dNLR（慢性中性粒细胞GVF受体α亚单位）和肿瘤浸润的中性粒细胞可以预测新辅助抗PD-1抗体卡姆瑞珠单抗（camrelizumab）及VEGFR2抑制剂阿帕替尼（apatinib）在治疗局部晚期可切除口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma）中的疗效

《International Journal of Surgery》：dNLR and tumor infiltrated neutrophils predict the efficacy of neoadjuvant anti-PD-1 camrelizumab and VEGFR2 inhibitor apatinib in locally advanced resectable oral squamous cell carcinoma

　　摘要

背景：尽管观察性数据表明，中性粒细胞与淋巴细胞比值（dNLR）与局部晚期可切除口腔鳞状细胞癌（LAROSCC）的预后相关，但其对新辅助治疗效果的预测作用尚未得到探究。本研究调查了动态dNLR变化与接受抗PD-1（camrelizumab）和VEGFR2抑制剂（apatinib）联合新辅助治疗的LAROSCC患者治疗效果之间的关联。

患者与方法：本研究回顾性分析了一项先驱性的、单中心的、开放标签的、非随机化的I期试验（NCT04393506）。2020年4月至12月期间，共有21名LAROSCC患者纳入研究。排除了一名在治疗开始前退治的患者后，20名患者完成了新辅助治疗[三个周期的静脉注射camrelizumab（200 mg，第1天、第15天和第29天）加上每日口服apatinib（250 mg），持续至术前5天]，随后进行根治性切除手术。其中18名患者随后接受了辅助放疗/化疗。

结果：在20名可评估患者中[中位年龄56.4（30–71）岁]，主要病理反应（≤10%存活肿瘤细胞）显示出不同的dNLR动态：治疗期间dNLR逐渐下降（P = 0.042）。多变量线性回归分析显示，干预后的dNLR与残留肿瘤负荷独立相关（β = 19.334，P = 0.006）。对手术标本进行多重免疫组化检测发现，dNLR升高的患者表现出增强的中性粒细胞浸润（R2 = 0.439，P = 0.002）和免疫抑制性肿瘤微环境特征。

结论：在新辅助camrelizumab-apatinib治疗过程中，dNLR的动态降低与改善的病理反应、免疫活性肿瘤微环境重塑以及LAROSCC患者的良好临床预后相关。这些发现将dNLR定位为一个实用的生物标志物，可用于实时监测免疫治疗的效果，但仍需要在大规模的前瞻性队列中进行验证。

亮点：抗PD-1（camrelizumab）和VEGFR-2抑制剂（apatinib）联合新辅助治疗在局部晚期可切除口腔鳞状细胞癌患者中显示出良好的5年生存预后。dNLR动态的下降可能反映了camrelizumab和apatinib联合治疗的更好效果。肿瘤浸润中的中性粒细胞可能诱导免疫抑制微环境，从而影响新辅助治疗的疗效。

引言：口腔鳞状细胞癌（OSCC）占所有口腔和颌面部恶性肿瘤的90%以上[1]，是头颈肿瘤领域的一个主要全球健康挑战。根据2022年全球癌症统计数据的流行病学分析[2]，2022年全球新诊断病例为389,485例，死亡病例为188,230例，这凸显了治疗管理的持续空白。对于局部晚期可切除OSCC（LAROSCC）患者，根据NCCN临床实践指南（NCCN Guidelines? Head and Neck Cancers Version 4.2024），长期以来推荐进行根治性手术，并辅以放疗或化疗。尽管采取了这种积极的多模式治疗方法，但长期预后仍然不理想，5年生存率徘徊在50%以下，这突显了开发新型治疗范式的迫切需求。免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现改变了头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的治疗策略。关键试验如KEYNOTE-048[3]和KEYNOTE-040[4]表明，pembrolizumab单药治疗在复发/转移性疾病中优于cetuximab-化疗组合[3,4]。在局部晚期疾病中，基于免疫治疗的新辅助治疗（NAT）在LAROSCC中显示出显著的治疗效果[5–8]。III期KEYNOTE-412试验[9]进一步显示，pembrolizumab联合化疗可提高无事件生存期（EFS）。然而，治疗局限性仍然存在：单药免疫治疗的客观反应率较低[22%（95% CI: 0.07–0.37）[10]，而免疫化学组合虽然达到的反应率较高[61%（95% CI: 0.42–0.79）[6]，但伴随着较大的毒性负担[3–4级治疗相关不良事件（TRAEs）：42%（95% CI: 0.15–0.70）[10]。这些发现共同强调了开发预测性生物标志物的关键必要性，以优化患者选择和治疗方案。基于这些临床挑战，camrelizumab（抗PD-1）和apatinib（VEGFR2抑制剂）的组合显示出优异的治疗效果，并且毒性较低。最近一项针对可切除肝细胞癌患者的II/III期试验表明，围手术期camrelizumab联合apatinib（CARES-009）使中位EFS延长至42.1个月[95% CI: 23.2–不可估计（NE）]，而仅接受手术治疗的患者中位EFS为19.4个月[95% CI: 14.9–NE，风险比（HR）0.59，95% CI: 0.41–0.85，P = 0.040][11]。我们的I期试验（NCT04393506）首次探索了camrelizumab（抗PD-1）联合apatinib（VEGFR2抑制剂）在LAROSCC中的新辅助治疗效果，显示出40%的主要病理反应（MPR）率，并且没有治疗相关的3级及以上不良事件。然而，治疗异质性仍然存在——60%的患者未能达到MPR，其中包括一例疾病进展[5]。在本I期试验中，PD-L1联合阳性评分（CPS）被证明是评估camrelizumab和apatinib联合治疗LAROSCC患者疗效的有效指标。同时，CPS已在多项免疫治疗试验中作为预测性生物标志物[3,5,12]，但其临床应用受到固有限制：连续肿瘤取样的侵入性和PD-L1表达的时间-空间异质性阻碍了动态治疗监测。这一关键需求凸显了开发非侵入性、实时生物标志物的必要性，以便追踪治疗动态并实现精准治疗。衍生中性粒细胞与淋巴细胞比值（dNLR）——通过计算中性粒细胞/(白细胞-中性粒细胞)获得——是一种易于获取的系统炎症指标，可通过常规全血细胞计数获得[13,14]。这种成本效益高的生物标志物已在多种实体瘤中显示出预测效果，升高的比值与不良临床结果相关[13,15–17]。值得注意的是，尽管中性粒细胞-淋巴细胞相互作用在肿瘤微环境调节中具有免疫学意义，但它们在新辅助免疫治疗中的预测潜力——特别是在OSCC中——仍需进一步探索。在我们日常的OSCC临床实践中，观察到在免疫治疗或NAT的长期治疗过程中，某些治疗相关的中性粒细胞、淋巴细胞或其他血细胞计数会发生变化。非小细胞肺癌的研究表明，早期dNLR变化与免疫检查点抑制剂（ICI）的临床结果相关[15]。持续的较高dNLR（基线和第2周期）与ICI治疗早期失败相关[18]。在一项招募了173名转移性实体瘤成年患者的试验中，保持良好的肺免疫预后指数（dNLR是计算该指数的主要指标）或向更好的预后类别转变与总体生存（OS）和无进展生存（OS）相关[19]。利用我们I期试验（NCT04393506）关于camrelizumab联合apatinib在LAROSCC中的数据，本研究首次评估了dNLR动态与肿瘤浸润中性粒细胞（TINs）的结合。我们旨在阐明它们在病理反应动态和生存结果方面的双重预测能力，从而解决这一新兴治疗范式中实时治疗监测的关键空白。然而，由于本研究基于I期试验的小规模样本，因此仅具有假设生成性质。本文符合TITAN Guidelines 2025[20]的要求。

方法与研究设计：这项二次分析使用了已完成的开标签I期IceMelting 1.0试验（NCT04393506）的数据，该试验研究了camrelizumab-apatinib组合在LAROSCC中的效果。详细的方法学和主要结果已发表[5]。主要纳入标准包括：1. 年龄18–75岁；2. 组织学确认的OSCC，临床分期III-IVA（AJCC第8版）；3. 东部合作肿瘤学组（ECOG）性能状态0–2；4. 具备进行根治性手术的器官功能。试验方案获得了上海交通大学医学院第九人民医院伦理委员会的批准（SH9H-2019-T351-2）。所有程序均遵循良好的临床实践指南和赫尔辛基宣言。在详细讨论了治疗的试验性质、潜在风险、未知疗效以及可用的标准护理方案后，从所有参与者处获得了书面知情同意书，然后进行生物标志物评估和治疗干预。

程序：参与者接受了三个周期的静脉注射camrelizumab（200 mg），分别在第1天、第15天和第29天，以及每日口服apatinib（250 mg），从第1天开始，直至预定手术前5天停止。计划在d42–45天进行根治性手术。根据最终病理分期，在术后6周内进行辅助放疗或化疗。外周血样本用于全血细胞计数（CBC）分析：1. 基线：治疗开始前≤5天；2. 连续监测：每个治疗周期后的每两周进行一次。dNLR通过计算中性粒细胞与CBC中总白细胞与中性粒细胞之比得出。先前已有报道指出，新辅助免疫治疗可引起肿瘤消退[5]。简要来说，在任何治疗之前，通过摄影和增强CT/MRI记录肿瘤基线。使用亚甲蓝在肿瘤可触及边缘0.5厘米处标记边界。NAT后，也记录了术前肿瘤特征。对于根治性切除手术，无论NAT引起的肿瘤缩小程度如何，切除边缘均保持0.5–1.0厘米。原始标记点作为确定手术安全边缘（距标记点0.5–1.0厘米）和病理肿瘤基线的参考。由对患者信息不知情的病理学家对剩余肿瘤切片进行苏木精和伊红（H&E）染色。在采样过程中，每个最大肿瘤直径至少获得1个3毫米的切片。之前已经展示了切片的标准化操作程序[5]。通过H&E染色评估所有切片中存活肿瘤细胞（RVT）的百分比。肿瘤基定义为“RVT + 凋死 + 消退区”（补充数字内容表S2，网址：https://links.lww.com/JS9/H207）。OSCC中免疫相关病理肿瘤消退区的定义和特征图像见补充数字内容表S3（网址：https://links.lww.com/JS9/H208）和补充数字内容图S3–S6（网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。RVT%通过累加所有肿瘤区域的总和然后除以所有切片中肿瘤基区域的总和来确定。两位资深病理学家进行了评估并达成共识。放射反应评估根据RECIST 1.1标准进行。

结果：主要终点是安全性（每CTCAE v5.0定义的3级及以上TRAE发生率）和MPR率（MPR，定义为RVT细胞占比≤10%）。次要终点包括2年生存率（定义为2年随访时存活的患者比例）和局部复发率（定义为发生局部复发的患者比例）。事后探索性分析用于评估纵向dNLR变化（基线/治疗后）、mIHC量化的肿瘤微环境特征、RVT和生存结果之间的关联。生存结果包括：1. OS：随机分配至全因死亡；2. 无病生存（DFS）：随机分配至复发/转移/死亡；3. 无局部复发生存（LRFS）：随机分配至局部分发；4. 无远处转移生存（DMFS）：随机分配至远处转移。这些探索性分析是假设生成的，并未在原始方案中预先规定。由于生物标志物关联的观察性质，未进行多重性调整。也未进行α调整。

免疫组化和多重免疫组化：PD-L1通过免疫组化使用两种经过验证的抗PD-L1抗体进行染色：E1L3N（Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯）和22C3（Dako North America Inc，美国加利福尼亚州卡平特里亚），然后量化CPS，定义为PD-L1染色细胞（包括肿瘤细胞、肿瘤相关淋巴细胞和巨噬细胞）的总数除以存活肿瘤细胞的总数，乘以100。使用Akoya OPAL Polaris 7-Color自动化IHC试剂盒（NEL871001KT）进行TIL评估。福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤切片在BOND RX系统（Leica Biosystems）中脱蜡，然后依次与针对CD163（Abcam，ab182422，1:500）、CD68（Abcam，ab213363，1:1000）、PD-1（CST，D4W2J，86163S，1:200）、CD3（Dako，A0452）、CD4（Abcam，ab133616，1:100）、CD8（Abcam，ab178089，1:100）、CD56（Abcam，ab75813，1:100）、CD20（Dako，L26，IR604）、FOXP3（Abcam，ab20034，1:100）、CD66b（GeneTex，GTX19779，1:100）和Pan-CK（Abcam，ab7753，1:100）的一级抗体孵育。然后将细胞与相应的荧光团二级抗体孵育。核酸用核染料/4′,6-二氨基-2-苯基吲哚进行染色。未使用荧光团的一级和二级抗体孵育的切片用作阴性对照。染色后，使用Vectra Polaris定量病理成像系统（Akoya Biosciences）在20纳米波长范围内对切片进行扫描，范围从440纳米到780纳米，曝光时间为固定，放大倍数为×200。所有切片的扫描结果叠加在一起得到单一图像。多层图像导入inForm v.2.4.8（Akoya Biosciences）进行定量图像分析。通过Pan-CK染色区分肿瘤实质和间质。各种细胞群体的数量表示为每平方毫米内染色细胞的数量。肿瘤实质区域中每个视野内中性粒细胞少于10个的患者被视为TINs阴性组。**统计分析**
使用RVT对外周循环衍生的dNLR进行了事后探索性分析，并进行了大约5年的随访。所有参与者的总生存期（OS）、无疾病生存期（DFS）、无远处转移生存期（LRFS）和无远处转移无复发生存期（DMFS）均使用Kaplan-Meier方法进行了评估。在最后一次联系时无事件发生的患者被视为右侧删失（right-censored）。使用对数秩检验（log-rank test）来检测事件时间分布的差异。为了获得β系数的估计值，分别构建了线性回归模型（linear regression models），并在单变量和多变量模型中进行了分析。通过逐步向后选择（backward stepwise selection）方法确定了最终模型。为了检测抗PD-1单药治疗的完全缓解率（MPR）从7%（基于pembrolizumab和nivolumab单药治疗的数据)[21]上升到30%，至少需要20名可评估的患者来确保90%的统计功效来识别这一变化。本研究采用单侧精确检验（one-sided exact test），显著性水平设定为0.050。生存率和复发率的置信区间（CIs）使用Brookmeyer–Crowley方法计算，MPR率的置信区间使用Clopper–Pearson方法计算。使用Fisher精确检验（Fisher’s exact test）比较观察到的MPR率与零假设下的率，以及分类变量之间的关联。根据不同的CPS临界值，使用Fisher精确检验计算MPR组与非MPR组患者数量之间的差异。MPR组与非MPR组之间的差异使用Mann-Whitney检验进行分析，同一组内治疗前后的指标变化使用Wilcoxon符号秩检验进行分析。所有P值均为双侧检验，置信区间为95%，显著性水平预先设定为<0.05，分析工具为IBM SPSS Statistics 25（IBM公司，美国纽约州阿蒙克）。

**患者群体**
从2020年4月到12月21日，共纳入了患有局部晚期直肠肛门鳞状细胞癌（LAROSCC）的患者（中位年龄56.4岁，范围30–71岁；男女比例=12:9）。排除一名在开始治疗前退出研究的患者后，20名患者接受了新辅助camrelizumab-apatinib治疗，随后进行了根治性切除术。18名患者（90%）接受了辅助放疗/化疗，其中两名患者因肺结核（n=1）和治疗相关精神障碍（n=1）而例外。基线临床病理特征详细列于表1中。大多数患者（85%，17/20）处于III期疾病状态，且淋巴结阴性（80%，16/20）。所有患者均使用ECOG量表进行了基线性能状态评估。大多数患者（16/21，76.2%）的ECOG PS评分为1，其余5名患者（23.8%）的评分为0。基线时，患者的体质指数（BMI）根据世界卫生组织标准进行分类。队列的营养状况分布如下：2名患者（9.5%）体重过轻，15名（71.4%）处于正常范围内，4名（19.0%）超重。 none患者入选时存在感染、持续使用类固醇或活动性合并炎症疾病。治疗相关的不良事件（TRAEs）主要为1-2级，包括高胆红素血症（40%）、血小板减少症（35%）和蛋白尿（30%）。未发生3级及以上的TRAEs。该研究的次要终点指标——MPR率从7%（基于pembrolizumab和nivolumab单药治疗的数据）提高到30%，需要至少20名可评估的患者才能保证90%的识别效力。本研究采用单侧精确检验，显著性水平设定为0.050。生存率和复发率的置信区间使用Brookmeyer–Crowley方法计算，MPR率的置信区间使用Clopper–Pearson方法计算。

**长期随访结果**
在长期随访中（平均57.0个月，中位数57.0个月），实现完全缓解（MPR）患者的总生存期（OS）、无疾病生存期（DFS）、无远处转移生存期（LRFS）和无远处转移无复发生存期（DMFS）分别为58.0个月、58.0个月、58.0个月和58.0个月。未实现MPR患者的相应指标分别为56.5个月、51.5个月、57.9个月、51.5个月和51.5个月。然而，由于事件发生较少，无法计算置信区间（CIs），生存概率为1.0。队列的详细生存结果见补充数字内容图S1A–S1D（网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。

**NAT后dNLR的变化**
对于系统性炎症指标的动态变化，对五种外周炎症生物标志物的纵向分析显示新辅助免疫治疗的不同反应性（图1A、1B，补充数字内容图S2A–S2D，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。在五种常用的炎症标志物（dNLR、NLR、PLR、LMR和PIV）中，dNLR是唯一一个在NAT后显示统计学显著降低的标志物（平均Δ = ?0.472，95% CI: (?0.933 至 ?0.012，补充数字内容表S1，网址：https://links.lww.com/JS9/H206）。基线时，平均dNLR为1.928 ± 0.874（范围0.647–4.263）。经过三个周期的NAT后，平均dNLR降至1.456 ± 0.500（范围0.629–2.623）。图1显示了NAT后的dNLR动态：（A）队列的dNLR变化；（B）每位患者的dNLR变化（?每个相同形状和颜色的点代表一名患者）；（C）基线PD-L1 CPS ≥ 20的患者与dNLR变化；（D）实现MPR与未实现MPR患者的dNLR变化。RVT与患者dNLR的关系在（E）基线和（F）NAT后；（G）dNLR降低或增加的患者的RVT。NAT后的dNLR下降与治疗反应阳性相关。

**PD-L1 CPS的作用**
从基线（治疗前）活检的PD-L1 CPS水平的预测能力在HNSCC免疫治疗中已被证实具有很强的预测性。Keynote-048的事后分析显示，PD-L1 CPS ≥ 20的患者比PD-L1 CPS < 20的患者具有更长的OS和无进展生存期[3,12]，这与我们的长期随访结果一致（补充数字内容图S1E–S1H，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。实现MPR的患者在长期随访中显示出良好的生存预后[5]。我们之前报道过，在OSCC患者中，实现MPR的患者可能有机会免除辅助放疗[22]。本研究发现，在长期随访期间，所有实现MPR的患者都表现出无事件生存（EFS，补充数字内容图S1I–S1L，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。基线PD-L1 CPS显示出预期的预后分层，但dNLR的时间轨迹显示出更强的预测能力。PD-L1 CPS ≥ 20的患者在NAT后的dNLR低于PD-L1 CPS < 20的患者（t = 2.151，P = 0.045，图1C）。在NCT01542931研究中，对于接受术前手术加术后放疗或化疗的LAROSCC患者亚组，基线dNLR ≤ 1.555被确定为更好的预后的独立预测因素[23]。为了进一步验证NAT后dNLR临界值1.555是否足以预测NAT的治疗效果，绘制了接收者操作特征曲线并计算了曲线下面积（补充数字内容图S1U–S1X，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。对于OS、DFS、LRFS和DMFS，最优的Youden指数均出现在NAT后dNLR为1.571的患者中。与机制预期一致，所有实现MPR的患者（8/8）在NAT后的dNLR ≤ 1.555（图1D）。他们的NAT后dNLR也低于未实现MPR的患者（t = 2.799，P = 0.012，图1D）。实现MPR的患者在NAT后的dNLR显著下降（t = 3.181，P = 0.016，图1D）。MPR患者的dNLR下降与治疗周期数相关（图1B），表明具有累积的免疫调节效应。在实现MPR的患者中观察到dNLR的显著下降（图1B）。对于实现MPR的患者，dNLR的下降与治疗周期数相关（图1B）。在未实现MPR的患者中，只有50%（6/12）的dNLR下降（P = 0.042，Fisher精确检验）。对于实现MPR的患者，dNLR在第一周期NAT后就开始下降（t = 3.238，P = 0.014，补充数字内容图S2E，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。在实现MPR的三名患者中，基线PD-L1 CPS < 10；然而，他们在第一周期NAT后都表现出dNLR下降（t = 6.206，P = 0.025，补充数字内容图S2F，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。而对于未实现MPR的患者，第一周期NAT后未观察到dNLR下降（t = 1.512，P = 0.159，补充数字内容图S2G，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）或在三个周期NAT后均无下降（t = 1.512，P = 0.381，补充数字内容图S2G，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。NAT后的dNLR与残余肿瘤负担呈线性相关（R2 = 0.440，P = 0.001，图1F），而基线水平则无关（R2 = 0.003，P = 0.826，图1E）。进一步根据NAT后的dNLR轨迹对患者进行分层，发现治疗效果存在明显差异。在dNLR下降的组中，8/14的患者实现了MPR，而在dNLR上升的组中没有任何患者实现MPR（t = 3.065，P = 0.007，图1G）。然而，在生存分析中，尽管样本量较小，dNLR下降亚组在log-rank检验中并未显示出更好的生存预后（补充数字内容图S1M–S1P，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。从这些数据可以得出，dNLR的下降可能与NAT的治疗效果呈正相关。

**TINs与治疗反应的关系**
虽然外周血dNLR提供了系统性炎症的指标，但其无法反映局部免疫相互作用，因此需要进一步研究。我们对根治性切除术的切片进行了多重免疫组化（multiplex IHC），以空间上绘制中性粒细胞（CD66b+）、淋巴细胞（CD3+）和肿瘤上皮细胞（Pan-CK+）的分布（图2A-B）。通过Pan-CK染色区分肿瘤实质和基质。在肿瘤实质中，实现MPR的患者表现出较低的TINs密度（t = 3.800，P = 0.001，图2C），而在基质部分，中性粒细胞浸润无分层差异（t = 1.776，P = 0.093，图2C）。TINs阴性的肿瘤组具有免疫学上有利的微环境，这些肿瘤在预处理时PD-L1 CPS较高（25.625 ± 30.190 vs 3.417 ± 3.728，t = 2.554，P = 0.020，图2D），并且RVT较低（7.029 ± 9.143 vs 35.595 ± 13.136，t = 5.328，P < 0.001，图2E），从而具有更好的治疗效果。接下来研究了外周肿瘤炎症是否耦合。NAT后的dNLR与肿瘤实质中的TINs负担强相关（R2 = 0.439，P = 0.002，图2G），形成了“血液-肿瘤中性粒细胞轴”，但与基线dNLR无关（R2 = 0.011，P = 0.658，图2F）。TINs阴性的肿瘤患者表现出更强的dNLR反应（1.848 ± 0.663 vs 1.047 ± 0.241，t = 3.756，P = 0.007，图2H），而TINs阳性的肿瘤患者的NAT后dNLR较低（1.047 ± 0.241 vs 1.728 ± 1.653，t = 3.802，P = 0.001，图2H）。然而，从Kaplan-Meier生存分析来看，TINs阴性组在NAT后的生存益处并不明显，因为样本量较小（补充数字内容图S1Q–S1T，网址：https://links.lww.com/JS9/H205）。综合这些数据，我们可以推测dNLR的下降可能与NAT的治疗效果呈正相关。虽然外周血dNLR提供了系统性炎症的指标，但其无法反映局部免疫相互作用，因此进一步研究了中性粒细胞（CD66b+）、淋巴细胞（CD3+）和肿瘤上皮细胞（Pan-CK+）的空间分布。治疗后dNLR和TINs的增加与肿瘤微环境的免疫抑制作用有关。为了将全身炎症指标与肿瘤微环境中的免疫活性联系起来，我们对外周dNLR和mIHC量化的肿瘤微环境成分进行了空间相关性分析。在Pan-CK+定义的肿瘤实质（1平方毫米的感兴趣区域）内，对淋巴细胞亚群（CD3+/CD4+/CD8+/CD20+）和中性粒细胞（CD66b+）进行了数字计数。中性粒细胞与淋巴细胞的比值计算为CD66b+/目标淋巴细胞群体。在dNLR降低的组中，发现全局淋巴细胞参与度较高，其肿瘤实质中的CD66b/CD3比率与治疗后的dNLR相关（R2 = 0.243，P = 0.027，图3A），而CD66b/CD8比率也显示出强相关性（R2 = 0.272，P = 0.032，图3B），这表明了细胞毒性T细胞的特异性。这些验证的关联确立了dNLR动态作为肿瘤实质中中性粒细胞-淋巴细胞失衡的非侵入性指标，而对于CD4+（P = 0.395）或CD20+亚群或肿瘤基质区的淋巴细胞亚群则未观察到显著相关性。图3：治疗后dNLR与mIHC衍生的炎症指数的相关性。（A）肿瘤实质中的CD66b+/CD3+细胞，（B）CD66b+/CD8+细胞，（C）CD66b+/CD4+细胞，（D）CD66b+/CD20+细胞，（E）肿瘤基质中的CD66b+/CD3+细胞，（F）CD66b+/CD8+细胞，（G）CD66b+/CD4+细胞，以及（H）肿瘤基质中的CD66b+/CD20+细胞。新兴证据表明，dNLR动态可能反映了NAT过程中的肿瘤-免疫重编程[15,24]。在这组患者中，治疗后dNLR升高的患者显示出独特的特征：肿瘤实质中M0样巨噬细胞的浸润增加（CD68+CD163?，24 ± 21 vs 89 ± 62细胞/平方毫米，t = 3.083，P = 0.027，图4B），这可能是由中性粒细胞介导的趋化作用驱动的，而基质中的CD3+ T细胞密度减少了41%（2166 ± 1625 vs 1116 ± 779，t = 2.365，P = 0.034，图4F）。相反，dNLR降低与免疫刺激趋势相关：基质中的PD-1+CD8+ T细胞减少了32%（7 ± 9 vs 2 ± 4，t = 1.798，P = 0.095，图4J），调节性T细胞（CD4+FOXP3+）减少了28%（109 ± 144 vs 56 ± 73，t = 1.213，P = 0.247），尽管不显著，但这可能表明免疫耗竭和免疫抑制有所减弱。这些空间变化——dNLR无反应者中的髓系炎症与反应者中的淋巴细胞激活——表明dNLR是局部免疫重塑的全身警戒信号。从机制上讲，中性粒细胞的清除可能会破坏促肿瘤发生级联反应，从而允许CD8+ T细胞重新活跃，尽管需要更大的队列来验证这些初步关联。图4：治疗后dNLR增加或减少的患者的时间变化。（A）CD68+CD163+细胞；（B）CD68+CD163–细胞；（C）CD8+细胞；（D）CD4+细胞；（E）CD20+细胞；（F）CD3+细胞；（G）CD56+亮细胞；（H）CD56+暗细胞；（I）CD68+PD-L1+细胞；（J）CD8+PD1+细胞；（K）CD4+FoxP3+细胞。采用线性回归模型分析了基线和术前RVT与变量之间的关系，以评估其预测NAT效果的能力。在单变量线性回归模型中，治疗后dNLR [β = 23.732 ± 6.307，t = 3.763，P = 0.001，95% CI (10.481–36.982)] 和基线PD-L1 CPS [β = ?0.458 ± 0.168，t = ?2.726，P = 0.014，95% CI (?0.812 to ?0.105)] 与RVT相关。在单变量分析中达到显著性的变量（P < 0.050）被纳入多变量线性回归模型。治疗后dNLR仍然是RVT的唯一显著独立预测因子 [β = 19.334 ± 6.221，t = 3.108，P = 0.006，95% CI (6.209–32.458)，表2。由于样本量较小，未进行Cox回归模型来分析OS、DFS、LRFS或DMFS。表2 - RVT线性回归。向左或向右滚动查看整个表格。单变量 多变量 B SE t P 95% CI B SE t P 95%CI 性别（与女性相比） 2.507 8.587 0.292 0.774 ?15.533, 20.546 年龄（与<60岁相比） 4.848 8.531 0.568 0.577 ?13.074, 22.771 cT（cT IV vs. cT III） cT ?6.871 13.961 ?0.492 0.629 ?36.202, 22.461 cN（与N-相比） cN ?5.912 6.296 ?0.939 0.360 ?19.141, 7.316 cTNM（与III期相比） cTNM ?7.551 10.390 ?0.727 0.477 ?29.380, 14.277 吸烟状况（与阴性相比） 吸烟（与阴性相比） ?2.507 8.587 ?0.292 0.774 ?20.546, 15.533 饮酒状况（与阴性相比） 饮酒（与阴性相比） ?2.507 8.587 ?0.292 0.774 ?20.546, 15.533 体重 体重 ?0.482 0.404 ?1.194 0.248 ?1.330, 0.366 身高 身高 ?0.282 0.447 ?0.630 0.537 ?1.221, 0.658 BMI BMI ?1.368 1.310 ?1.044 0.310 ?4.122, 1.385 基线DOI 基线DOI 7.932 13.930 0.569 0.576 ?21.334, 37.198 基线dNLR 基线dNLR 1.072 4.818 0.223 0.826 ?9.051, 11.195 治疗后dNLR 治疗后dNLR 23.732 6.307 3.763 0.001 10.481, 36.982 19.334 6.221 3.108 0.006 6.209, 32.458 CPS CPS ?0.458 0.168 ?2.726 0.014 ?0.812, ?0.105 ?0.298 0.147 ?2.021 0.059 ?0.609, 0.013 TMB TMB ?0.413 0.730 ?0.565 0.579 ?1.946, 1.121 实质 CD68+CD163+ ?0.041 0.227 ?0.180 0.859 ?0.519, 0.437 CD68+CD163- ?0.087 0.061 ?1.411 0.175 ?0.215, 0.042 CD8+ 0.007 0.020 0.371 0.715 ?0.034, 0.049 CD4+ ?0.005 0.022 ?0.241 0.812 ?0.050, 0.040 CD20+ 0.124 0.103 1.198 0.247 ?0.093, 0.341 CD3+ ?0.001 0.007 ?0.089 0.930 ?0.014, 0.013 CD56+亮细胞 ?0.126 0.471 ?0.268 0.792 ?1.116, 0.864 CD56+暗细胞 ?0.008 0.014 ?0.583 0.567 ?0.037, 0.021 CD68+PD-L1+ ?0.373 0.220 ?1.694 0.108 ?0.835, 0.090 CD8+PD-1+ 0.093 0.488 0.190 0.851 ?0.933, 1.118 CD4+FoxP3+ ?0.031 0.086 ?0.365 0.720 ?0.212, 0.149 斑状增生（Stroma） CD68+CD163+ 0.019 0.124 0.150 0.883 ?0.243, 0.280 CD68+CD163- ?0.105 0.063 ?1.670 0.112 ?0.238, 0.027 CD8+ 0.007 0.011 0.588 0.564 ?0.017, 0.030 CD4+ ?0.012 0.009 ?1.343 0.196 ?0.032, 0.007 CD20+ ?0.028 0.017 ?1.644 0.118 ?0.064, 0.008 CD3+ ?0.001 0.003 ?0.347 0.733 ?0.006, 0.005 CD56+亮细胞 ?0.120 0.148 ?0.810 0.429 ?0.432, 0.191 CD56+暗细胞 ?0.003 0.006 ?0.476 0.640 ?0.016, 0.010 CD68+PD-L1+ ?1.467 0.729 ?2.011 0.059 ?2.999, 0.065 CD8+PD-1+ 0.464 0.546 0.850 0.406 ?0.683, 1.611 CD4+FoxP3+ ?0.035 0.033 ?1.057 0.304 ?0.105, 0.035 讨论 报告称PD-1阻断是PD-L1阳性R/M HNSCC的合适的一线治疗[3,12]。对于局部晚期可切除疾病，基于PD-1阻断的新治疗策略以及随后的标准治疗（根治性手术加放疗或化疗）在一年或两年的短期随访中显示出预防疾病复发的价值。此外，PD-1阻断和化疗或靶向治疗的新辅助组合可以产生更高的MPR（35%–60%）[5,6,8,25]，而单PD-1阻断免疫治疗的MPR低于10%[21,26]。在这项研究中，camrilizumab和apatinib的新辅助组合对治疗后dNLR降低且PD-L1 CPS > 10的患者表现出更好的治疗反应。与我们之前的发现一致[5]，IceMelting 1.0（NCT04393506）的长期随访显示，达到MPR的患者比未达到MPR的患者有更长的生存期。大约60个月的随访后，MPR组的5年OS率更高。然而，病理反应只能在手术后通过病理检查发现，这不利于实时监测NAT的效果。在这里，我们报告了一个廉价的炎症标志物dNLR动态，它可以通过常规CBC测试在NAT期间轻松获得，并且与新辅助组合PD-1阻断剂camrilizumab和VEGFR-2抑制剂apatinib的治疗效果相关。这种治疗的实验状态强调了严格的伦理框架的重要性。我们的试验在严格的伦理监督下进行，确保患者充分了解他们正在接受一种风险和益处尚未完全确定的非标准实验性治疗。尽管有这些限制，但这样的开创性研究对于推进该领域至关重要。它们提供了初步的安全性和有效性数据，为更大规模、更明确的试验提供了依据。我们的结果为这一不断增长的证据体系做出了贡献，并有助于设计未来研究OSCC中的免疫靶向治疗组合。PD-L1 CPS在HNSCC的免疫治疗中显示出其预测价值。在R/M HNSCC患者中，CPS大于20通常表示更好的免疫治疗反应[12,27]。在术前活检中，PD-L1 CPS也可以预测免疫治疗反应。在NAT期间，MPR被视为新辅助治疗中生存期的早期替代终点[28,29]。我们之前报告，在LAROSCC患者中，所有PD-L1 CPS大于10的患者在选择camrilizumab和apatinib的新辅助治疗后都达到了MPR[5]。对于胃食管交界部可切除腺癌患者，PD-L1 CPS大于10的患者，pembrolizumab与新辅助化疗联合使用的pCR率显著高于低表达组（50.0% [4/8] vs 13.6% [3/22]；P = 0.046）[30]。在肌浸润性尿路上皮膀胱癌患者中，PD-L1 CPS ≥ 10%的患者中，根治性膀胱切除术（RC）的pCR率为54.3%（n = 35），而PD-L1 CPS < 10%的患者中仅为13.3%（n = 15）[31]。然而，一个悬而未决的问题是PD-L1 CPS是否足以评估免疫治疗的效力，因为并非所有术前PD-L1 CPS高的患者都表现出更好的免疫治疗反应，且只能通过Joao V Alessi等人（2021年）报告称，在开始一线 pembrolizumab 治疗之前，如果患者的 dNLR（中性粒细胞与淋巴细胞的比例）较低，其肿瘤微环境具有独特的特征：更多的 CD8+ T 细胞浸润，且在非小细胞肺癌（NSCLC）的免疫治疗中结果更为理想，相较于 dNLR 较高的患者[15]。在另一项研究中，对于晚期 NSCLC 患者，通过细胞计数发现基线时未成熟中性粒细胞（CD15+CD244-CD16low 细胞）的比例较高与较差的无进展生存期（PFS）/ 总生存期（OS）相关（P = 0.04；P = 0.0007），12 周的死亡率为 49%[18]。在晚期胃癌中，外周血中 NLR 的升高与肿瘤 RNA 测序显示的中性粒细胞浸润增加、IL-1b、ICAM1 和 VEGFA 基因表达上调相关[34]。同时，中性粒细胞在肿瘤微环境和肿瘤生物学中的作用因其主要表型不同而有所差异，由于释放到血液中的细胞因子，这些作用可能具有促肿瘤或抗肿瘤的特性[35]。这与我们的研究发现一致，即中性粒细胞浸润到肿瘤实质中以及 dNLR 的升高与口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的免疫抑制微环境相关。然而需要注意的是，在化疗或免疫化疗过程中，中性粒细胞计数和 dNLR 会受到粒细胞集落刺激因子（G-CSF）使用的影响，因为 G-CSF 被用来对抗化疗引起的骨髓抑制效应，因此在这种情况下 dNLR 的预测价值可能不适用。

Pranav Murthy 等人评估了 G-CSF 使用对 351 名接受基于化疗和胰腺切除术治疗的胰腺导管腺癌（PDAC）患者的影响，发现接受 G-CSF 的患者术后 NLR 更可能升高（>5.53，45.0% 对 29.6%；P = 0.004）。G-CSF 接受者体内中性粒细胞外陷阱的水平也更高（+709 vs –619 pg/ml；P = 0.006）。多变量分析显示，G-CSF 治疗与神经周围侵袭（HR：2.65；95% CI：1.16–6.03；P = 0.021）和边缘阳性切除（HR：1.67；95% CI：1.01–2.77；P = 0.046）相关。接受 G-CSF 的患者总生存期较短（中位生存期分别为 29.2 个月和 38.7 个月；P = 0.001）。G-CSF 的使用是总生存期的负面独立预测因子（HR：2.02；95% CI：1.45–2.79；P = 0.0001）。在对 301 名匹配患者的逆概率加权分析中，新辅助 G-CSF 使用与生存期缩短相关[36]。我们的结果应谨慎看待，因为这些结果是基于阿帕替尼（apatinib）和卡莫替尼（camrilizumab）联合治疗的，且未使用 G-CSF。因此，这项单臂、单中心一期试验（NCT04393506）[5] 的发现必须谨慎解读。尽管这项研究是从已完成的一期试验中得出的事后生物标志物分析，提供了机制上的洞察和假设生成的趋势，但必须充分认识到该研究的样本量较小（N = 20 名可评估患者），在任何关于普遍性的结论之前，需要在更大规模、随机化的、可能的多中心二期/三期试验中进行验证。正如所指出的，尽管像 dNLR 动力学这样的核心预测生物标志物与长期生存结果无关，但我们的主要目标已经实现，即证明了 dNLR 的下降与病理反应改善相关，并确认了其在预测联合治疗疗效方面的预测价值，这需要在更大规模的队列中进一步验证。

**结论**：总体而言，那些在联合使用阿帕替尼和卡莫替尼治疗后外周血 dNLR 水平降低（<1.555）的患者表现出更好的疗效，具有独特的免疫微环境特征，并更有可能获得良好的临床结果。鉴于肿瘤浸润中性粒细胞在肿瘤微环境中的作用尚不明确，需要进一步研究。将 dNLR 结果纳入临床评估可能有助于指导治疗策略的制定。