源自唾液酸糖肽的广谱呼吸道抗病毒大分子

《ACS Nano Medicine》：Pan Respiratory Antiviral Macromolecule from Sialylglycopeptide

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细胞表面的 N-糖胺聚糖能被呼吸道病毒识别，从而引发感染。开发能够模拟病毒天然受体的抑制剂是一种已知且具有吸引力的策略，这种策略通常表现出较低的毒性。我们已经展示了通过引入一个长而柔软的疏水连接臂，使这些分子具有杀菌机制，从而使这种策略更加有效。到目前为止，最成功的方法是一种基于环糊精的分子，该分子经过 Neur5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc（6′SLN）的修饰。不幸的是，这种糖胺聚糖的合成过程复杂，因此成本较高。在这里，我们通过用鸡蛋来源的唾液酸糖肽（SGP）修饰 β-环糊精（CD）的一级醇，设计出一种廉价的多价进入抑制剂。所得到的 macromolecule 对唾液酸依赖性的人类流感病毒表现出纳摩尔级别的抑制作用，对肝素硫酸盐依赖性病毒（RSV 和 SARS-CoV-2）则表现出亚微摩尔级别的抑制作用，整体上优于 6′SLN 修饰的抗病毒剂。我们还发现，使用硫酸化的 SGP 可以显著提高抗病毒剂的效力。该化合物还基于其抑制脂多糖诱导的 RAW264.7 巨噬细胞中一氧化氮（NO）产生的能力，显示出显著的抗炎特性。总体而言，这种 macromolecule 可能可以作为开发通用呼吸道抗病毒剂的候选物质，这一策略也有助于设计包含更复杂糖类的抑制剂。

引言
在新冠疫情之后，我们目前面临着三种不同的呼吸道病毒（RSV、流感和 SARS-CoV-2），这些病毒继续影响着我们的日常生活，并对人类健康造成巨大压力。(1) 目前市场上有多种小分子药物用于单独治疗这些病毒；然而，它们对它们的疗效往往较低。最好的策略是开发一种能够同时治疗这三种病毒的单一化合物，因为它们具有共同的特点：它们通过空气传播，依赖于细胞-细胞相互作用，并利用多糖作为细胞附着受体，从而导致疾病进展和炎症。不过，这些病毒在偏好方面存在细微差异：RSV 以肝素硫酸盐（HS）蛋白聚糖作为共受体，而流感病毒则更倾向于唾液酸。多项研究表明，SARS-CoV-2 可以识别这两种受体。对人类肺组织的糖组学分析显示，存在大量复杂的 N-糖胺聚糖异构体，从双臂结构到四臂结构不等，这些聚糖包含末端经过 α2,3- 或 α2,6-唾液酸修饰的多聚-N-乙酰半乳糖胺（poly-LacNAc），有时还带有硫酸基。(2) 此外，观察到了具有不同二糖组成的肝素硫酸盐（HS）和软骨素硫酸盐（CS）聚合物。然而，量化这些相互作用的努力具有挑战性，且揭示出的结合亲和力较低（Kd 在毫摩尔范围内)。(3) 最近，由于获得了更多的细胞结构信息，使得对病毒相互作用的研究成为可能。然而，由于缺乏这些信息，只有一部分糖类被成功合成。(4,5)
在我们之前的研究中，我们展示了通过模仿细胞表面糖类，并将它们引入含有长而柔软疏水臂的修饰后的 CD 上，从而开发出多价进入抑制剂（MEI）的可能性。对于流感病毒，我们引入了唾液酸，这种糖类几乎被所有流感病毒所识别，并且在文献中有详细记载。当与 Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc（6′SLN）共价接枝在碳链（C11）上时，末端修饰的 CD 对季节性流感毒株（H1N1）表现出纳摩尔到微摩尔的抑制作用。(6,7) 另一方面，对于 HSV-2、RSV 和 SARS-CoV-2，末端臂含有负电荷的硫酸基或磺酸基团，主要模拟肝素硫酸盐，但不是真正的肝素糖类。总体而言，这种策略效果良好，使得 MEI 的结合变得不可逆，导致病毒结构完整性丧失。然而，使用外部硫酸基或磺酸基抑制剂可能会导致与血浆蛋白结合，抑制酶活性，并干扰硫酸化途径，从而导致代谢失衡。因此，开发一种能更好地模拟病毒天然 HSPG 受体的抑制剂非常重要。(8) 多种基于合成糖类和肽的材料已显示出显著的抗病毒活性。设计来模仿天然多糖的糖聚合物，如藻酸聚糖，通过结构优化增强了抗 HSV-1 活性。(9) 高度硫酸化的糖模拟聚合物和糖醇寡聚物通过竞争细胞糖类与病毒结合，抑制了多种人类病原体的感染，包括人乳头瘤病毒和流感病毒。半合成的糖肽抗生素和缀合物，如改良的替考拉宁衍生物和类胡萝卜素-糖肽杂交体，已被报道可以阻止 SARS-CoV-2 的复制并抑制病毒蛋白酶活性。(10,11) 同样，合成的硫酸化 α-螺旋多肽和抗病毒模拟肽也被设计用来与病毒成分或免疫受体相互作用，为基于肽的抗病毒剂提供了一种有前景的策略。(12,13) 然而，流感病毒已经进化到能够识别以唾液酸结尾的双臂 N-糖胺聚糖，对包含硫酸基糖部分的扩展型多聚-N-乙酰半乳糖胺（poly-LacNAc）链表现出更强的亲和力。
糖化学领域最大的障碍之一是可扩展性，这涉及到使用昂贵的酶来制备复杂的 N-糖胺聚糖，限制了它们在临床应用中的使用。(14) 为了解决这些问题，一些研究小组从鸡蛋中提取了双臂糖胺聚糖，并成功开发了克级生产流程。(15) 这些糖胺聚糖可以作为前体，用于创建各种 N-糖胺聚糖库。然而，产量和纯化过程存在显著瓶颈，特别是在链延长方面。此外，双臂糖胺聚糖与病毒的结合能力较弱，在体内可能性较小。(16)
在本文中，我们报道了将携带双臂 N-糖胺聚糖和 α2–6-连接的唾液酸残基的 SGP 与修饰后的 CD 架构共价结合的方法。所得到的 macromolecule（CD-SGP）对从宏观到纳米尺度的多种流感病毒表现出抑制作用，并对依赖肝素硫酸盐的 RSV 和 SARS-CoV-2 表现出亚微摩尔级别的抑制作用。此外，我们还使用了 6′-唾液酸-N-乙酰半乳糖胺（6′SLN3）及其硫酸化形式来研究其在预防最新 H3 型流感病毒中的潜力。鉴于这些糖类在抗体依赖性细胞毒性（ADCC）平台上广泛用于控制炎症，我们也研究了它们的抗炎特性。我们的发现表明，它们可以降低会损害器官完整性的促炎细胞因子 NO 的水平。(17)

结果和讨论
抑制剂设计
唾液酸糖肽 1（SGP，图 1）之前用于制备简单的对称 N-糖胺聚糖，可以从蛋黄粉中常规分离出几克量的 SGP。我们首先尝试通过后续的普伦酶处理将 SGP 直接地转化为双臂糖基天冬酰胺，以去除其中的肽。然后使用 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将自由天冬酰胺连接到 CD 上。然而，多次尝试将其共价连接到 CD 上均未成功。为了解决这个问题，我们在天冬酰胺末端引入了一个 5 个碳的原子连接臂，以提供一些灵活性并改善访问性，但这一策略也没有产生所需的分子。我们假设糖类之间的空间障碍或其构象可能是造成困难的原因。这与 Latypova 等人的研究结果一致，他们开发了一种新的连接臂来锁定糖类构象，从而允许进一步与环糊精结合。(19)
图 1
图 1. 在其一级表面上用疏水十一烷基连接臂修饰的 CD，与复杂的 N-连接的唾液酸糖肽（CD-SGP）结合。
2a：带有复杂 N-连接的唾液酸糖肽的硫酸化形式的 CD。
3a：与 6′-唾液酸-N-乙酰半乳糖胺（6′SLN）结合的 CD。
4：带有末端自由氨基连接臂的 6′-唾液酸-N-乙酰半乳糖胺（6′SLN3）的结构。
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Tsuji 等人也采用了类似的策略，他们成功开发了一种偶联方法，将 SGP 接枝到聚合物骨架上，其中最活跃的部分是 N-末端的 α-氨基，而不是肽的 ε-氨基。(20-22) 因此，我们决定直接将未经改性的 SGP 与 NHS 修饰的 CD 进行反应，而不进行任何后续修饰，从而得到一个结合混合物，随后通过透析有效地去除了未反应的 CD 和自由糖（图 1）。

抑制研究
CD-SGP 对流感病毒感染的抑制
我们进行了研究，制备了一系列以不同密度接枝 SGP 到 CD 上的化合物，并评估了它们的抗病毒活性。最初使用的 CD 与 SGP 的摩尔比为 1:3，随后增加到 1:5、1:7 和 1:9。为了评估 CD-SPG 的多价效应，我们在感染后对 H1N1 A/NL/09 毒株进行了初步的抑制研究（支持信息，图 S1）。以 1:3 比率接枝的化合物表现出 0.41 μM 的 IC50，而预处理后的 IC50 为 0.087 μM（图 2）。我们还使用等温滴定量热（ITC）研究了化合物 1（SGP）和 1a（CD-SGP）的结合热力学（表 1）。ITC 数据表明，化合物 1a 的结合亲和力显著高于化合物 1，表现为更低的解离常数（Kd = 4.86 vs 33 μM），相应的结合自由能为更低（ΔG = ?7.25 vs ?6.11 kcal mol–1）。
表 1. 与病毒蛋白相互作用的 MEI 的 Kd 值（μM）
化合物 Kd (μM) ΔH (kcal mol–1) ΔG (kcal mol–1) TΔS (kcal mol–1)
1a 4.86 8.48–7.25 15.7 13.0 5.7 8–6.11 11.9
图 2
图 2. (A) 1a 与 H1N1 的剂量-反应曲线和杀菌试验。(B) 1a 与临床 H1N1 的剂量-反应曲线和杀菌试验。(C) 1a 与 H3N2 的剂量-反应曲线和杀菌试验。(D) 1a 与 Influenza B Victoria 的剂量-反应曲线和杀菌试验。NT：未经处理的病毒样品；1a：处理后的样品。结果表示为三次独立实验的平均值，带 ± 标准偏差。

重要的是，1a 增强的亲和力并非由焓驱动；ITC 显示 1a 的结合焓较低（ΔH = 8.48 kcal mol–1），表明特定的非共价相互作用对复合物稳定性的贡献较小。相反，1a 的结合主要由较大的有利熵项（TΔS = 15.7 kcal mol–1）主导，这弥补了焓损失。这种显著的熵增益通过 ITC 直接量化，与构象限制减少和复合物形成时溶剂释放有关。这些 ITC 结果共同强调了熵驱动的结合机制，并突显了热力学补偿在调节 1 和 1a 之间观察到的亲和力差异中的作用。
为了评估该化合物是否也能抑制临床分离株，我们对其进行了测试，测试对象是携带神经氨酸酶（NA）耐药突变 S247N 和血凝素（HA）表位突变 K169Q 的 H1N1 Lausanne 株，以及基因组中的各种次要突变。尽管存在这些遗传改变，Lausanne 临床株仍然被有效抑制，IC50 值为 2.04 μM。这些发现表明，抑制机制可能是保守的，可能通过与唾液酸糖类的多价相互作用实现，即使存在病毒突变也能有效。此外，我们还评估了我们的lead化合物对 H3N2（Wyoming 株）的活性，这是一种以快速抗原漂移为特征的季节性流感病毒，已知对当前的神经氨酸酶抑制剂具有抗性。我们的分子表现出有效的抗病毒活性，对该菌株的 IC50 值为 2.74 μM。此外，我们还评估了该化合物对 Influenza B 病毒的活性，尽管 Influenza B 病毒通常比 H1N1 和 H3N2 病毒危害较小，但它们在儿童和成人中仍会引起严重疾病。为此，我们使用了已知能与宿主细胞表面的含唾液酸糖蛋白结合的 Influenza B Victoria 轴。这种相互作用由病毒血凝素（HA）蛋白介导，该蛋白特异性识别主要表达在人类上呼吸道的 α2,6-连接的唾液酸。在我们的实验中，lead 化合物 CD-SPG 对 Victoria 轴表现出显著的抑制活性，IC50 值为 1.87 μM。在所有情况下，观察到的抑制作用都是通过杀菌机制实现的，表明该化合物直接使病毒失活，而不仅仅是阻断病毒进入或复制。

CD-SGP 对 SARS-CoV-2 和 RSV 感染的抑制
BA.1 亚型是 SARS-CoV-2 Omicron 变体（B.1.1.529）的最早亚型之一，最初于 2021 年 11 月在南非和博茨瓦纳被发现。由于其高传染性和部分逃避先前感染及疫苗接种的免疫能力，它在 2022 年初成为全球主导株。BA.1 在 2021 年末和 2022 年初导致了创纪录的病例数。多项报告指出，这些菌株能够识别肝素硫酸盐（23,24）以及α2–8连接的唾液酸，这些唾液酸在碳原子4位、7位、8位和/或9位具有O-乙酰化修饰，同时其C4位和/或C7位的酰胺基团也发生了变化（25,26）。最近通过电喷雾离子化（ESI）技术对人类肺部和肠道组织进行分析的研究发现，存在19种不同的分子量，其中包括13种单唾液酸化和6种双唾液酸化的N-糖蛋白。在这些分子中，有6种属于混合型糖蛋白，其余为复杂型糖蛋白。研究结果表明，肝素硫酸盐（HS）和唾液酸糖蛋白具有共同的结合位点，它们与病毒受体结合的亲和力分别为460 ± 30 μM和600 ± 30 μM（27）。基于这些新发现，我们假设这种多价性可能会增强该病毒与受体的结合能力。为了验证这一假设，我们研究了是否含有双唾液酸化糖蛋白的抑制剂CD-SGP能够抑制B.1.1变体病毒。令我们惊讶的是，抗病毒实验显示，该化合物在12.5 μM的浓度下能有效抑制B.1病毒（图3）。然而，尽管该化合物能有效抑制病毒复制，但它并没有表现出杀病毒活性。不过，其良好的理化性质使其适合用于全身性抗病毒治疗。

在证明了CD-SGP对SARS-CoV-2的广谱抗病毒活性之后，我们想评估其是否也对RSV有效，因为已知RSV具有对肝素硫酸盐的亲和力。为此，我们选择了RSV-A2作为测试对象，这种实验室菌株具有许多自然流行RSV-A病毒的特征。RSV-A病毒通常与更严重的疾病相关，尤其是在婴儿和儿童中。实验结果显示，CD-SGP对RSV-A2的抑制作用非常显著，IC50值为0.286 μM（图4）。据我们所知，目前尚无已知的基于糖的RSV抑制剂。尽管有研究表明唾液酸可作为RSV的辅助受体，但其抑制效果不足以作为有效的抗病毒剂。

我们还研究了CD-SGP-(SO3)n和6′-Sialyl-N-acetyllactosamine（6′SLN3）的抑制活性。硫酸化是糖蛋白和糖脂上的一种关键碳水化合物修饰，通过糖蛋白结合蛋白的识别在生物过程中发挥重要作用。这些蛋白质能够识别糖蛋白作为配体。在复杂型N-糖蛋白中，硫酸基团通常连接在半乳糖的C-3位和C-6位或N-乙酰葡糖胺的C-6位的Galβ1-4GlcNAc序列上（28）。总共鉴定出387种硫酸化N-糖蛋白组成，通过数据挖掘数据库发现了1380种独特的N-糖肽，并通过从头测序进行了验证，其中514种在特定位置发生了硫酸化。虽然已经成功记录了选择性硫酸化的方法，但目前仍缺乏在SGP上引入选择性硫酸化的方法（29）。

为了研究带负电荷的硫酸基团对复杂N-糖蛋白与病毒活性的影响，我们在化合物1a（CD-SGP）上引入了随机硫酸化，得到了化合物2a（详见支持信息）。进一步评估其抗病毒活性后，我们发现硫酸化增加了对H3N2 Wyoming株（IC50 = 2.64 μM）和临床H1N1分离株（IC50 = 0.41 μM）的半最大抑制浓度（表2）。这种效应归因于硫酸化多糖与病毒表面的相互作用，导致病毒颗粒聚集和静电排斥，从而阻止病毒在生理pH值下接近带负电荷的宿主细胞。然而，对于H1N1、流感B型和RSV，抑制效果减弱。对于SARS-CoV-2，尽管有报告指出带负电荷的阴离子能与其强烈结合，但我们预期会观察到显著的抑制效果，但实际上并未观察到抑制作用。

在我们的研究中，我们还包含了一种polyLacNAc化合物（4），文献中的糖链阵列研究表明，包含三到四个LacNAc重复单位的延长poly-LacNAc结构可以增强对H1和H3流感病毒株的结合能力。然而，只有在多分支结构中才观察到这种增强效果。为了探究与三个LacNAc单元连接的唾液酸是否会影响结合，我们合成了6SLN3与CD的缀合物。结果显示，这种缀合物对H1和H3病毒株均表现出强烈的结合能力，相应的IC50值分别为0.0075 μM和0.0835 μM。然而，它对呼吸道合胞病毒（RSV）和SARS-CoV-2没有结合效果。

当免疫系统对病毒感染作出反应时，会引发炎症以对抗病毒。然而，过度或慢性的炎症会损害组织和器官。感染过程中肺部会产生高活性的自由基一氧化氮（NO），这可能会过度激活免疫系统，导致组织损伤，尤其是在COVID-19等呼吸道感染中，会加重肺炎和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等病情。维持一氧化氮（NO）水平的平衡至关重要，因为其水平过高或过低都可能有害。在本研究中，我们研究了改良的微生物多糖衍生物（MEIs）对NO产生的影响。为了诱发炎症反应并上调NO合成，我们用脂多糖（LPS）刺激RAW 264.7巨噬细胞作为阳性对照。细胞预先用不同浓度的这些化合物处理48小时后，再用LPS（1 μg/mL）刺激24小时以引发炎症，并测量NO水平。结果显示，化合物1a和3a显著降低了NO的产生（图5）。值得注意的是，化合物3a没有表现出显著的抑制作用。这种NO生成的减少表明这些衍生物通过调节活化巨噬细胞中的NO生成具有抗炎潜力。为了进一步研究这些化合物是否还能调节其他炎症因子，我们评估了它们对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的影响，但没有检测到显著的抑制或激活作用。它们对NO生成的选择性作用可能反映了N-糖蛋白对iNOS依赖的硝化反应的特异性调节，而不是对炎症因子信号通路的广泛抑制，有助于在保持TNF-α和IL-6介导的免疫功能的同时减少氧化应激。

为了进一步阐明CD-SGP缀合物的广谱抗病毒活性，并通过提供结构信息来补充我们的抗病毒实验结果，我们使用LigPlot+进行了分子对接和相互作用映射（7）。这些计算方法使我们能够可视化并识别稳定复合物的非共价相互作用。病毒蛋白结构来自高分辨率晶体学或冷冻电镜数据（PDB ID：7WBL、5EA3、4WE8和6BKR），分别对应于SARS-CoV-2 Omicron BA.1受体结合域、RSV F蛋白、流感B（Victoria系）血凝素和流感A H3N2（Wyoming株）血凝素。

CD-SGP（1a）与RSV F糖蛋白（PDB: 5EA3）的对接显示，该缀合物的结合位点位于已知的HS结合槽附近（图6C）。这是RSV F糖蛋白的融合前构象，它在病毒附着过程中与宿主因子（包括肝素硫酸盐蛋白聚糖HSPGs）相互作用。CD-SGP在CD支架上呈现双枝状唾液酸化糖蛋白，其中唾液酸的羧基（带负电荷）可以与带正电荷/极性表面相互作用，从而模拟HS硫酸基团。LigPlot+（图6D）显示了与Asn240、Gln283、Val243的氢键作用，以及Gln462、Ser362和其他残基的稳定作用，还包括Ala241、Pro246等残基的疏水接触。唾液酸羧基通过氢键与F糖蛋白表面的Gln283和Gln356残基锚定。这与先前的研究结果一致，即RSV F能够通过结合肝素硫酸盐来促进病毒附着（31），CD-SGP中的Neu5Ac也可能以类似的方式模拟HS的静电特性，从而实现牢固的结合。

CD-SGP与流感A H3N2（PDB ID: 6BKR）血凝素的建模显示，1a与H3N2蛋白的结合模式（A）和RSV F糖蛋白（PDB: 5EA3）的结合模式（B）。LigPlot+图展示了6BKR与1a之间的蛋白质-配体相互作用（D）。图中红色虚线表示氢键作用，紫色表示配体结构（Molecular Modeling Protocol）。

CD-SGP的广谱抗病毒活性不仅与其化学结构有关，还与其与病毒刺突蛋白的相互作用机制有关。我们通过LigPlot+进行了分子对接和相互作用映射，以了解CD-SGP缀合物如何与病毒蛋白结合（7）。这些计算方法帮助我们可视化和识别稳定复合物的非共价相互作用。此外，与目标分子团或肽的共轭可以用于针对特定的病原体和各种不同类型的细胞（特别是癌细胞），以及实现靶向的位点特异性药物递送。

**结论**

在这项研究中，我们通过将携带唾液酸糖肽的复合型双尾N-糖链嫁接到CD支架上，成功开发了一类多价进入抑制剂（MEIs）。这种大分子对多种甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）以及SARS-CoV-2变异株表现出广谱抗病毒活性。值得注意的是，这种MEI在纳摩尔到亚微摩尔范围内显示出强烈的抑制效果，这强调了多价糖链展示在增强结合亲和力和抗病毒效力方面的重要性。此外，CD-SPG的硫酸化衍生物和扩展的聚-LacNAc构建体突显了该平台的多功能性，并为针对特定毒株微调糖链结构提供了见解。除了抗病毒作用外，CD-SGP还表现出显著的抗炎特性，能够选择性地减少LPS刺激的巨噬细胞中的一氧化氮产生，表明其在减轻病毒感染和相关炎症反应方面具有双重治疗潜力。总体而言，这项工作为基于糖链的广谱抗病毒剂的发展奠定了基础，这些抗病毒剂在预防和控制呼吸道病毒感染方面具有潜在应用价值。这种方法的模块化和可扩展性，加上其已证明的有效性，预示着其作为泛呼吸道抗病毒药物临床应用的前景。

**材料与方法**

**病毒和细胞**

本研究中使用了四种流感病毒：A/Netherlands/602/2009（H1N1）、H1N1 A/Lausanne/2022临床株、H3N2 A/Wyoming/2003/3和B/Washington/02/2019。使用了表达绿色荧光蛋白（RSV-GFP）的RSV，以及从临床样本中分离出的SARS-CoV-2 BA.1 Omicron。

**（36）抑制实验**

对于流感病毒感染，将MDCK细胞预先接种在96孔板中并使其粘附24小时。在含有1% P/S的DMEM培养基中制备化合物稀释液，并与A/Netherlands/602/2009（H1N1）、H1N1 A/Lausanne/2022临床株、H3N2 A/Wyoming/2003/3和B/Washington/02/2019病毒以0.01的MOI在37°C下混合1小时。然后将细胞混合物加入预先接种的细胞中。在37°C下病毒吸附1小时后，移除接种物，并加入新鲜的DMEM或含1% P/S的MEM培养基。在37°C下孵育24小时后，进行免疫细胞化学（ICC）检测以分析流感病毒感染情况。细胞用甲醇固定和通透化1分钟，随后在37°C下与流感A单克隆抗体和流感B单克隆抗体（稀释比为1:2000-A，1:500-B）孵育1小时，三次用洗涤缓冲液（1 × PBS + Tween 0.05%）清洗，再与gout antimouse IgG-Alexa fluor 488（稀释比为1:1000）孵育1小时。再用PBS洗涤三次，最后加入DAPI孵育5分钟。通过Plate Reader ImageXpress自动计数荧光感染的细胞，并通过比较处理组和未处理组中感染细胞的数量来计算感染百分比。感染率以平均值±标准差表示，n = 3。有效浓度EC50和95%置信区间通过GraphPad prism（版本10.0）中的非线性回归分析（log(抑制剂) 对应响应 – 变量斜率（四个参数）计算得出。

对于RSV-GFP感染，将LLCMK2（ATCC CCL-7）细胞接种在96孔板中（每孔10,000个细胞）。使用200个形成焦点的RSV-GFP单位（0.02 MOI）在含有2.5% FBS的DMEM中于37°C下感染细胞1小时。然后向细胞中加入含或不含30 mM NaClO3的DMEM和2.5% FBS。感染细胞在37°C下孵育1天。随后手动计数表达GFP的细胞以测量感染性。

对于Omicron感染，将Vero E6 TMPRSS2细胞以每孔40,000个细胞的密度接种在96孔板中。使用1:3的连续稀释系列制备药物浓度，从150 μL的初始药物稀释液开始，每次将50 μL转移到含有100 μL感染培养基的下一孔中继续稀释。向每个孔中加入10 μL的病毒稀释液，并在37°C下孵育1小时。然后去除细胞培养液上的上清液，加入制备好的病毒-药物混合物并在37°C下再次孵育1小时。孵育后，去除上清液，加入新鲜培养基，并在37°C下培养细胞24小时。最后，用6% PFA固定细胞，并进行免疫荧光（IF）检测以获取结果。

**（6,36）杀菌实验**

测试样品暴露于A/Netherlands/602/2009（H1N1）、H1N1 A/Lausanne/2022临床株、H3N2 A/Wyoming/2003/3和B/Washington/02/2019（10^5 ffu/mL）病毒中，并在37°C下孵育1小时。随后，将病毒和材料的混合物以及未经处理的对照组进行系列稀释。将这些稀释样品转移到MDCK细胞上并孵育1小时。之后，去除混合物，并加入新鲜的含1% P/S的DMEM培养基。第二天，使用ICC检测评估病毒滴度。对于Omicron感染和RSV-GFP也采用类似的程序进行手动定量。

**（6,36）MDCK细胞毒性实验**

使用MTT检测评估MDCK细胞的毒性。在检测前一天，将5 × 10^4个细胞接种在96孔板中。将每种药物的剂量范围（从4.11 μM到1000 μM）加入无血清培养基中的MDCK细胞中。在37°C下将分子孵育24小时。孵育后，清洗细胞，并按照制造商的说明在37°C下向细胞中加入MTT试剂（Promega）4小时。然后清洗细胞，并加入50 μL DMSO以释放试剂。随后在579 nm处测量吸光度。通过比较处理组和未处理组之间的吸光度来计算存活率百分比。

**（6,36）ITC（等温滴定量热法）实验**

使用配备200 μL样品池和40 μL注射器的ITC200仪器（GE Healthcare, USA）进行ITC实验。应用了13次注射。排除第一个数据点。细胞中的病毒蛋白浓度约为1 mg/mL，注射器中的配体浓度约为2 mM。样品在2000g下离心2分钟以去除气泡。滴定在25°C下进行，数据使用MicroCal PEAQ ITC软件分析。应用基线校正，并使用Nitpic/Sedphat进行自动积分以确保准确的结合参数确定。

**NMR**

NMR光谱在Bruker 800 MHz光谱仪上获取（18.8 T），配备AVIV控制和5 mm液体态TCI（1H/2H/13C/15N）氦冷探针。实验在室温下进行，同时锁定D2O的氘信号。1H位移以Si(CH3)4（δ(1H) = 0 ppm）为参考，使用氘化溶剂的残留质子信号（δ1H = 4.704 ppm）作为次级参考。1H NMR光谱使用2.66 μs的30°脉冲，采集时间为2 s，谱宽为16 kHz，松弛时间（d1）为1 s。自由诱导衰减在65 K点处归零填充，并在傅里叶变换前乘以0.3 Hz的指数线宽函数。使用Bruker DOSY脉冲序列（ledbpgp2s）测量扩散系数。DOSY扩散时间间隔（d20）和梯度脉冲长度（p30）分别设置为2500 ms和100 ms，循环延迟（d1）为2 s。每个1D自由诱导衰减有32k个复杂点，平均32次扫描。扩散梯度从2%线性增加至98%以生成32个扩散级别。DOSY NMR数据处理使用Bruker Topspin（Bruker）和MestReNova（Mestrelab Research S.L.）软件完成。

**分子建模**

化合物1a的2D结构使用ChemDraw Ultra 14.0绘制，并使用Chem 3D保存为PDB文件格式。配体的3D结构被质子化，进一步通过MM2力场进行能量最小化优化，迭代步骤为10,000次，每次2 fs。然后使用优化后的配体进行对接研究。由于没有起始坐标，使用Autodock将化合物对接到蛋白质结构上。受体结构从RCSB蛋白质数据银行下载。使用的受体结构包括SARS-CoV-2 Omicron（PDB代码：7WBL）、RSV F蛋白（PDB代码：5EA3）、甲型流感病毒/Victoria/361/2011的血凝素（PDB代码：4WE8）和Wyoming/2003流感病毒血凝素（PDB代码：6BKR）（41）。使用AutoDock工具分配相应的原子电荷。活性盒大小约为100 × 100 × 100 ?，网格间距为0.375 ?。网格框放置在蛋白质结构中心。对接计算遵循标准协议，使用Lamarckian遗传算法。在对接过程中，蛋白质结构保持刚性，而分子保持灵活。总共进行了2,500,000次能量评估，种群大小为150。突变率为0.02，最大代数为27,000代。进行了50次运行以找到有利的结合构象。根据0.5 ?的均方根标准对构象进行聚类。使用VMD和Chimera可视化结构。进一步的详细分子相互作用分析使用Ligplot + v2.2.8完成。