利用工程化的糖苷水解酶对火疫病（Erwinia amylovora）进行酶促生物控制

《Environmental Science & Technology》：Enzymatic Biocontrol of Fire Blight (Erwinia amylovora) Using an Engineered Glycosyl Hydrolase

　　高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

目前对由Erwinia amylovora引起的火疫病的管理主要依赖链霉素，这种做法导致了耐抗生素菌株的出现，并引发了环境和监管方面的担忧。基于酶的生物控制剂提供了一种有前景的无抗生素方法，该方法结合了目标特异性和环境兼容性。本研究评估了CAase（一种来自噬菌体的糖苷水解酶）破坏E. amylovora生物膜并降低疾病严重程度的能力。生化测定和扫描电子显微镜证实，CAase能够有效降解细胞外多糖（EPS）基质，从而将细菌从生物膜中释放出来。通过对从两种Erwinia amylovora菌株中分离出的EPS进行气相色谱-质谱（GC-MS）连接分析发现，CAase优先切割由EA273菌株产生的富含半乳糖的amylovoran，而对EA1430菌株产生的富含左旋糖的EPS只有有限的活性。功能测定显示，在较高酶浓度下，CAase可将细菌活力降低近两个数量级，显著抑制其表面运动能力，并通过透射电子显微镜观察到超微结构损伤。重要的是，田间试验表明，在果园条件下，CAase显著降低了花和枝条的发病率。这些结果突显了CAase作为减少E. amylovora毒力的有效酶基策略，并展示了其作为火疫病管理中可持续抗生素替代品的潜力。

**引言**
火疫病是由革兰氏阴性细菌Erwinia amylovora引起的，是一种破坏性苹果（Malus domestica）和梨（Pyrus communis）等仁果类树木的疾病，威胁着全球果园的生产力和可持续性。(1) 该病最初于18世纪在北美被报道，此后传播到欧洲、中东和其他温带水果生产地区。(1) 疾情的爆发可以摧毁整个果园，导致产量减少和长期的经济影响。在美国，每年损失估计为1亿美元，而2007年在瑞士发生的疫情造成了约5600万美元的损失。(1,2) 目前的火疫病管理主要依赖抗生素，特别是链霉素，自20世纪50年代以来，链霉素就被用于北美果园中抑制开花期间的E. amylovora。(2,3) 尽管链霉素仍然是一种非常有效的治疗方法，但其常规使用加速了耐抗生素菌株的出现。(4,5) 耐链霉素的E. amylovora菌株最早在20世纪70年代被报道，现在在多个地区给控制工作带来了困难。(6) 除了病原体外，频繁使用抗生素还会导致附生微生物产生抗性，并引发更广泛的生态问题，包括对非目标生物的影响。(7?9) 监管限制日益增多，欧盟已禁止将抗生素用于农业，这凸显了对可持续替代方案的需求。(8)

随着抗生素耐药性和监管限制的增加，研究人员探索了无抗生素的解决方案，如拮抗细菌、噬菌体和重组产生的抗菌剂。(10,11) 其中，基于酶的生物控制剂特别有前景，因为它们具有底物特异性、可生物降解性和较低的耐药性发展风险。(5) 其中一种酶CAase是一种来自噬菌体的糖苷水解酶，可以降解微生物的胞外多糖。(12) CAase切割生物膜胞外聚合物物质（EPS）基质中的糖苷键，从而破坏细胞粘附和生物膜稳定性。(13) 多项研究表明，CAase对形成生物膜的病原体有效。Mayton等人(2021)报道，在无生物塑料表面上进行的微孔板实验中，CAase将大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的生物膜生物量减少了约30–40%，并且比对照组更有效地去除了成熟生物膜。(12) 此外，这项研究还表明CAase增加了大肠杆菌从菠菜叶片表面的脱落。Felton等人(2023)显示，CAase通过将病原体从食品和接触食品的表面释放出来，提高了单核细胞增生李斯特菌的检测能力。(14) 更近期，Renye等人(2025)将CAase与细菌素结合使用，消除了顽固的李斯特菌生物膜，表现出协同作用和细菌表面的结构破坏。(13) 这些研究表明CAase对多种病原体具有多样性，并表明CAase对生物膜基础设施的降解将提高伴随使用的抗菌剂的效果。

**材料与方法**
**细菌菌株**
本研究使用了Erwinia amylovora菌株EA273（ATCC 49946）、EA1430（CFBP 1430）和EA110。EA273于1971年在美国纽约的一棵患病苹果树上由Steven Beer（康奈尔大学实验室）分离得到，是一种高毒力、广泛用于火疫病研究的参考菌株。EA1430于1972年在法国山楂属（Crataegus spp.）中分离得到，是一种基因组已完全测序的欧洲参考菌株；比较分析显示EA1430和EA273之间的基因组同一性超过99.99%，尽管它们在质粒含量和调控特征上存在差异，但仍可作为互补的体外模型使用。(15) 对于田间试验，选择了Erwinia amylovora菌株EA110（乔治·桑丁，密歇根州立大学），因其高毒力、遗传稳定性以及在果园条件下的一致表现，能够再现疾病压力。(16) EA110是一种高amylovoran产生菌株，先前的比较研究表明EA110和EA273产生的amylovoran量相似，支持这两种菌株合成相同的毒性相关胞外多糖。(17)

**重组CAase的制作**
重组CAase是在大肠杆菌BL21(DE3)（新英格兰生物实验室）中生产的。

**CAase的制备**
CAase的制备遵循了之前描述的方法。(12) 简而言之，将假设的沙门氏菌噬菌体来源的水解酶的编码序列（NCBI序列ID：YP_004893855.1）优化为适合大肠杆菌的密码子使用，并在N端和C端进行截短以提高可溶性表达。该截短构建体与六组氨酸标签融合，然后克隆到pET-28a(+)载体中，受T7启动子的控制。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，转化子在含有103 μM卡那霉素（Research Products International）的溶菌肉汤（LB）-琼脂平板上选择。选取单个菌落接种到添加了卡那霉素（103 μM）的LB肉汤中，在37 °C下以230 rpm转速搅拌培养18小时。起始培养物稀释到新鲜的LB培养基（500 mL）中，直到600 nm处的光密度（OD600）达到0.6–0.8。此时，通过加入异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）至最终浓度1 mM，并将培养温度降至18 °C，以230 rpm转速培养20小时来诱导蛋白质表达。然后通过4 °C下3,000 × g离心10分钟收集细胞。

**纯化**
从1 L诱导培养物中得到的细胞沉淀物重新悬浮在40 mL裂解缓冲液中（100 mM Tris、500 mM NaCl、10%甘油、10 mM咪唑），并使用Qsonica超声波破碎器（15 W、20%振幅、40分钟、4 °C）进行破碎（20秒开/关循环）。裂解后，通过15,000 × g和4 °C离心10分钟去除不溶性物质，收集可溶性部分。使用Chelating Sepharose Fast Flow固定金属亲和层析树脂（Cytiva）进行Ni-NTA亲和纯化。首先用0.2 M氯化镍溶液、去离子水和10 mM咪唑依次处理重力柱。接下来，加入澄清的裂解液，先用12 mL 20 mM咪唑洗涤去除非目标蛋白，然后用10 mL 300 mM咪唑洗脱CAase。通过SDS-PAGE分析洗脱组分以评估纯度。

**样品准备**
为了进行SDS-PAGE，将洗脱组分与SDS上样缓冲液（62.5 mM Tris-HCl、25%甘油、2% SDS、0.01%溴酚蓝）混合，在90 °C下加热10分钟。蛋白质在4%堆积层和12%分离胶上使用Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳系统（由PowerPac Universal Power Supply供能）在110 V下电泳20分钟，然后在150 V下电泳50分钟。凝胶用Coomassie blue染色2小时，然后用乙醇/醋酸/水（100:75:825，v/v/v）溶液脱色。SDS凝胶在Amersham Imager 680（Cytiva）上成像以评估纯度。含有CAase的洗脱液使用10,000 MWCO膜（Thermo Fisher Scientific，SnakeSkin Dialysis Tubing）在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中透析24小时，然后通过灭菌的0.22 μm PVDF注射器过滤器（Sigma-Aldrich）过滤。随后使用Thermo Fisher Scientific的NanoDrop 1000分光光度计在280 nm处测量蛋白质浓度，计算消光系数为121,990 M–1cm–1。

**中试规模的CAase制备**
一个1000 L生物反应器（Eppendorf，BioFlo 720）中加入700 L LB（20 g/L；Research Products International），补充卡那霉素（85.8 μM；Research Products International，CAS 25389-94-0），然后接种7 L BL21(DE3)/pET-28a-CAase种子培养物（OD600 = 8.1）。培养物在37 °C下生长至OD600 = 0.818，冷却至18 °C，加入IPTG（1 mM；Sigma-Aldrich，CAS 367-93-1）培养15小时，然后冷却（<15 °C），并通过半连续离心收获细胞。冷冻后的细胞浆以1:4的比例重新悬浮（w>）

**胞外多糖的提取与纯化**
首先将Erwinia amylovora（EA1430和EA273）在120 mm蔗糖浓琼脂（SDA）平板上倒置培养48小时。通过轻轻刮取平板上的细胞，将其悬浮在2 mL 0.85%（w/v）NaCl中并涡旋20分钟。所得悬浮液在4 °C下以10,000 × g离心15分钟，小心收集上清液（含有胞外聚合物）。为了沉淀EPS，将上清液与乙醇按1:4的比例混合并在?20 °C下孵育1小时。沉淀物通过短暂离心（例如，10,000 × g离心10分钟）回收，并用100%乙醇（?20 °C）洗涤三次以去除杂质，然后风干以备后续步骤使用。干燥后的沉淀物重新悬浮在含有1 mM CaCl2、2 mM MgCl2和50 mM Tris（pH 7.5）的缓冲液中。通过加入250 μL 0.65 μM DNase I（New England Biolabs）和250 μL 2.9 μM RNase A（Thermo Fisher Scientific）进行酶处理，然后在37 °C下孵育2小时。(18) 接着加入250 μL 3.5 μM Proteinase K（Thermo Fisher Scientific）并在37 °C下孵育过夜。酶处理后，样品转移到10,000 MWCO透析管中，在4 °C下用超纯水透析24小时，每8小时更换一次水以去除盐和其他低分子量副产物。最后，将透析后的EPS溶液在?80 °C下冷冻并冻干（AAPPTec，Sharp Freeze Lyophilizer），得到干燥的纯化EPS，储存在22 °C下的干燥器中以备后续分析。

**MBTH活性测定**
使用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙（MBTH）（Sigma-Aldrich，CAS No. 149022-15-1）测定还原糖末端上的醛基。为此制备了两种溶液。溶液A含有30 mM MBTH和103 mM磺胺酸（Sigma-Aldrich，CAS No. 5329-14-6），溶解在去离子水中。溶液B含有38 mM硫酸铁(III)十二水合物（Sigma-Aldrich，CAS No. 7783-83-7）和103 mM磺胺酸，也溶解在去离子水中。进行测定时，向每个聚丙烯多孔96孔板的孔中加入50 μL含有CAase和底物的混合物。本研究测试了三种底物：两种纯化的E. amylovora EPS（EA1430、EA273）和果胶（Sigma-Aldrich，CAS No. 9000-69-5）。随后向每个孔中加入50 μL溶液A。盖紧平板，轻轻搅拌以确保充分混合，在22 °C下孵育1小时。之后向每个孔中加入50 μL溶液B，包括空白孔。平板在20 °C下再孵育30分钟，然后以1,000 × g离心5分钟，将所有样品转移到Corning 96孔透明聚苯乙烯微孔板中。使用BioTek Synergy Neo2板读数器（Agilent）在610 nm处测量吸光度。通过在对20 mM葡萄糖进行MBTH测定并从300 nm到700 nm进行光谱扫描，确认610 nm波长为最大吸光度。

**长期EPS降解实验**
对于长期降解实验，CAase和纯化的EPS在PBS（pH 7.4）中混合，置于1.5 mL微量离心管中并避光。反应混合物同时准备并储存在?20 °C以同步实验开始时间。在每个指定的时间点（每24小时），从储存中取出三个重复管，解冻后在23℃下进行孵育，并在实验室试管摇床（Roto-Shake Genie）上以低速度（3）轻轻连续搅拌以防止沉淀。同时处理仅含有EPS（无酶）和仅含有CAase（无底物）的对照反应，并将它们置于与EPS + CAase反应相同的冻融、孵育和搅拌条件下。经过200小时的反应时间后，使用上述MBTH测定法分析所有样品中的还原末端。对于经过CAase处理的样品，在进行GC-MS糖基连接分析之前，将纯化的EPS与CAase在相同的长期降解条件下孵育（200小时，PBS pH 7.4，23℃，轻轻摇动）。糖基连接分析是通过结合气相色谱-质谱（GC-MS）对部分甲基化的醛醇醋酸盐（PMAA）衍生物进行的，该方法采用了Willis等人（2013年）和Black等人（2021年）描述的改进版本。每个样品（500-1000 μg）溶解在大约300 μL的干燥1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐（Sigma-Aldrich，CAS编号143314-17-4）中，并在室温下搅拌过夜。通过加入300 μL醋酸酐（Sigma-Aldrich，CAS编号108-24-7）和50 μL N-甲基咪唑（Sigma-Aldrich，CAS编号616-47-7）开始乙酰化，然后继续搅拌10分钟。反应结束后用1 mL超纯水淬灭，并通过3.5 kDa MWCO透析管（Thermo Fisher Scientific，68035）在去离子水（DI）中进行透析。样品随后进行冻干，重新溶解在约300 μL二甲基亚砜（DMSO；Sigma-Aldrich，CAS编号67-68-5）中，并搅拌过夜。加入新制备的二甲酰基碱（约300 μL），然后向样品中逐滴加入碘甲烷（约400 μL；Sigma-Aldrich，CAS编号74-88-4），继续反应2小时。用水和二氯甲烷（Sigma-Aldrich，CAS编号75-09-2）提取后，收集有机相，干燥并冻干。通过向干燥的四氢呋喃（THF；Sigma-Aldrich，CAS编号109-99-9）中加入300 μL锂铝氘化物（LiAlD4；AstaTech Inc.，CAS编号14128-54-2）在69 mM浓度下进行还原反应，然后在80℃下孵育4-6小时。反应结束后用甲醇：醋酸（9:1，v/v）淬灭，干燥并通过3.5 kDa MWCO透析管在去离子水中透析。含有果糖的样品首先用0.5 M三氟乙酸（TFA；Sigma-Aldrich，CAS编号76-05-1）在100℃下水解1小时，然后用硼氢化钠（NaBD4；Sigma-Aldrich，CAS编号15681-89-7）在氢氧化铵（Sigma-Aldrich，CAS编号1336-21-6）中进行异构体还原。完全水解后使用2 M TFA在120℃下进行2小时，然后再进行第二次NaBD4还原和乙酰化。最终的PMAA衍生物在Agilent 7890A气相色谱仪上进行分析，该色谱仪连接了一个5975C质量选择性检测器，采用电子撞击离子化模式进行检测，分离是通过30 m Supelco SP-2331键合相熔融硅胶毛细管柱（Supelco）实现的。基于诊断性的电子撞击质谱碎片模式和气相色谱保留行为，使用已建立的PMAA参考库和保留顺序规则分配糖基残基和连接位点，包括乔治亚大学复杂碳水化合物研究中心（CCRC）的PMAA光谱数据库。扫描电子显微镜（SEM）EA273菌株在10 mL King’s B（KB）培养基中以28℃和250 rpm培养18小时。这段生长期后，将菌株稀释至OD600为0.8，然后用13.0 μM的CAase处理24小时或不进行处理。十二毫米圆直径（编号2）盖玻片（Avantor，VWR?）预先用多聚-d-赖氨酸（Thermo Fisher Scientific，CAS编号27964-99-4）处理，方法是将盖玻片在1 mL多聚-d-赖氨酸溶液中室温孵育1小时，去除多余溶液，并用去离子水冲洗表面三次。然后将盖玻片在生物安全柜中空气中干燥。预处理后，将每种样品（未经处理或经CAase处理24小时）的10 μL滴加到干燥的SEM盖玻片上并完全空气干燥（1小时）。接下来，向每个盖玻片施加100 μL 2.5%戊二醛（Biolyst Scientific，CAS编号111-30-8）溶液，并在室温下干燥5小时以固定细胞。盖玻片浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中并在4℃下保存，以便后续成像。SEM成像按照先前描述的协议进行，所有图像均在Quanta 200 FEG扫描电子显微镜（Field Electron and Ion Company）上获取。在经过200公顷处理后，EA273样本中检测到的糖基残留物的相对百分比（有无CAase处理）

| 样本 | 未经处理 | CAase处理 |
|---------------|-------------|--------------|
| 3-半乳吡喃糖残留物（3-Gal） | 25.2% | 15.6% |
| 4-葡吡喃糖残留物（4-Glc） | 9.5% | 26.5% |
| 其他残留物 | 65.4% | 8.1% |
| 总计 | 100.0% | 100.0% |

a. 来自EA273 ± CAase样本的PMAAs色谱图用于 linkage分析，见补充图S1和S2。所有检测到的糖基残留物的完整列表见补充表S1。

表2. 在经过200公顷处理后，EA1430样本中检测到的糖基残留物的相对百分比（有无CAase处理）

| 样本 | 未经处理 | CAase处理 |
|---------------|-------------|--------------|
| 2,1-果糖 + 2,6-果糖 | 54.3% | 1.7% |
| 1,2,6-果糖 | 19.9% | 18.6% |
| t-果糖 | 15.9% | 15.0% |
| 其他残留物 | 10.0% | 14.8% |
| 总计 | 100.0% | 100.0% |

a. 来自EA1430 ± CAase样本的PMAAs色谱图用于 linkage分析，见补充图S3和S4。数值是根据GC–MS峰面积的相对百分比标准化的，用于比较结构解释（半定量）。所有检测到的糖基残留物的完整列表见补充表S2。

EA1430和EA273 EPS之间的反应动力学差异可能反映了结构变化，如分支模式或糖苷连接类型，这些变化影响了酶的亲和力和切割速率。(25,26) 这些结构特征在linkage分析中进一步得到了研究。糖苷连接分析揭示了CAase对底物的特异性切割模式。

为了确定CAase对E. amylovora EPS活性的结构基础，使用GC–MS分析了EA273和EA1430菌株在酶处理前后的糖苷连接情况，这提供了关于连接组成的半定量、主要是定性的信息。(27?30) EA273的EPS富含半乳吡喃糖残留物，特别是3-连接的Gal（25.2%）、3,4-Gal（8.8%）和末端Gal（6.3%），这与E. amylovora的关键毒力相关EPS的结构一致。(31) 相比之下，EA1430的EPS主要由2,1-和2,6-连接的果呋喃糖残留物主导（54.3%），这是β-2,6-连接果聚糖类型的特征，含有β-2,1分支。(25) 这些组成模式与先前的报告一致，表明EA273是高产amylovoran的菌株，而EA1430合成的amylovoran较少，反而积累了levan类型的聚合物。(31) EPS结构的这种差异可能解释了在MBTH测定中观察到的不同酶反应（图1），并表明CAase在每种菌株中切割不同的糖苷连接。

经过CAase处理后，EA273的EPS中3-Gal残留物显著减少（从25.2%降至15.6%），这与amylovoran主链的酶切一致。同时，4-Glc的相对丰度从9.5%增加到26.5%，这可能反映了中间分解产物或次级糖苷连接的暴露增加。这与先前的研究发现一致，即连接分析反映了相对丰度，一种组分的减少可能导致由于甲基化分析过程中的归一化效应而其他组分的表观增加。(32) 在EA1430的EPS中，主要的levan相关果呋喃糖连接（2,1-Fructose + 2,6-Fructose）在CAase处理后略有减少（表2），而末端和分支的果糖连接变化较小。这些微小差异可能反映了酶的作用有限；然而，GC–MS甲基化/PMAA连接分析主要是定性和半定量的，因为相对峰面积是标准化的，并且受到衍生化和水解效率的影响。(30) 对于噬菌体尾相关解聚酶，如Erwinia噬菌体L1酶DpoL1也有类似的描述，它特异性切割amylovoran并使噬菌体能够感染被包封的E. amylovora细胞。(33) 虽然DpoL1显示出明显的底物特异性，并与噬菌体感染协同作用，但CAase是重组生产的，作为独立酶具有活性。

尽管来自同一地区的E. amylovora菌株通常被报告为高度基因同质，但基因相似性并不一定意味着生理特性（如EPS组成、荚膜特性或amylovoran与levan的相对产量）的均匀性。(34) 实际上，先前的研究表明amylovoran的产生依赖于菌株，并且与毒力相关，而且不同分离株之间的amylovoran结构存在差异，这支持了即使在密切相关的E. amylovora菌株群体中也存在EPS异质性的预期。(35) 因此，这里观察到的菌株依赖性活性（图1；表1–2）与一个模型一致，即CAase的效率可能取决于EPS结构和连接组成，并表明应该预期不同野外菌株之间的反应存在差异。

未来的工作将把EPS结构特征与不同E. amylovora分离株的CAase敏感性联系起来，设计或组合具有互补底物特异性的解聚酶，并开发出在异质病原体群体中保持效力的配方和应用策略。(36)

扫描电子显微镜成像显示，CAase处理导致E. amylovora菌株EA273生物膜中的胞外多糖（EPS）基质广泛降解。未经处理的培养物（图2A和C）形成了密集的黏液状EPS网络，包裹着单个细菌，并在细胞之间形成长的纤维状桥梁。在更高的放大倍率下，这个网络看起来像一层厚厚的鞘状层，包裹着细菌表面。相比之下，经过CAase处理的样本（图2B和D）显示出胞外基质的显著损失。细菌杆状体清晰可见，几乎没有表面碎片，表明EPS/生物膜结构几乎完全降解。值得注意的是，经过CAase处理的细胞的整体表面形态比未经处理的对照组更光滑，纹理更少。

图2. 扫描电子显微照片展示了CAase对Erwinia amylovora EA273生物膜EPS基质的影响。左侧面板（A和C）显示了在KB培养基中孵育24小时的细胞（无酶）。右侧面板（B和D）显示了暴露于13.0 μM CAase的平行培养物。比例尺：2 μm（10,000 ×）和5 μm（25,000 ×）。

高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

这些观察结果与CAase对EPS的降解一致。虽然SEM不能直接测量催化作用，但基质的丢失与还原端和连接数据一致。处理后胞外涂层的消失支持了MBTH测定的生化证据，并表明CAase可以物理上拆解生物膜结构，使细胞从基质中释放出来。处理后细胞的更光滑外观进一步表明CAase也可能修改了荚膜或外膜相关的多糖，除了胞外物质之外。(37,38) 虽然SEM图像不能最终确定膜的损伤，但表面形态的改变表明可能会对膜的完整性产生潜在的下游影响，这可以通过膜通透性测定或透射电子显微镜来检查。

为了量化CAase对E. amylovora存活率的影响，在不同酶浓度下对EA273细胞进行了计数。在用一系列CAase浓度孵育18小时后，对EA273菌株进行了菌落形成单位（CFU）测定。酶在磷酸盐缓冲盐水中测试，浓度范围为0–20 μM，通过系列稀释和点接种在KB琼脂上量化了活细胞数量。结果显示了剂量-反应关系，即随着酶浓度的增加，活细胞数量减少（图3）。

图3. CAase浓度与Erwinia amylovora EA273存活率之间的剂量-反应关系。左图：CAase的细粒度滴定（0.1–10 μM）。右图：扩展的浓度范围（0–20 μM）。线条代表对数据的指数衰减拟合。点代表平均值±标准差（n = 3）。PBS处理的样本作为对照。

高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

在CAase浓度低于0.1 μM时，存活率保持不变，但在接近1.3 μM时出现了明显下降，相当于CFU/mL减少了大约1个数量级。在20 μM时，CAase将活菌数量减少了大约2个数量级。数据很好地符合指数衰减模型，与浓度依赖的抑制效应一致。最低有效浓度（MEC）约为1.3 μM，为未来的配方和应用策略提供了有用的基准。这里观察到的抑菌效果可能是间接的；CAase可能不是通过裂解细胞来实现的，而是通过改变营养梯度、干扰群体感应或通过消除生物膜保护层来增加对干燥和氧化应激的敏感性。(39)

这些结果表明，CAase以浓度依赖的方式影响E. amylovora的存活率。与这一解释一致的是，定义热挑战后的生长曲线分析表明，CAase预处理增加了对热胁迫的敏感性。如补充图S7和S8所示，经过CAase处理的EA273和EA1430菌株在热胁迫后表现出显著更大的生长抑制，而PBS处理的对照组在加热和未加热条件之间几乎没有差异。这些数据共同表明，CAase去除EPS基质削弱了E. amylovora对抗环境压力的能力。虽然CAase不是一种传统的杀菌剂，但破坏保护性的EPS基质可能会使细胞对外部压力更敏感，并干扰依赖生物膜的生存机制，这与先前的研究结果一致，即酶促降解EPS增加了细菌对抗菌剂的敏感性或通过消除缓冲压力的结构微环境降低了代谢韧性。(39,40)

为了确定CAase是否影响E. amylovora的表面运动能力，使用野生型EA273进行了软琼脂运动性测定。细胞被点接种到含有逐渐增加的CAase浓度（0.13–13.0 μM）的0.2%琼脂平板中，然后在孵育后测量细菌扩散的面积（图4）。

图4. CAase抑制E. amylovora EA273在软琼脂中的表面运动能力。左图：野生型EA273被点接种到含有逐渐增加的CAase浓度（0.13–13.0 μM）的0.2%琼脂平板中。右图：在中心点接种的EA273的代表性软琼脂运动性平板。

高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

随着CAase浓度的增加，表面运动能力明显下降。在0.13 μM时，Erwinia amylovora EA273形成了扩展的外向扩散晕圈，这是活跃表面运动的特征；而逐渐增加的CAase浓度产生了较小的扩散区域，在≥1.3 μM时运动能力受到强烈抑制。在对数轴上分析时，CAase浓度与运动能力之间的关系呈现幂律趋势，表明表面扩散与酶剂量之间存在强烈的反比依赖性（扩散面积（mm2）= 74.3 × [CAase]?0.458；R2 = 0.9927；图4）。对数-对数回归的残差呈正态分布（Shapiro–Wilk检验，p = 0.53），支持了该模型的适用性。

这些结果表明，CAase显著抑制了E. amylovora的表面运动能力，这一表型与植物的毒力和定植能力密切相关。(41) 运动能力的抑制可能源于酶促降解了对半固体表面上的IV型菌毛或鞭毛运动所需的胞外多糖。(37) 或者，CAase可能通过降解生物膜基质改变了局部微环境，从而减少了水合作用或修改了表面张力，从而阻碍了协调迁移。(42) 降低的运动能力先前已被证明与E. amylovora和其他革兰氏阴性病原体的降低毒力相关。(41,43) 因此，CAase抑制细菌扩散的能力不仅可能有助于减少生物膜的形成，还可能减弱感染性，加强了其作为多目标生物控制剂的潜力。

透射电子显微镜成像显示，CAase处理破坏了E. amylovora生物膜中的EPS基质。扫描电子显微镜显示，CAase处理导致E. amylovora菌株EA273生物膜中的胞外多糖（EPS）基质广泛降解。未经处理的培养物（图2A和C）形成了密集的黏液状EPS网络，包裹着单个细菌并在细胞之间形成长的纤维状桥梁。在更高放大倍率下，这个网络看起来像一层厚的鞘状层，包裹着细菌表面。相比之下，经过CAase处理的样本（图2B和D）显示出胞外基质的显著损失。细菌杆状体清晰可见，表面碎片很少，表明EPS/生物膜结构几乎完全降解。值得注意的是，经过CAase处理的细胞的整体表面形态比未经处理的对照组更光滑，纹理更少。

图2. 扫描电子显微照片展示了CAase对Erwinia amylovora EA273生物膜EPS基质的影响。左侧面板（A和C）显示了在无酶的KB培养基中孵育24小时的细胞。右侧面板（B和D）显示了暴露于13.0 μM CAase的平行培养物。比例尺：2 μm（10,000 ×）和5 μm（25,000 ×）。

高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

这些观察结果与CAase对EPS的降解一致。虽然SEM不能直接测量催化作用，但基质的丢失与还原端和连接数据相符。处理后胞外涂层的消失支持了MBTH测定的生化证据，并表明CAase可以物理上拆解生物膜结构，使细胞从基质中释放出来。处理后细胞的更光滑外观进一步表明CAase也可能修改了荚膜或外膜相关的多糖。

尽管SEM图像不能最终确定膜的损伤，但表面形态的改变表明可能会对膜完整性产生潜在的下游影响，这可以通过膜通透性测定或透射电子显微镜来检查。

为了量化CAase对E. amylovora存活率的影响，在不同酶浓度下对EA273细胞进行了计数。在用一系列逐渐增加的酶浓度孵育18小时后，对EA273菌株进行了菌落形成单位（CFU）测定。酶在磷酸盐缓冲盐水中测试，浓度范围为0–20 μM，通过系列稀释和点接种在KB琼脂上量化了活细胞数量。结果显示了剂量-反应关系，即随着酶浓度的增加，活细胞数量减少（图3）。

图3. CAase浓度与Erwinia amylovora EA273存活率之间的剂量-反应关系。左图：CAase的细粒度滴定（0.1–10 μM）。右图：扩展的浓度范围（0–20 μM）。线条代表对数据的指数衰减拟合。点代表平均值±标准差（n = 3）。PBS处理的样本作为对照。

高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

在CAase浓度低于0.1 μM时，存活率保持不变，但在接近1.3 μM时出现了明显下降，相当于CFU/mL减少了大约1个数量级。在20 μM时，CAase将活菌数量减少了大约2个数量级。数据很好地符合指数衰减模型，与浓度依赖的抑制效应一致。最低有效浓度（MEC）约为1.3 μM，为未来的配方和应用策略提供了有用的基准。这里观察到的抑菌效果可能是间接的；CAase可能不是通过裂解细胞来实现的，而是通过改变营养梯度、干扰群体感应或通过消除生物膜保护层来增加对干燥和氧化应激的敏感性。(39)

这些结果表明，CAase以浓度依赖的方式影响E. amylovora的存活率。与这一解释一致的是，在定义的热挑战后的生长曲线分析表明，CAase预处理增加了对热胁迫的敏感性。如补充图S7和S8所示，经过CAase处理的EA273和EA1430菌株在热胁迫后表现出显著更大的生长抑制，而PBS处理的对照组在加热和未加热条件之间几乎没有差异。这些数据共同表明，CAase去除EPS基质削弱了E. amylovora耐受环境压力的能力。虽然CAase不是一种传统的杀菌剂，但破坏保护性的EPS基质可能会使细胞对外部压力更敏感，并干扰依赖生物膜的生存机制，这与先前的研究一致，即酶促降解EPS增加了细菌对抗菌剂的敏感性或通过消除缓冲压力的结构微环境降低了代谢韧性。(39,40)

为了确定CAase是否影响E. amylovora的表面运动能力，使用野生型EA273进行了软琼脂运动性测定。细胞被点接种到含有逐渐增加的CAase浓度（0.13–13.0 μM）的0.2%琼脂平板中，然后在孵育后测量细菌扩散的面积（图4）。

图4. CAase抑制E. amylovora EA273在软琼脂中的表面运动能力。左图：野生型EA273被点接种到含有逐渐增加的CAase浓度（0.13–13.0 μM）的0.2%琼脂平板中。右图：在中心点接种的EA273的代表性软琼脂运动性平板。

高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

随着CAase浓度的增加，表面运动能力明显下降。在0.13 μM时，Erwinia amylovora EA273形成了扩展的、向外扩散的晕圈，这是活跃表面运动的特征；而逐渐增加的CAase浓度产生了较小的扩散区域，在≥1.3 μM时运动能力受到强烈抑制。在对数轴上分析时，CAase浓度与运动能力之间的关系呈现幂律趋势，表明表面扩散与酶剂量之间存在强烈的反比依赖性（扩散面积（mm2）= 虽然CAase的主要目标是细胞外的EPS（荚膜多糖），但其作用可能扩展到对维持囊膜稳定性至关重要的表面结合多糖。另一方面，去除这种保护性基质可能会使细胞在生长和样品制备过程中更容易受到渗透压应力、干燥或机械损伤的影响。这些结果与先前的报告一致，这些报告表明，生物膜的酶解会导致细胞膜的二次损伤，尤其是在长时间暴露的情况下。（13）这些发现进一步支持了CAase通过结构和抗菌机制共同起作用的假设；它不仅分散了生物膜，还削弱了病原细胞的物理完整性。

在田间试验中，CAase降低了花枯病和梢枯病的发生率
花枯病和梢枯病是苹果园中火疫病最具破坏性的两个阶段。当E. amylovora在开花期间定植于花朵上时，就会发生花枯病，导致花朵坏死，并为病原体提供初次感染点。（44）从这些早期感染开始，细菌通常会进一步扩散到嫩枝上，引起梢枯病，表现为典型的顶端萎蔫和枯死，这会严重影响树木的生长、产量以及果园的长期生存能力。由于花部感染是主要入侵点，而梢枯病反映了病原体的系统扩散和疾病严重程度，因此这两个指标对于评估田间管理策略的有效性至关重要。（45）

在第一年，使用低浓度的CAase（1.82 × 10–3 μM），单次施用（1×）和两次施用（2×）分别提供了40%和25%的花枯病控制效果（图6）。某些处理之间缺乏统计学上的差异，这反映了果园试验中的树木间变异性，而不是所有处理平均效果的完全相同。在第二年，使用较高浓度的CAase（13.0 μM），单次施用（1×）和两次施用（2×）分别提供了54%和66%的花枯病控制效果（图7）。梢枯病的控制效果始终更高，在两年中所有CAase处理组中均为55–75%（图6和图7）。

图6
图6. 低浓度（1.82 × 10–3 μM）下的CAase减少了田间试验中的花枯病和梢枯病发生率。与未处理的对照组相比，用CAase（1.82 × 10–3 μM）处理的“Fuji”苹果树表现出显著的花枯病和梢枯病减少。CAase的效果与标准抗生素处理（FireWall + FireLine + Regulaid）和生物处理（Blossom Protect + Buffer Protect）进行了比较。该试验于2023年在美国弗吉尼亚州温彻斯特进行。每个条形图上显示的百分比控制值是相对于未处理对照组的（公式2）。条形图代表四个单树重复实验的平均值；误差条表示平均值的标准误差。相同字母的条形图之间没有显著差异；不同字母的条形图之间存在显著差异（单因素方差分析，随后使用Tukey’s HSD，α = 0.05）。大写字母表示花枯病的统计分组，小写字母表示梢枯病的统计分组。

高分辨率图片
下载MS PowerPoint幻灯片

图7
图7. 更高浓度的CAase（13.0 μM）增强了花枯病和梢枯病的控制效果。使用较高浓度（13.0 μM）的CAase进行的田间试验。CAase处理与标准抗生素处理（FireWall + FireLine + Regulaid）和生物控制处理（Blossom Protect + Buffer Protect）进行了对比。该试验于2024年在美国弗吉尼亚州温彻斯特进行。每个条形图上显示的百分比控制值是相对于未处理对照组的（公式2）。条形图代表四个单树重复实验的平均值；误差条表示平均值的标准误差。相同字母的条形图之间没有显著差异；不同字母的条形图之间存在显著差异（单因素方差分析，随后使用Tukey’s HSD，α = 0.05）。大写字母表示花枯病的统计分组，小写字母表示梢枯病的统计分组。

高分辨率图片
下载MS PowerPoint幻灯片

相对于花枯病，梢枯病更强的抑制效果与火疫病的流行病学进展一致。花枯病是主要的感染阶段，在此期间，E. amylovora在花柱上建立并繁殖，然后侵入花蜜腺和内部组织。被感染的花朵随后成为二次接种体的主要来源，这些接种体通过雨水和昆虫传播，引发梢枯病。（44,45）因此，即使花枯病控制不完全，部分抑制花部感染也可以创建一个种群瓶颈，从而限制后续的嫩枝定植。这种模式在火疫病管理中得到了充分记录，其中在针对花期的干预措施后，梢枯病的发生率通常低于花枯病发生率，包括基于链霉素的方案，这些方案通常能够实现较高但不完全的控制。（2,44）此外，由于梢枝具有更大的表面积和更复杂的结构，因此可以更好地保留施用的物质，相对于娇嫩的花部组织而言。一旦梢枯病发生，其发展很大程度上依赖于由amylovoran介导的生物膜形成和导管系统定植，这些过程预计会通过CAase对EPS的酶解受到抑制。（46）这些流行病学和生物学因素为观察到的花期CAase处理后梢枯病更强的抑制效果提供了机制基础。

CAase对果实锈病没有显著影响，这种病害以前与基于Aureobasidium pullulans的生物处理相关。（47）与此一致的是，在两年中，CAase处理的果实与标准抗生素处理在锈病方面没有显著差异（补充图S5和S6）。

第二年较高浓度CAase处理下观察到的更强疾病抑制效果表明，剂量优化可能部分弥补了其对结构不同的EPS底物的酶效率降低的问题。同样，开花期间重复施用可能有助于在病原体快速扩散期间保持有效的酶覆盖。此外，CAase作为破坏生物膜的辅助剂使用可能会比作为通用独立杀菌剂更有效，特别是在与标准抗生素、生物控制剂或针对其他EPS结构的互补酶联合使用时。这种综合策略可能会提高对异质性病原体群体的效果，并代表了一种将酶解EPS降解转化为强大果园规模疾病管理的实际途径。

公式和方程
???????????1=????????????????????????????????×10??
CFUmL?1=平均菌落计数v×10
d
（1）
其中，平均菌落计数是指在平板上计数的平均菌落数量；v是用于计数的平板体积（例如，5 μL滴液体积为v = 0.005 mL）；d是平板样品的10进制稀释指数的绝对值（例如，对于10–5的平板，d = 5）。因子10d用于校正稀释效应，因此最终单位为每毫升的菌落形成单位（CFU mL–1）。

????????????????????????????[%]=||||???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????1||||×100
百分比控制[%]=?|处理后的病害发生率?未处理的病害发生率|×100
（2）
其中，处理后的病害发生率是指经过某种处理后表现出火疫病症状的花朵或嫩枝的比例，未处理的病害发生率是指未处理对照树中观察到的相应比例。百分比控制表示归因于处理的疾病发生率的相对减少，并使用相同的公式分别独立计算了花枯病和梢枯病的百分比控制。乘以100将数值转换为相对于未处理对照组的百分比控制。