从西瓜液体成分废弃物中创造价值：通过光照和碳源调控微藻脂质及EPS（外多糖）的成分

《ACS Sustainable Resource Management》：From Watermelon Liquid Fraction Waste to Value: Modulation of Microalgal Lipid and EPS Profiles by Light and Carbon Sources

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西瓜种植会产生大量的季节性残留物，这些残留物通常被丢弃在田地里，其高糖分含量可能对环境造成不利影响。本研究旨在通过将西瓜液体残留物（WLFW）作为富含碳的培养基，在循环经济框架下探究其生物技术的价值化利用，用于培养普通小球藻（Chlorella vulgaris）和Scenedesmus sp.，并在两种光照条件下进行实验：白光（WL）和红蓝光（RLBL）。研究评估了光照质量对生物量产生、脂质积累和胞外多糖（EPS）合成的影响。在RLBL照射下，小球藻的EPS产量达到2.76 ± 0.36 g L?1，Scenedesmus的EPS产量达到5.03 ± 0.37 g L?1，相比WL条件增加了两倍。GC-MS和FTIR分析显示EPS组成存在明显的光依赖性变化，RLBL促进了两种菌株中葡萄糖的富集。脂质分析表明，不同菌株表现出特定的响应：RLBL增强了Scenedesmus中的单不饱和脂肪酸合成，并增加了小球藻中的油酸积累。总体而言，这些发现表明光照质量能够调节EPS的结构和组成，凸显了利用WLFW喂养的微藻培养在工业和生物技术领域的应用潜力。

1. 引言
农业工业部门产生了大量的废弃物，包括未售出或损坏的产品、加工副产品、废水以及厌氧处理产生的消化物。由于其复杂的化学成分，这些残留物需要适当的管理。(1,2) 微藻作为一种有前景的生物技术平台，可以用于这些废弃物的转化，因为它们能够吸收有机和无机化合物，生成生物量和高价值的次级代谢产物，同时有助于环境保护。(3?6) 微藻的应用符合联合国多个可持续发展目标（SDGs），包括清洁水和卫生（SDG 6）、可持续和清洁能源（SDG 7）、负责任的消费和生产（SDG 12）、气候行动（SDG 13）以及水下生命（SDG 14）。(7) 因此，近期研究集中在直接使用农业工业废弃物作为微藻培养基上，以减少预处理需求并降低生产成本，从而提高大规模应用的经济可行性。(8?10) 意大利以广泛的季节性农业生产为特点，产生了大量的农业工业废弃物，这些废弃物是生产生物燃料和生物产品（如沼气、生物乙醇和微藻生物量）的宝贵原料。(11?13) 农业废弃物的组成因作物类型和加工方法而异，这强调了需要针对特定微生物系统定制转化策略的必要性。一个典型的例子是西瓜种植，在意大利，西瓜种植面积约为9519公顷。收获后，由于市场限制，未售出的西瓜往往被留在田地里腐烂。西瓜中的高糖分会加速有氧和厌氧分解，导致温室气体排放或形成可能破坏土壤微生物群落的潜在生态毒素。(14,15) 然而，西瓜废弃物可以作为微生物过程的有效培养基，用于生产生物乙醇、沼气和增值生物分子。(15?18) 以往的研究主要以酵母和真菌发酵西瓜废弃物为主，利用其中高浓度的易发酵糖类（如葡萄糖和果糖）。(16,19,20) 相相比之下，关于微藻转化西瓜废弃物的研究仍然有限。初步筛选表明，Scenedesmus sp.和Chlorella sp.是将其整合到循环经济框架中的有前景的候选者。特别是西瓜废物的液体部分（WLFW）显示出作为生产胞外多糖（EPS）的潜力，适用于多个工业领域。(4,14) 然而，目前基于WLFW的微藻培养主要在白光条件下进行，尽管已有充分证据表明光照波长对微藻代谢和大分子合成有调节作用。(14,21)

胞外多糖是由微生物在面对环境压力（如光强度、渗透压、营养限制、温度波动、pH值和有毒化合物暴露）时合成的高分子量生物聚合物。(22) 它们的化学组成和物理化学性质取决于产生菌株和培养条件。在微藻中，EPS的产生通常在氮限制、光照胁迫或碳过剩条件下增强。(21,23) 由于具有絮凝、凝胶化和金属结合特性，微藻EPS在生物质采集、废水处理和植物生物刺激方面引起了广泛关注。(21?25) EPS合成高度依赖于菌株，并受碳源、光照条件和温度等非生物因素的影响。这些聚合物通常由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖和鼠李糖组成，在细胞保护、絮凝和营养交换中起着重要作用。(23,26,27) 光照质量和强度特别重要，因为EPS的生物合成与光合作用密切相关。研究表明，红光和蓝光可以增强Porphyridium cruentum和Chlorella vulgaris等物种的EPS产生。(28?30) 此外，不平衡的C:N比率和过量的碳供应可以刺激EPS的积累。(31?35) 然而，使用纯培养基会增加生产成本，从而限制了工业化的规模。用农业工业副产品替代这些培养基可以降低成本，同时支持循环经济和生物精炼原则。(14,36?39) 尽管有这样的潜力，但探索基于废弃物的培养策略以促进微藻EPS合成的研究仍然较少，显示出显著的研究空白。

在此背景下，本研究探讨了西瓜液体残留物（WLFW）作为中温小球藻和Scenedesmus菌株在两种光照条件（白光WL和红蓝光RLBL）下生产EPS的替代培养基的潜力。通过表征EPS产量和单糖组成，评估了光照质量和培养基组成对EPS合成的影响。

2. 材料与方法
2.1. 微藻菌株和西瓜液体残留物（WLFW）
普通小球藻（Chlorella vulgaris Beij. 863）和Scenedesmus sp. 329来自意大利那不勒斯Federico II大学的藻类收藏中心（ACUF）。培养物在25°C下，在添加了1 mL维生素混合物（硫胺素0.1 g 100 mL?1、生物素25 × 10?? g 100 mL?1、维生素B12 15 × 10?? g 100 mL?1）的Bold基础培养基（BBM）中，通过持续白光（1364 lux）和机械搅拌（150 rpm）维持。(14) 西瓜废弃物收集自意大利摩德纳的一个农业设施。根据Maletti et al. (18)和Scarponi et al. (14)的方法，通过离心（4500 rpm，5 min）和过滤（Whatman滤纸）获得液体部分（WLFW）。本研究中使用的WLFW与先前的研究相同。(14,18) 在之前的研究中，(14) 在相同实验条件下，使用WLFW作为阴性对照，在7天内没有观察到EPS形成或聚合。WLFW的组成已有所报道，(18) 其总可溶性碳水化合物、蛋白质和脂质的含量分别为32.6 ± 1.2%、3.53?4.85%和1.50?3.13%。元素组成（C, H, N, S）使用CHNS分析仪（FLASH2000，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定，方法参考Scarponi et al. (14)。使用前，WLFW通过高压灭菌进行消毒。

2.2. 实验设置
批次实验在500 mL稀释后的WLFW中进行，稀释比例为1:10（v/v），并在BBM中添加了维生素混合物，方法参考Scarponi et al. (14)。初始细胞密度分别为Chlorella 3.64 ± 0.82 × 10? cells mL?1和Scenedesmus 0.51 ± 0.31 × 10? cells mL?1，对应的生物量浓度分别为0.04 ± 0.00 g L?1和0.06 ± 0.02 g L?1。培养物在持续光照（24:0光:暗周期）、搅拌（160 rpm）和通气（275 L h?1）条件下维持7天。评估了两种光照条件：白光（WL，3012 lux）和红蓝光（RLBL，1219 lux）。所有实验均重复三次，并相应地进行分析。

2.2.1. 纯糖诱导EPS
为了研究EPS的诱导作用，Scenedesmus sp.在添加了纯糖溶液（葡萄糖或果糖9 g L?1）的BBM中培养，这些糖的浓度反映了WLFW中的糖含量。(14) 糖溶液以1:10的比例稀释，并在使用前通过高压灭菌消毒。初始接种密度为1.01 ± 0.06 × 10? cells mL?1，对应的生物量浓度为0.05 ± 0.01 g L?1。培养物在灭菌的200 mL玻璃烧瓶中，在持续搅拌（160 rpm）和通气（275 L h?1）条件下，在白光（WL，965.4 ± 97.4 lux）或红蓝光（RLBL，987.5 ± 154.8 lux）下生长7天。所有实验条件均重复两次。

2.3. 生物量监测
生物量增长通过Bürker计数器直接计数和干重测定进行，方法参考Scarponi et al. (14)。冷冻干燥后的生物量（Heto LyoLab 3000，Analitica de Mori，意大利米兰）用于根据Bligh & Dyer方法提取脂质。(40) 脂酸甲酯（FAMEs）通过使用0.4%（v/v）KOH的甲醇进行酯交换反应制备（lipid-to-reagent ratio 1:0.5，v/v），反应温度为55°C，时间为3 h，方法参考Jayakumar et al., (8)，随后通过GC-MS进行分析。(41) FAME分析使用Agilent 7890B气相色谱仪进行，配备毛细管柱（25 m × 0.2 mm ID，膜厚度0.5 μm），柱壁涂有（5%）-二苯基-(95%)-二甲基聚硅氧烷作为固定相。样品（1 μL）以1:50的分流模式手动注入。注射器温度设置为250°C，冲洗流速为3 mL min?1。载气为氦气，流速为1.2 mL min?1。加热程序如下：初始温度130°C保持2 min，然后以10°C min?1升温至230°C，并保持2 min。柱流出物引入Agilent 5977B GC/MSD（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）的离子源。传输线和离子源温度分别设置为260°C和230°C。离子化采用电子撞击（EI），能量为70 eV，发射电流为35 μA，m/z范围为50?650。数据采集在溶剂延迟240秒后开始，检测器电压范围为1500至2000 V。

2.4. EPS的回收与表征
培养后，通过离心（4500 rpm，10 min）分离EPS。上清液收集后冷冻干燥，并通过乙醇沉淀法回收EPS，遵循既定规程。(42) 纯化的EPS随后通过ATR-FTIR和GC-MS进行分析。

2.4.1. EPS表征
2.4.1.1. ATR-FTIR
ATR-FTIR光谱使用PerkinElmer Spectrum TWO仪器（UATR-FTIR，软件版本10.6.0.893）获取。光谱通过平均八个干涉图记录，分辨率为4 cm?1。背景光谱在相同条件下收集并自动减去。

2.4.1.2. GC-MS
单糖标准品（D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、D-鼠李糖、D-阿洛糖和D-阿拉伯糖）和苯基β-D-葡萄糖苷（内标）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。EPS样品用3 M三氟乙酸（TFA，2 mL）在110°C下处理4 h，然后在50°C下蒸发溶剂。(43) 冲洗后的残留物在含有1%三甲基氯硅烷（TMCS）（250 μL）和内标（250 μL，100 ppm）的吡啶（2 mL）中衍生化，然后在70°C下孵育2 h。样品（1 μL）注入Agilent 6890N气相色谱仪，连接到5973质谱仪，配备DB-5毛细管柱（60 m × 250 μm，膜厚度1 μm）。载气为氦气，流速为3 mL min?1。加热程序如下：初始温度80°C保持2 min，然后以4°C min?1升温至210°C，再以2°C min?1升温至250°C，并保持2 min。质量谱在电子离子化（EI）模式下获取，能量为70 eV，m/z范围为50?650。单糖相对于标准品进行鉴定和定量。

2.5. 微生物污染物的分离与鉴定
为了验证EPS的产生完全来自微藻代谢，评估了潜在的微生物污染物。从最终培养物中取一份样品（100 μL）转移到10 mL Trptic Soy Broth（TSB；Oxoid S.p.A.，意大利米兰）中，在37°C下培养24小时。在富集处理后，取20 μL样本涂布在选择性培养基和鉴别培养基上，以分离细菌和真菌群体：胰蛋白酶大豆琼脂（TSA；Oxoid S.p.A., 米兰, 意大利）、甘露醇盐琼脂（MSA；Oxoid S.p.A., 米兰, 意大利）用于分离葡萄球菌属；麦康凯琼脂（MAC；Oxoid S.p.A., 米兰, 意大利）用于分离肠杆菌科；德曼-罗戈萨-夏普琼脂（MRS；Oxoid S.p.A., 米兰, 意大利）用于分离乳酸菌；以及沙保德葡萄糖琼脂（SDA；Oxoid S.p.A., 米兰, 意大利）用于分离酵母和真菌。分离出的菌落使用VITEK MS系统（bioMérieux, 弗洛伦斯, 意大利）进行鉴定，该系统是一种自动化的MALDI-TOF平台，并配备了FDA 510(k)认证的微生物数据库。这一程序确保了第2.4节和2.4.1节中分析的EPS来源于微藻的生物合成，而非微生物污染。

2.6 统计分析
所有实验均重复三次进行，结果以平均值±标准差的形式报告。统计显著性通过双尾Student’s t检验进行评估，显著性水平分别为p < 0.05和p < 0.01。数据分析使用Microsoft Excel（Microsoft 365, Office 2024）完成。

3. 结果与讨论
3.1 微藻生长与脂质特性
正如Scarponi等人之前报道的（14），与标准培养基相比，WLFW条件下的微藻增殖受到不利影响，这可能是由于其C:N比例不平衡所致。此外，EPS的合成导致培养基凝胶化，使得基于细胞计数和干重测量的传统生物量量化方法变得复杂。尽管存在这些限制，但在WL条件下培养的Chlorella和Scenedesmus的细胞密度均高于RLBL条件（图1）。有趣的是，干重测量显示了相反的趋势：WL条件下的生物量产量为0.15 ± 0.07 g L?1，而RLBL条件下为0.77 ± 0.32 g L?1。对于Scenedesmus，WL条件下的生物量产量为0.41 ± 0.18 g L?1，RLBL条件下的生物量产量为0.49 ± 0.01 g L?1，表明两种光照条件下没有显著差异。这些发现突显了不同菌株对光谱和底物组成的特异性响应。
图1：在WL和RLBL条件下培养的Chlorella和Scenedesmus的生物量监测
Torres-Martínez等人（44）和Fathey等人（45）也报告了RLBL条件下微藻生长的显著增强，他们观察到Scenedesmus的生长速率比WL条件下更快（0.54?0.70 d?1 vs 0.20?0.24 d?1）。本研究中获得的生物量数值与Scarponi等人（14）的结果一致，后者使用WLFW作为底物时分别测量得到0.16 g L?1和0.95 g L?1的生物量。相比之下，Pandey等人（46）报道在使用纯葡萄糖（10 g L?1）作为碳源的情况下，Scenedesmus sp. ASK22的生物量显著更高（4.67 g L?1）。其他Scenedesmus菌株（如S. quadricauda和Scenedesmus sp. R-16）也报告了类似的产量数据（47,48），这表明底物组成和菌株特异性代谢特性对生长有重要影响。
在RLBL和WLFW条件下还观察到了形态变化，包括Scenedesmus细胞大小的减小，这可能是其对非生物胁迫的适应性反应，这种反应可能影响其生存能力、大分子合成以及色素组成（45）。
脂质积累和组成受到光照条件和菌株身份的强烈影响。光照质量调节光合作用活性并触发脂质生物合成的代谢转变（49），在高强度光照下饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例有助于光系统II的恢复（50）。因此，光照波长和强度的变化可以促进脂质积累作为能量储存机制；然而，脂质组成仍高度依赖于菌株特性和培养条件（49,51,52）。在本研究中，RLBL条件下的Chlorella生物量增加，而WL条件下的脂质积累更多。Chlorella的总脂质含量分别为20.83 ± 5.89%（WL）和17.01 ± 1.59%（RLBL），而Scenedesmus的总脂质含量分别为26.51 ± 16.90%（WL）和52.77 ± 3.92%（RLBL）。这些结果与Scarponi等人的研究结果一致（14）。在RLBL条件下，观察到的模式表明代谢转变是由过量的碳和不平衡的C:N比例驱动的，这种条件会导致碳通量重新分配到大分子合成（包括EPS和脂质）中（21,22,52?56）。
脂肪酸组成表现出明显的菌株特异性响应（图2及支持信息表S1）。在Chlorella中，WL条件下的饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）的比例分别为79.71%、14.23%和7.95%，而在RLBL条件下这些比例变为32.54%、49.12%和17.73%。在Scenedesmus中，WL条件下SFA比例为93.56%、MUFA比例为7.47%，PUFA无法检测到；而RLBL条件下SFA比例下降到72.29%，MUFA和PUFA分别增加到15.45%和12.24%。这些结果与Scarponi等人的研究结果一致（41），并突显了光照特异性代谢调控的作用。总体而言，WL条件有利于SFA的积累，而RLBL条件促进了MUFA和PUFA的合成。
图2：在WL和RLBL条件下培养的Chlorella和Scenedesmus的脂质积累和脂肪酸组成。（a）总脂质含量；（b）饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）的相对比例；（c）详细脂质谱。*表示统计显著差异（p < 0.01）。
Torres-Martínez等人（44）和Fathey等人（45）也报告了RLBL条件下微藻生长的显著增强，他们观察到Scenedesmus的生长速率较WL条件下更快（0.54?0.70 d?1 vs 0.20?0.24 d?1）。本研究中获得的生物量数值与Scarponi等人的结果一致，后者使用WLFW作为底物时测得Chlorella和Scenedesmus的生物量分别为0.16 g L?1和0.95 g L?1。相比之下，Pandey等人（46）报道在添加了10 g L?1葡萄糖的WL条件下培养的Scenedesmus sp. ASK22的生物量显著更高（4.67 g L?1）。其他Scenedesmus菌株（如S. quadricauda和Scenedesmus sp. R-16）也报告了类似的产量结果（47,48），这表明底物组成和菌株特异性代谢特性对生长有重要影响。
RLBL和WLFW条件下还观察到了形态变化，包括Scenedesmus细胞大小的减小，这可能是其对非生物胁迫的适应性反应，这种反应可能影响其生存能力、大分子合成以及色素组成（45）。
脂质积累和组成受到光照条件和菌株身份的显著影响。光照质量调节光合作用活性并触发脂质生物合成的代谢转变（49），在高强度光照下饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例平衡有助于光系统II的恢复（50）。因此，光照波长和强度的变化可以促进脂质积累作为能量储存机制；然而，脂质组成仍高度依赖于菌株特性和培养条件（49,51,52）。在本研究中，RLBL条件增强了Chlorella的生物量，而WL条件下的脂质积累更多。Chlorella的总脂质含量分别为20.83 ± 5.89%（WL）和17.01 ± 1.59%（RLBL），而Scenedesmus的总脂质含量分别为26.51 ± 16.90%（WL）和52.77 ± 3.92%（RLBL）。WL条件下的这些结果与Scarponi等人的研究一致（14）。RLBL条件下观察到的模式表明代谢转变是由过量的碳和不平衡的C:N比例驱动的，这种条件会导致碳通量重新分配到大分子合成（包括EPS和脂质）中（21,22,52?56）。
脂肪酸组成表现出明显的菌株特异性响应（图2及支持信息表S1）。在Chlorella中，WL条件下的饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）的比例分别为79.71%、14.23%和7.95%，而在RLBL条件下这些比例变为32.54%、49.12%和17.73%。在Scenedesmus中，WL条件下SFA比例为93.56%、MUFA比例为7.47%，PUFA无法检测到；而RLBL条件下SFA比例下降到72.29%，MUFA和PUFA分别增加到15.45%和12.24%。这些结果与Scarponi等人的研究结果一致（41），并强调了光照特异性代谢调控的作用。总体而言，WL条件有利于SFA的积累，而RLBL条件促进了MUFA和PUFA的合成。
图2：在WL和RLBL条件下培养的Chlorella和Scenedesmus的脂质积累和脂肪酸组成。（a）总脂质含量；（b）饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）的相对比例；（c）详细脂质谱。*表示统计显著差异（p < 0.01）。
在Chlorella中，RLBL条件下ω-9脂肪酸（包括4,7,10,13-十六碳四烯酸、7-十六烯酸和油酸）的相对含量增加，这些脂肪酸具有营养和药理价值（57）。富含这些脂质的生物体可以用于水产养殖或家禽饲料，以提高氧化稳定性和改善肉质（58,59）。缺乏亚油酸表明其具有较高的氧化稳定性，这与欧洲生物柴油标准EN 14214一致（2,60）。然而，总体生物量生产力和脂质产量仍低于经济可行的生物柴油生产所需阈值（>39 g L?1 d?1和>40%的脂质含量（61）。
先前的研究表明，外源碳源的存在会降低PUFA含量。Chu等人（62）报告葡萄糖浓度超过0.1%会抑制Ankistrodesmus convolutus的脂肪酸去饱和。同样，Manzoor等人（63）观察到在甘蔗渣水解物上培养的Scenedesmus dimorphus中SFA含量增加，而Pandey等人（46）在用葡萄糖（10 g L?1）培养Scenedesmus sp. ASK22时也观察到了类似的趋势。Ogbonna等人（64）在含有0.2%葡萄糖的混合营养培养条件下也观察到MUFA增加和PUFA减少。Scarponi等人（14）使用WLFW作为底物时，在Scenedesmus sp. 145中也获得了类似的产量结果，这进一步证实了碳源、光照质量和菌株选择共同调节脂质代谢。尽管关于微藻脂质生物合成的基因组学和代谢组学的研究仍在进行中，但已知几种培养因素会影响脂质含量和脂肪酸组成。外源碳源（如乙酸或葡萄糖）可促进脂质积累（65），而光照波长和强度强烈影响微藻代谢和脂质谱（66）。营养胁迫，特别是氮限制，也会促进脂质储存，尤其是在高C:N比例条件下（67）。在氮饥饿条件下，细胞会下调与生长相关的途径，并将碳通量重新分配到脂质生物合成中，涉及丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）、PDHC旁路和糖酵解等途径（68）。然而，正如Li等人（69）所指出的，脂质和碳水化合物的生物合成途径竞争碳的分配，这种分配机制尚未完全理解（66）。
光照波长进一步以菌株特异性的方式调节脂质积累。Ra等人（51）报告绿光能促进棕榈酸的形成，而Maltsev等人（49）观察到在高光照强度下Synechococcus sp. PCC 7941的脂肪酸去饱和增强。蓝光发光二极管（LED）能增加Chlorella vulgaris、Nannochloropsis sp.、Tetraselmis sp.和Isochrysis galbana的脂质积累，而白光能增加Haematococcus lacustris的脂质含量。红光能促进Botryococcus braunii和Nannochloropsis sp.的脂质积累，红蓝光组合能进一步增加C. vulgaris、Scendesmus obliquus和Diacronema lutheri的脂质生产（49）。
脂肪酸组成在不同菌株中也表现出差异：蓝光能增加C. vulgaris和S. obliquus的PUFA含量，而红光和蓝光都能促进SFA的积累（41）。在本研究中，Scenedesmus sp.对培养基组成和光照条件表现出双重响应：在WL条件下，由于其高C:N比例，脂质积累增加，SFA含量上升而PUFA含量下降；而在RLBL条件下，MUFA和PUFA含量增加。

3.2 EPS合成与特性
Scarponi等人（2）报告在WLFW条件下培养Chlorella和Scenedesmus时培养基发生凝胶化，将其归因于EPS生物合成的增强。作者认为这一现象在Scenedesmus中尤为明显，可能是由于底物的C:N比例不平衡所致。Babiak和Krzeminska（22）也证明了几种非生物因素（包括光照质量）可以刺激微藻的EPS生产。在本研究的RLBL条件下也观察到了类似的响应。对于Chlorella，WL条件下的EPS产量为2.32 ± 0.13 g L?1，RLBL条件下的EPS产量为2.76 ± 0.36 g L?1，两种光照处理之间没有显著差异。相比之下，Scenedesmus表现出明显的光依赖性响应，EPS产量从WL条件下的2.70 ± 0.29 g L?1增加到RLBL条件下的5.03 ± 0.37 g L?1（p < 0.05）。这些数值超过了Chlorella minutissima、C. sorokiniana和Botryococcus braunii的报道值（分别为0.25 ± 0.00 g L?1、0.16 ± 0.00 g L?1和0.12 ± 0.00 g L?1），以及在使用75%稀释的市政废水培养的Scenedesmus SD07的产量（0.37 g L?1）（70）。
EPS生产具有高度的菌株特异性，并受到非生物胁迫的强烈影响（5）。例如，在混合营养条件下培养Arthrospira platensis和Chlorella sp.时，当提供葡萄糖作为碳源时，EPS合成显著增强，产量分别为0.29 g L?1和1.14 g L?1（71,72）。同样，Nostoc sp.在光照胁迫下也表现出较高的EPS产量，在40 μE和80 μE光照下分别产生0.15 g L?1和0.21 g L?1的EPS。在两阶段系统中，A. platensis和Porphyridium sordidum在40 g L?1 NaCl和低光照强度（10 μE）条件下第二阶段分别产生了0.98 g L?1和0.17 g L?1的EPS。Scarponi等人（14）进一步提出，WLFW的不平衡组成可能诱导代谢转变，从而使葡萄糖和果糖等碳源通过三羧酸循环和Embden-Meyerhof途径生成ATP。然而，较高的C:N比例限制了生物量生长，从而将碳通量重新分配到脂质或EPS生物合成中。尽管潜在的调控机制尚未完全理解，但这些响应似乎依赖于菌株特性和非生物胁迫因素。
总体而言，微藻中的EPS合成受到多种因素的复杂调控，包括盐度、氮的可用性、N:P比例、光照强度和质量、碳浓度、温度和搅动（73）。Scenedesmus obliquus、C. vulgaris、B. braunii、C. ellipsoidea、Dunaniella salina、Chlamydomonas sp.和Oocystis sp.等物种的EPS产量范围为0.05至0.95 g L?1（73）。
与之前的研究相比，本研究表明WLFW提供了一个富碳的环境，特别适合EPS的过量生产，尤其是在红蓝光条件下。虽然早期研究表明红蓝光会促进生长或脂质积累，但本发现表明光照质量同时调节EPS产量、脂质组成和碳分配，表明这是一种更综合的代谢响应。尽管实现了较高的EPS产量，但生物量生产力和脂质含量仍低于生物燃料应用所需的阈值，表明该系统目前更适合生物聚合物的生产。此外，不同菌株之间的差异表明需要针对特定菌株进行工艺优化，这可能限制了直接的可扩展性。

3.2.1 ATR-FTIR
从WL和RLBL条件下培养的Chlorella中分离出的EPS的ATR-FTIR光谱（图3）显示出几乎相同的轮廓，透射带有广泛的重叠。这种光谱一致性表明光照条件的变化并未在1014?1023 cm?1区域的强烈光谱带是糖苷键的C?O?C和C?O伸缩振动的特征，这支持了EPS基质中多糖结构占主导地位的观点。(34,74)总体而言，FTIR光谱与先前报道的标准培养条件下微藻EPS的光谱一致，表明其组成主要由碳水化合物构成，同时含有蛋白质和少量脂质成分。WL和RLBL处理之间的光谱差异不明显，这表明光照质量不会显著改变EPS的初级化学结构。然而，细微的结构变化或分子量分布的变化可能仅通过FTIR分析无法检测到，需要补充分析技术来进一步阐明。

图3：在白光（WL）和红蓝光（RLBL）条件下培养的小球藻（a, b）和Scenedesmus（c, d）产生的EPS的ATR-FTIR光谱。

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3.2.2 GC-MS表征
微藻产生的EPS（见图4和支持信息表S2）主要由葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖及相关糖衍生物组成。EPS的组成具有明显的菌株特异性，表现为不同的单体谱型和相对丰度。在球藻中，EPS主要由葡萄糖（19.3%）、阿拉伯糖（32.5%）、岩藻糖（4.5%）以及鼠李糖和葡萄糖醛酸的组合（38.5%）构成。(34,75)由于培养条件、培养基和分析方法的差异，直接与文献数据进行比较仍然具有挑战性，因为EPS的合成和单糖分布受到培养参数和应用压力的强烈影响。

图4：在白光（WL）和红蓝光（RLBL）条件下培养的球藻（a, b）和Scenedesmus（c, d）产生的EPS的GC-MS表征。*表示统计显著差异（p < 0.01）。

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在Scenedesmus中，葡萄糖占主导地位，占总单糖的50%以上。这一观察结果与Laroche、(76) Morais等人、(5)以及Zhang等人、(34)的先前研究一致，他们将D-葡萄糖、葡萄糖胺和D-甘露糖确定为Scenedesmus来源EPS的主要成分。总体而言，这些发现表明底物组成显著塑造了EPS的单糖谱型，而光照质量主要影响EPS的总产量，特别是在RLBL条件下。

在WLFW上培养的球藻中，RLBL增加了葡萄糖的含量，而WL促进了木糖的比例。先前的研究表明，光照照射调节了普通小球藻EPS中尿苷酸、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖的相对丰度，蓝光和红光增强了葡萄糖和半乳糖的积累。(77)使用合成培养基的研究也报告了类似的趋势，葡萄糖富集诱导了C. zofingiensis和C. vulgaris中葡萄糖、鼠李糖和甘露糖的合成增加。(35)这些结果表明，光照质量和底物组成是EPS生物合成的关键决定因素，驱动了单糖组成的菌株依赖性变化。

3.3 EPS的工业应用潜力
EPS因其流变学和生物活性特性而具有显著的工业潜力。富含鼠李糖和岩藻糖的多糖在化妆品、制药和食品系统中特别有价值，因为它们具有抗氧化、抗炎和保湿作用。它们的乳化性和成膜能力进一步支持了它们在可生物降解材料、生物絮凝剂和药物输送系统中的应用。对于食品或制药应用，EPS的生产需要无菌条件和高纯度。因此，基于废物的培养系统更适合用于环境应用，包括重金属生物吸附和碳氢化合物生物修复。在这些应用中，EPS有助于增强生物絮凝、金属结合和微生物聚集。(78?83)

3.4 微生物污染物的鉴定及其与EPS生产的潜在相互作用
为了确保观察到的EPS生产和组成模式仅归因于微藻的代谢作用，进行了微生物污染物的鉴定。结果确认，在实验条件下存在共存的细菌和真菌，但它们在代谢上是不活跃的。只有在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）、MacConkey琼脂和Sabouraud葡萄糖琼脂（SDA）上观察到微生物生长，表明存在革兰氏阴性细菌和丝状真菌。MALDI-TOF分析（VITEK MS，bioMérieux，佛罗伦萨，意大利）鉴定出的分离菌株为溶血性不动杆菌（Acinetobacter haemolyticus）和Kiliense沙罗克拉迪乌姆（Sarocladium kiliense）。溶血性不动杆菌是一种严格需氧、非发酵细菌，常见于土壤、淡水和临床环境中，(84,85)而Kiliense沙罗克拉迪乌姆是一种通常与土壤和植物残渣相关的丝状腐生真菌。(86)这两种微生物在测试条件下不被认为能够主动降解复杂的多糖。尽管已有报道指出不动杆菌属能够产生EPS，但这些聚合物的组成和产量与微藻产生的EPS不同。具体来说，溶血性不动杆菌产生的EPS主要由半乳糖组成，并且在纯有机培养基上的产量较低（0.1?0.8 g L?1）(87)。此外，不动杆菌和Kiliense沙罗克拉迪乌姆的代谢途径与C. vulgaris和Scenedesmus sp.特有的光合作用碳固定和EPS生物合成途径无关。(88)ATR-FTIR和GC-MS谱型在实验重复实验中的一致性进一步支持了这一结论，因为未检测到指示细菌或真菌多糖的光谱或组成特征。值得注意的是，Kiliense沙罗克拉迪乌姆和溶血性不动杆菌产生的EPS通常富含尿苷酸和脂多糖相关成分，而本研究观察到的EPS则富含中性糖。(89,90)总体而言，这些结果表明，非生物因素——尤其是光波长和底物组成——是C. vulgaris和Scenedesmus sp.代谢反应的主要驱动因素，而背景微生物群落保持代谢不活跃。生理学、生物化学和微生物学证据的整合为解释第3.2.1节和第3.2.2节描述的EPS生产模式提供了坚实的基础。

3.5 纯糖对Scenedesmus sp. EPS合成的影响
基于光照质量和底物成分对微藻生长、脂质积累和EPS生产的影响，我们进一步研究了在WL和RLBL条件下纯糖补充对Scenedesmus sp.生物量、脂质含量和EPS合成的影响。生物量积累受到光照条件的积极影响，在RLBL条件下细胞密度相对于WL有所增加（图5，表1）。在WL条件下，添加葡萄糖或果糖增强了生物量生产，证实了混合营养生长。相反，在RLBL条件下，相同的糖类降低了细胞密度，突显了光照条件和底物组成的交互作用。有机碳源的存在在混合营养条件下加速了指数生长阶段，相对于自养培养而言。

图5：在白光（WL）和红蓝光（RLBL）照射下，控制（CTRL）、葡萄糖（9 g L?1）和果糖（9 g L?1）条件下培养的Scenedesmus sp.的生物量（细胞密度）。

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表1：在白光（WL）和红蓝光（RLBL）条件下，培养7天批次培养期结束时测得的微生物生物量、细胞密度、干重量和生长速率。

WLRLBL
参数 CTRLGluFruCTRLGluFru
细胞密度（百万细胞/mL）2.08 ± 0.079.92 ± 0.207.88 ± 0.0016.83 ± 0.7810.40 ± 1.5512.24 ± 0.75
干重量（g L?1）0.10 ± 0.051.10 ± 0.520.40 ± 0.000.60 ± 0.091.00 ± 0.000.90 ± 0.14
生长速率（d?1）0.09 ± 0.030.30 ± 0.000.22 ± 0.150.40 ± 0.010.33 ± 0.030.36 ± 0.00

与西瓜废弃物的糖组成一致，高碳可用性结合氮限制和光照暴露促进了EPS的产生并增加了培养基的粘度。(14)纯糖补充也观察到了类似的响应，表明碳源和光照质量都是EPS合成的关键驱动因素。为了在培养基粘度增加的情况下准确量化生物量，进行了干重量测量。(1,14,91)在RLBL和糖补充条件下，即使细胞密度较低，干生物量也有所增加，这表明可能存在高价值的次级代谢物在细胞内的积累，这与先前的观察结果一致。(14)生物量响应具有菌株特异性。Rosenberg等人(92)报告了在10 g L?1葡萄糖培养条件下，C. sorokiniana、C. vulgaris和C. protothecoides之间的细胞密度和干生物量存在显著差异，并伴有脂质含量的变化。同样，S. acutus在超过5 g L?1的糖浓度下表现出生长抑制，而5 g L?1的补充则促进了生长。相比之下，两阶段培养策略——首先是自养阶段，然后是含有10?20 g L?1糖的混合营养阶段——导致了最大的生物量产量（2.44 × 107细胞/mL，3.04 g L?1，0.62 d?1）。这些发现强调了光照条件、碳源和菌株特异性代谢在决定生长和次级代谢物积累方面的相互作用。

3.5.1 脂质积累和组成
Scenedesmus sp.的总脂质积累受到光照质量和糖补充的影响。在WL条件下，所有条件下的总脂质含量相对稳定。相比之下，在RLBL照射下，添加果糖的培养中脂质积累显著增加（p < 0.01），表明光照条件和碳源对脂质代谢具有协同效应（图6和支持信息，表S3和S4）。Rattanapoltee和Kaewkannetra(93)报告了在两阶段培养过程中，用10 g L?1糖培养的S. acutus的脂质积累量约为40.9%。

图6：在控制（CTRL）、葡萄糖（9 g L?1）和果糖（9 g L?1）条件下，经过7天的光照后Scenedesmus sp.的脂质含量和组成。（a）总脂质储存；（b）饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）、多不饱和脂肪酸（PUFA）、欧米伽3和欧米伽6的百分比；（c）脂质组分表征。注意：“*”表示p < 0.01。

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脂质酸分析显示，糖的可用性以光依赖的方式改变了脂质组成。在WL条件下，添加葡萄糖或果糖增加了油酸含量，同时降低了棕榈酸水平（p < 0.01）。在RLBL条件下，棕榈酸和硬脂酸的相对比例降低，而油酸含量增加。这些趋势与先前的关于Scenedesmus和球藻的研究一致，其中光响应和碳调节的基因表达影响糖酵解通量、脂肪酸去饱和和脂质滴的形成。(94?96)总体而言，结果表明光照质量和外源碳供应共同调节了脂质积累和脂肪酸组成，反映了菌株对环境和营养条件的代谢调整。

3.5.2 EPS生产和组成
在添加葡萄糖或果糖的所有实验条件下都观察到了EPS的合成，证实了高糖可用性促进了胞外多糖的产生。与使用富含糖的废弃物的观察结果一致，(14)添加纯糖由于EPS的积累而增加了培养基的粘度（图7和支持信息，表S5）。EPS组成受到光照质量的影响。在WL条件下，EPS主要由葡萄糖、半乳糖、果糖和甘露糖组成，而在RLBL照射下，这些单糖的相对丰度降低，同时伴有过失糖含量的增加。

图7：在白光（WL）和红蓝光（RLBL）条件下，用葡萄糖（9 g L?1）和果糖（9 g L?1）培养的Scenedesmus sp.的EPS生产和化学表征。（a）总EPS产量；（b）EPS组成。*表示统计显著差异（p < 0.01）。

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这些发现强调，Scenedesmus的EPS生产既受菌株影响，也受条件影响，由碳源和光照条件的共同作用决定。结果与先前的研究一致，表明EPS合成对多种非生物因素（包括光照、盐度、温度、氮可用性和重金属）具有响应性。(97?104)总体而言，这些数据表明光照质量和底物组成是EPS产量和单糖组成的关键决定因素，突显了微藻在不同环境和营养条件下的代谢灵活性。

4. 结论
本研究评估了WLFW和光照照射对球藻和Scenedesmus sp.的综合影响，揭示了不同的菌株特异性响应。在RLBL条件下，球藻实现了更高的生物量（0.78 ± 0.42 g L?1），而脂质含量没有显著变化（17.01 ± 1.59%），而Scenedesmus在两种光照条件下都表现出增强的脂质积累（52.78 ± 3.93%），同时保持了相当的生物量。RLBL还促进了球藻中的油酸合成，并增加了Scenedesmus中的MUFA和PUFA水平。EPS生产受到WLFW和光照质量的强烈影响。球藻在WL和RLBL条件下的EPS产量相当（分别为2.32 ± 0.13 g L?1和2.76 ± 0.36 g L?1），而Scenedesmus在RLBL条件下几乎增加了一倍（5.03 ± 0.37 vs 2.70 ± 0.29 g L?1）。GC-MS分析进一步表明，RLBL改变了EPS的单糖组成，增加了葡萄糖含量相对于其他糖类的含量。在WL和RLBL下添加纯葡萄糖或果糖都增强了Scenedesmus的脂质积累和EPS合成，再现了WLFW观察到的效果。总的来说，这些研究结果表明将光驱藻类培养技术整合到农业废弃物增值利用中的可行性。特别是Scenedesmus sp.作为一种有望实现可持续EPS（磷酸钙）生产的候选藻种，在循环生物经济框架下展现出了巨大潜力。