表明它们受不同机制的调节。最后，在一项伴随研究中，（19）我们展示了即使在缺乏收缩性驱动的基质重组的情况下，成纤维细胞也会沿着预先存在的结构各向异性排列，直接将排列与压缩解耦。

3.3. 对伤口愈合和纤维化的启示
我们确定的时间级联对理解伤口愈合动态具有重要意义。在正常修复过程中，机械感应的顺序性质可能作为一个调节检查点，使组织能够区分短暂的机械扰动和需要肌成纤维细胞激活的持续损伤。在完全上调α-SMA之前的72-96小时延迟为仅通过组织重组解决机械应力提供了一个窗口，而不会导致与肌成纤维细胞分化相关的更显著的表型变化。然而，在病理性纤维化中，由未解决的炎症、持续的组织损伤或结构破坏引起的持续机械各向异性可能使细胞处于持续激活状态。（4,15?17）我们的结果表明，纤维化病变的几何形状，而不仅仅是其硬度，可能对疾病进展有关键影响。因此，针对机械环境的疗法可能会从考虑应力方向性以及更常研究的基质硬度参数中受益。（12?14）

3.4. 组织工程的设计原则
我们的发现突出了几何设计在组织工程应用中的重要性。尽管材料、细胞来源和培养条件相同，但4柱和8柱配置之间细胞行为的显著差异表明，边界几何形状本身就可以决定组织表型。这对于希望控制成纤维细胞激活的组织（例如，伤口愈合支架）或必须避免其激活的组织（例如，抗纤维化植入物）具有直接的意义。（45,46）对于需要一定程度ECM组织的工程心脏或骨骼肌，虽然过多的成纤维细胞激活会损害功能，但我们的结果表明，适度各向异性的几何形状可能优化组织组织和抑制肌成纤维细胞之间的平衡。我们开发的HASTE制造平台能够快速迭代此类几何设计，从而系统地优化特定应用的边界条件。

3.5. 机制洞察和未来方向
虽然我们的研究确立了各向异性机械感应的现象学，但时间级联每个阶段的分子机制仍有待完全阐明。然而，现有的证据提供了重要的限制。在一篇伴随研究中，我们展示了成纤维细胞沿各向异性胶原纤维排列需要ROCK活性，（19）这与Sapudom等人的发现一致（47），即ROCK抑制剂会减少对齐基质上的α-SMA表达。这些发现表明，RhoA/ROCK/肌球蛋白II轴在级联的排列和分化阶段都起作用，这与我们计算模型中包含的基于肌动蛋白-肌球蛋白的收缩性反馈一致（方程1）。即使在细胞间接触最小的密度下，是否还有其他独立于ROCK的机制参与最初的细胞伸长阶段仍是一个开放性问题。几种非排他性的候选机制可能介导早期各向异性检测：（1）在极化应力与各向同性应力下机械敏感离子通道的差异性激活；（48）（2）各向异性核变形影响染色质可及性和基因表达；（28）（3）极化的整合素聚类和 focal adhesion 成熟；（49）或（4）我们之前展示的调节方向性收缩性的微管-肌动蛋白相互作用。（19,22）这里确定的时间层次关系为剖析这些贡献提供了一个实验路线图：现在可以在特定时间点施加扰动，独立评估它们对每个阶段的影响，确定给定途径是否对初始伸长反应（≤24小时）、集体排列转变（24–48小时）、分化终点（72–96小时）或多个阶段都是必需的。微型化的HASTE平台特别适合此类研究，因为每次制造可产生192个微组织孔，适合系统性的药理学或遗传学筛选。

另一个未解决的问题是细胞间粘附在调节各向异性反应中的作用。我们观察到在较高细胞密度下几何依赖性反应增强，这表明细胞间机械耦合可能放大各向异性感知，而不是与基质介导的信号竞争。然而，我们目前的数据无法区分细胞间接头在各向异性转导中的主动参与和仅仅是维持组织完整性的被动作用。通过分级抑制粘附蛋白或遗传调节粘附蛋白表达来调节细胞间粘附强度的实验，同时监测依赖各向异性的反应，可能会解决这个问题。我们HAASTE平台的微型化格式非常适合此类研究，因为它能够同时在高通量下筛选许多几何和药理学条件。

特别是，这里确定的时间层次关系为测试机械感应级联各阶段之间的因果依赖性提供了一个框架。在定义的时间点施加抑制剂将揭示每个阶段是否在机制上是必需的，或者它们是否是对各向异性的平行反应，只是具有不同的动力学。例如，可以在伸长发生之后（24小时）但在集体排列出现之前阻断ROCK活性。观察到每个阶段在其前一个阶段确立之前都不出现（图5和6），这与顺序依赖性一致，但需要这样的分阶段扰动实验来明确区分这种模型和平行激活。

3.6. 研究限制和技术考虑
在解释我们的结果时应考虑几个限制。首先，在密集的3D培养中无法追踪单个细胞，这阻止了我们区分细胞自主的α-SMA上调和群体异质性。在不同时间点对组织进行单细胞转录组和/或蛋白质组分析可以解决这一限制。其次，虽然我们专注于含有血清的条件以维持细胞的96小时存活，但血清中的因素，包括TGF-β，可能会影响肌成纤维细胞分化的动力学。在定义的培养基中的未来研究可以隔离纯粹的机械效应。第三，我们的模型将组织视为连续的，可能会遗漏由随机细胞级决策产生的离散细胞行为。最后，尽管模型的空间解析预测得到了多个实验结果的验证，但在密集的、不断重塑的胶原基质中直接测量局部应力将增强模型验证。这样的测量在技术上仍然具有挑战性，但新兴的方法，包括基于FRET的分子张力传感器（55）和高分辨率基质应变映射（50），为未来的研究提供了有希望的途径。尽管存在这些限制，但我们的发现跨40倍的细胞密度范围具有稳健性，实验与计算预测之间的一致性，以及机械感应事件明显的时间进程提供了强有力的证据，表明应力各向异性在3D组织中从根本上调节了成纤维细胞的生物学行为。

4. 结论
这项工作表明，成纤维细胞通过一个分阶段的时间级联感知和响应应力各向异性，最终导致肌成纤维细胞分化。从快速的单个细胞伸长到集体组织组织再到表型承诺的序列，揭示了细胞如何跨时间尺度整合机械信息以做出命运决定。我们的发现表明，组织几何形状通过其对应力方向性的影响，可以与生化因素一样重要，控制成纤维细胞的激活。这些发现为伤口愈合和纤维化提供了见解，并为设计具有可控成纤维细胞表型的组织提供了设计原则。

5. 方法
5.1. 设备设计和制造
5.1.1. 主模具的3D打印
微柱阵列设备是在SolidWorks 2020（Dassault Systèmes，Waltham，MA）中设计的。每个平台包含192个单独的设备，排列成12 × 16的阵列。单个设备由直径3.26毫米、深度1.25毫米的圆形孔组成，其中包含4个或8个微柱。微柱的设计直径为200微米，高度为1.125毫米，顶部有直径300微米、厚度125微米的突出盖子。相邻微柱之间的间距为1.86毫米，对立微柱之间的间距为1.31毫米。使用Form 3 3D打印机（Formlabs，Somerville，MA）和Clear Resin（Formlabs，Somerville，MA）以25微米的层分辨率打印主模具。后处理包括两次15分钟的异丙醇清洗、空气干燥和30分钟的紫外线固化，然后仔细去除支撑结构。

5.1.2. HASTE制造协议
PDMS设备是使用我们修改的Hydrogel-Assisted Stereolithographic Elastomer (HASTE) 协议制造的。（20）简而言之，通过将agar在100 °C下溶解，冷却至60 °C，并添加Triton X-100至最终浓度0.2%来准备琼脂模具（1.5% w/v在自来水中的琼脂，Fisher Scientific）。在比较案例中，没有添加Triton X-100。这种经过表面活性剂改性的琼脂被倒在3D打印的模具上，并在室温下（10分钟）以及4°C下（20分钟）让其凝固。脱模后，使用无需琼脂的模具进行PDMS浇铸。

5.1.3. 顺应性微柱的形成
采用两步PDMS浇铸方法在刚性孔洞中创建顺应性微柱。首先，通过将Sylgard 184（基础与交联剂的比例为1:10，Dow Corning）与Sylgard 527（A组分与B组分的比例为1:1）以1:4的比例混合，制备出一种弹性模量约为130 kPa的软质PDMS混合物。（21,51）将这种混合物脱气后倒入琼脂模具中，并在37°C下的部分固化2小时。随后，加入标准Sylgard 184（弹性模量约为2 MPa）以形成刚性孔洞和支撑结构，最终在60°C下完全固化。将制成品从琼脂模具中取出，并在60°C下再进行24小时的最终固化。

5.2. 细胞培养
NIH/3T3成纤维细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）从Sigma-Aldrich公司获得，并按照符合机构生物安全规范的标准化细胞培养方案进行培养。由于本研究仅使用了已建立的细胞系，因此没有涉及人类或活体动物实验，因此不需要机构审查委员会（IRB）或机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

NIH/3T3成纤维细胞在含有10%胎牛血清（Midsci，USA）、1%非必需氨基酸（NEAA；Gibco，USA）、100U/mL青霉素-链霉素（Gibco，USA）和1% GlutaMAX（Gibco，USA）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，USA）中培养，培养条件为37°C和5%的二氧化碳环境。细胞每3天用0.05%的胰蛋白酶/EDTA以1:10的比例进行传代培养。为了形成微组织，使用Invitrogen Countess 2自动细胞计数仪通过Trypan blue染色法精确计数存活的成纤维细胞数量。

5.3. 3D微组织的形成
使用了四种不同的细胞密度：2.5 × 10^5、5 × 10^5、10^6和2 × 10^7个细胞/毫升。将这些细胞与大鼠尾胶原蛋白（Gibco A1048301，最终浓度为1.5 mg/mL）和0.5 mM Hepes（Gibco）混合在DMEM中，并用NaOH（最终浓度为12.5 mM）中和。在冰盒上进行细胞接种，然后在冷却的离心机中以300 RCF的离心力离心3分钟（4°C）。在37°C下孵育15分钟以使胶原蛋白交联后，加入含有10% FBS的培养基（DMEM）。培养基每2天补充一次。在接种工程化成纤维组织后的3小时、1天和4天，使用Nikon Eclipse TS-R显微镜拍摄明场图像。

5.4. 通过光学相干断层扫描进行3D形态分析
一个定制的光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）系统（52,53）记录了接种当天以及固定前第4天的微组织3D形态。该系统使用超发光二极管（EXALOS，EXC250023–00，中心波长：1300 nm，光谱范围：180 nm）作为光源。光谱仪（Wasatch Photonics，Cobra 1300）配备了一个2048像素的InGaAs线扫描相机（Sensors Unlimited，GL2048），最大A扫描速率为147 kHz。每个3D-OCT图像由600个A扫描和600个B扫描组成，覆盖2.92 mm × 2.76 mm的视野，分辨率约为2.83 μm（横向）和3.95 μm（轴向），介质为DMEM（折射率=1.345）。成像过程大约需要31秒，曝光时间为60 μs。使用ImageJ对x–y–z方向的体素大小进行了各向同性归一化。（54）然后，利用基于机器学习的方法对组织进行分割，以去除轻微的噪声，再进行体积测量。

5.5. 微组织的免疫荧光显微镜观察
微组织在室温下的4%戊二醛（PFA）和Dulbecco磷酸盐缓冲盐（dPBS）溶液中固定20分钟。固定后，微组织在室温下用dPBS清洗两次，每次5分钟，最后在4°C下清洗过夜。选择含有微组织的样品小心切割并转移到8孔腔室 slides上，进行免疫染色。样品先用0.25%的Triton X-100渗透15分钟，然后用5%的正常山羊血清在室温下封闭1小时。随后在4°C下过夜孵育兔源重组单克隆α-平滑肌肌动蛋白抗体（AB124964，Abcam）。清洗后，在室温下孵育二级抗体（Alexa Fluor 647，A21235，Invitrogen）、Phalloidin-488（A12379，Thermo Fisher）和细胞核染料（Hoechst 33342，Thermo Fisher）2小时。清洗步骤完成后，样品在12小时内进行成像。

样品在Olympus共聚焦显微镜（Fluoview FV1200，东京，日本）上使用10X物镜在XY扫描模式下成像，样本速度为20.0 μs/像素。共聚焦扫描采用线序模式进行，启用线卡尔曼积分功能，每个z切片间隔为5 μm，以便进行最大强度投影分析。

5.6. 细胞和细胞核轮廓分析
使用ImageJ分析细胞形态（细胞和细胞核的纵横比、细胞核方向以及细胞在组织中的长度）。分析二值化图像的具体步骤如下：首先从每个组织样本的最大Z投影中切割出一个1 mm × 1 mm大小的感兴趣区域。然后使用Freehand Selection工具手动追踪每个细胞的边界。仅选择完全可见且独立的细胞，以避免受到邻近细胞特征的干扰。通过核对细胞核的位置来确认分离的细胞边界。选择细胞轮廓后，使用“Fit ellipse”功能在“Analyze > Set Measurements”菜单下测量细胞形态，确保启用了“Fit ellipse”和“Shape descriptors”选项。根据拟合的椭圆记录长轴和短轴的长度。细胞长度定义为调整到微米刻度的长轴长度。纵横比（AR）计算为长轴与短轴的比值（AR = 长轴/短轴），以评估细胞形态。为了减少观察者偏差，应用了严格的纳入标准：仅追踪边界完全可见且与邻近细胞明显分开的细胞。排除边界模糊或重叠的细胞。通过DAPI通道确认每个追踪的轮廓对应一个单独的细胞。通常在来自3个独立实验的≥4个组织中每个条件分析至少60个细胞（通常>150个）。所有成对比较均使用非参数Mann–Whitney检验，以确保统计结果的稳健性，而不需要对数据分布做出假设。手动追踪方法的有效性通过自动核纵横比测量得到了独立验证，结果显示所有密度下的几何形状分布一致（图5d,e）。然后计算拟合椭圆与细胞核之间的角度，以得出方向分布的R值，该值表示方向的协调程度。

5.7. 纤维取向分析
为了研究细胞是否以集体方式响应机械各向异性，我们调查了单个细胞和细胞核的整体分布情况。通过提取可视化α-SMA的若干层共聚焦层的最大强度投影，量化了培养的工程化成纤维组织中心的成纤维细胞取向。使用ImageJ的OrientationJ插件（来自瑞士生物医学成像组；http://bigwww.epfl.ch/demo/orientation/）分析了中心区域1 mm × 1 mm范围内的平面取向。取向计算采用了高斯梯度方法，局部窗口大小为σ = 2像素。取向分布以取向值（?90°至+90°）与出现频率的直方图形式显示，不必进行额外分组（间隔：1°）。

为了确保结果的准确解释，我们采用传统的公式方法根据取向分布的方向浓度计算R值。R值表示从加权正弦和余弦投影得到的结果向量长度。强度值作为权重，用于计算整个?90°至+90°的方向谱。

5.8. α-平滑肌肌动蛋白和F-肌动蛋白表达分析
编写了自定义的MATLAB代码来分析组织不同位置不同荧光标记的平均荧光强度值。首先使用Olympus Life Science的FV10-ASW V4.2 Viewer内置的平均强度功能将每种波长的图像保存为单独的TIFF文件。然后使用自定义的MATLAB代码将对应于组织中同一位置的三个波长的TIFF文件导入MATLAB并可视化。用户可以在要分析的位置定义一个N乘N的正方形ROI区域，计算ROI内的三个波长的平均强度值，并将其汇总到Excel电子表格中进行定量分析。

5.9. 计算模型
计算模拟基于我们最近校准的模型（19），该模型预测成纤维细胞如何响应外部环境的机械信号调节基于肌动蛋白的激活机制（支持信息）。该模型包括三个主要的细胞骨架组成部分：肌球蛋白分子马达、微管网络和肌动蛋白网络。肌球蛋白被建模为产生主动收缩力的元素，而微管和肌动蛋白纤维则被视为被动机械元素，分别因肌球蛋白收缩而发生压缩和拉伸。模型测试了两种反馈机制下细胞收缩性的增加：（i）一种与张力大小相关的途径，其中平均收缩性ρkk/3随平均张力σkk/3增加；（ii）一种与张力各向异性相关的途径，在张力方向存在偏置的区域，平均收缩性增加（见公式1）。在公式1中，σa表示应力张量的第一和第二主应力分量的比率（参见公式2）。该值量化了应力场中的方向偏置程度，较高的值表示细胞在一个主轴方向上经历的张力较大。此外，ρ?0表示在没有张力时的基线细胞收缩性。fm和fa是控制细胞收缩性ρ与张力σ之间依赖性强反馈机制的模型参数（参见参考文献（19））。由于这种反馈机制，细胞收缩性随着张力的大小和各向异性而增加。该模型还考虑了肌动蛋白对张力的响应性聚合，即肌动蛋白元素的硬度沿着最大主应力方向增加，模拟了细胞骨架张力对肌动蛋白纤维的增强作用。（28）该模型在三维（3D）有限元框架内实现。为了模拟组织收缩，生成了如图3a所示的初始配置的圆形组织几何形状。由于几何对称性，仅模拟了圆形域的四分之一。微柱被建模为一端带帽的圆柱形结构，每个柱子的另一端完全固定以模拟实验设置。在有限元模拟中，使用表面到表面接触约束定义了每个柱子的外表面与组织之间的接触交互。

对于四个柱子的配置，四分之一域的组织网格包含36,272个C3D8类型的线性六面体元素，形成了145,088个元素的全组织网格。对于八个柱子的配置，四分之一域的组织网格包含9630个C3D8元素（完整几何形状下为38,520个）。在这两种情况下，每个微柱都用2,170个C3D8H类型的混合线性六面体元素进行网格划分。两种配置的网格密度都是根据网格收敛性研究选择的，以确保数值精度和解决方案的收敛性。

模型中活性、产生力的组成部分（肌球蛋白元素）的收缩导致组织从其初始圆形几何形状收缩，从而在八个柱子和四个柱子的配置中形成不同的最终形状，如图3所示。对于每种情况，我们计算了细胞收缩性ρ、张力σ和张力各向异性σa的空间分布（图3）。

5.10. 统计分析
我们使用GraphPad Prism 8.3.1进行统计分析。为了比较两组，使用单尾t检验来量化双尾P值。对于多组数据，先进行普通单因素ANOVA，然后应用事后Holm–Sidak均值比较检验。当p < 0.05时，认为差异具有统计学意义。* = p < 0.05；** = p < 0.005；*** = p < 0.0005；**** = p < 0.0001。