基于建筑编码的降解动力学机制：通过聚合物囊泡的形状和大小来调控降解途径

《Journal of the American Chemical Society》：Architecture-Encoded Degradation Kinetics and Pathways through the Shape and Size of Polymeric Vesicles

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编程超分子纳米结构的降解对其功能、清除和适应性至关重要，但目前的主要方法主要依赖于复杂的化学设计。内在的物理参数如何决定其可降解性仍然很大程度上未得到探索，这限制了通用的设计策略。在这里，我们发现聚合物囊泡的架构（由形状和大小决定）编码了降解动力学和解体路径。我们证明较小的尺寸会加速降解动力学。值得注意的是，解体路径取决于自组装体的形状：球形的聚合物囊泡会整体崩解，而口腔细胞则经历一个双层分辨的逐步降解过程，同时保持内膜的完整性。这些结果确立了架构作为可编程生物降解性的主要设计原则，揭示了内在物理特性如何控制结构韧性。通过将形状和大小与降解动力学和解体路径联系起来，我们的工作为设计具有时空可调寿命的纳米结构提供了一个通用框架，为药物输送和人工通信开辟了新的途径。

引言
嵌段共聚物两亲分子的超分子自组装允许离散分子自发组织成有序的架构，为先进的纳米材料提供了多功能平台。(1?3) 这些组装体的一个显著特性是可降解性，这是其生物相容性和安全清除的基础，其应用范围从环境化学到生物医学设备。(4,5) 传统的策略通过在聚合物主链或侧链中引入可切割基团（如酯、二硫键或亚胺）来实现可降解性，从而使组装体对pH值、氧化还原条件、酶或光等刺激作出响应。(6,7) 通过化学策略（包括聚合物组成、(8,9) 分子量、(10) 亲水性、(11) 结晶度、(12) 交联程度、(13) 或外部触发因素)(14) 可进一步调节降解动力学。然而，像组装体的大小和形状这样的简单物理参数尚未被证明可以直接调节软质超分子自组装体的降解。

我们的团队长期以来一直在研究具有明确尺寸的组装体(15?17)，这是生物医学应用的关键决定因素(16)，以及可编程形状(18?22)，这些可以用于实现诸如纳米马达活性等新兴功能(15,19)。尽管已知形状和大小会影响与生物系统的相互作用，包括细胞摄取、屏障穿越和生物分布(23?32)，但它们在调节软质超分子组装体降解中的作用仍不清楚。揭示这些物理参数与降解动力学或路径之间的关系可以提供强大的策略来调节寿命和功能。这一概念与生物调控相似，在生物调控中，曲率、区室化和膜张力等物理线索协调细胞成分的局部和动态回收。(33,34)

在这里，我们设计了一种聚(乙二醇)-b-聚(D,L-乳酸) (PEG-b-PLA) 囊泡的模型系统，其形状和大小可以正交控制：大型和小型聚合物囊泡（LPsome和SPsome）以及大型和小型口腔细胞（LSto和SSto）（图1a）。选择PEG-b-PLA是因为它具有内在的可降解性、FDA批准以及良好的酶促切割特性，从而无需额外的化学基团。由于基于PLA的组装体（胶束、纳米颗粒或聚合物囊泡）通常需要几周到几个月的时间才能降解(35,36)，我们使用了蛋白酶K（一种对PLA具有高底物亲和力的广谱丝氨酸蛋白酶)(37)来加速降解并研究形状和大小依赖的效应。我们系统地探讨了囊泡架构与从分子键断裂到纳米尺度解体的多个尺度上的降解行为之间的关系（图1b,c）。我们发现较小的囊泡由于膜曲率较高而降解得更快，这降低了聚合物的堆积并增强了酶的 accessibility。相比之下，囊泡的形状决定了解体路径：球形的聚合物囊泡会迅速崩解，而口腔细胞则经历一个双层分辨的逐步降解过程，同时保持内膜的完整性并增强了结构韧性。这些结果确立了囊泡架构（形状和大小）作为自组装系统中降解动力学和路径的关键调节因素。

图1
图1. 可编程聚合物囊泡的降解。(a) PEG-b-PLA 囊泡的示意图，其形状和大小可以正交控制（LPsome, SPsome, LSto, 和 SSto），突出了自组装、微型化和形状转换的顺序过程。(b) PEG-b-PLA 囊泡的降解机制示意图，显示了蛋白酶K在分子水平上的切割，随后是纳米尺度的形态解体和聚集体的形成。(c) 可编程囊泡降解的概念框架，强调了形状和大小如何决定降解动力学和解体路径。

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结果与讨论
对聚合物囊泡形状和大小的正交控制
为了研究囊泡架构对降解的影响，我们首先建立了一种制造策略，可以独立控制形状（球形聚合物囊泡与口腔细胞）和大小（约200纳米 vs 约400纳米）(图2a)。选择口腔细胞是因为它们独特的内部腔体能够容纳纳米级催化剂、纳米颗粒或治疗性负载物。(15,38) 选择了两种具有不同嵌段长度的两亲嵌段共聚物PEG22-b-PLA90和PEG44-b-PLA94，因为它们具有明确的亲水-疏水比率(图S1)，这使得可以从球形聚合物囊泡可控地转变为口腔细胞(19,39)。LPsome通过溶剂转换方法制备(19,40)，并通过冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)确认了囊泡的存在(图2b)。动态光散射(DLS)测量显示其水动力直径(Dh)为461 ± 1纳米，多分散指数(PDI)为0.09 ± 0.06（图2b中的插图）。随后通过膜挤出实现了大小的控制(16,17,41)，产生了Dh为186 ± 5纳米且PDI为0.05 ± 0.01的SPsome，保持了狭窄的分散度(图2c)。

图2
图2. PEG-b-PLA囊泡的形状和大小的正交控制。(a) 顺序制造路线示意图：首先通过溶剂转换自组装形成大型聚合物囊泡，然后通过(i)直接透析得到LPsome，(ii)膜挤出和透析得到SPsome，(iii)膜挤出结合渗透/热调节得到SSto，或(iv)直接渗透/热调节而不进行挤出得到LSto。b,c, LPsome (b) 和 SPsome (c)的cryo-TEM图像，插图显示了水动力直径(Dh)和多分散指数(PDI)（平均值 ± 标准偏差(s.d.)，n = 3）。刻度尺为200纳米。(d,e) 在23°C (d) 和 4°C (e) 下，SSto形成的形态演变随PEG浓度的变化。刻度尺为200纳米。(f,g) 在23°C (f) 和 4°C (g) 下，SSto populations随PEG浓度的变化（n > 70个颗粒/条件）。虚线作为视觉辅助线。h,i, SSto (h) 和 LSto (i)的cryo-TEM图像，插图显示了Dh和PDI（平均值 ± 标准偏差，n = 3）。刻度尺为200纳米。

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为了诱导囊泡向口腔细胞的转化，我们使用了氯化钠(NaCl)透析，这种方法会产生渗透梯度，推动腔内物质塌陷和膜内陷。这种方法有效地将LPsome转化为LSto(19,39)。然而，对于小于200纳米的囊泡，即使在高至300 mM的NaCl浓度下，转化效率也很低，只有约20%的SSto产生(图S2)。我们认为这种有限的形状转化效率是由于渗透驱动力的不足以及小囊泡固有的膜刚性和曲率约束。(16,42) 为了解决NaCl透析的不良形状转化效率问题，我们将之前为PEG-b-聚苯乙烯囊泡开发的PEG诱导渗透冲击方法(16,43)应用于PEG-b-PLA系统。与盐透析中的渐进式渗透平衡不同，PEG的突然添加会产生陡峭的渗透梯度，迅速驱动膜内陷。在室温（约23°C）下，添加1.25–10 mM的PEG使SSto的比例从11.5 ± 1.5%增加到55.4 ± 1.8%(图2d,f和S3)，明显优于NaCl透析。然而，产率仍低于PEG-b-聚苯乙烯系统报道的产率（>90%），这可能是由于PEG-b-PLA膜的玻璃化转变温度(Tg)较低和灵活性较高。(44,45) 为了解决这个问题，我们将形状转化温度降低到4°C，增加了膜的刚性，在5 mM PEG下产率提高到70.5 ± 7.4%，在10 mM PEG下提高到92.3 ± 2.0%(图2e,g)，生成的SSto具有Dh = 169 ± 3纳米和PDI = 0.05 ± 0.03(图2h)。

为了确保方法的一致性并直接比较尺寸依赖的降解和解体行为，我们使用相同的PEG添加方法制备了LSto。将此协议应用于LPsome后发现，较低的PEG浓度就足以诱导LSto的形成，这反映了由于曲率较小导致的膜刚性较低。产率从0.625 mM PEG下的12.7 ± 2.1%增加到2.5 mM PEG下的91.9 ± 3.9%(图S4)，生成的LSto具有Dh = 428 ± 1纳米和PDI = 0.06 ± 0.03(图2i)。总体而言，这种优化的制造策略使得在PEG-b-PLA系统中能够独立控制囊泡的形状和大小。

聚合物囊泡的形状和大小依赖的降解动力学
PLA内在的疏水性和低水渗透性导致其水解降解非常缓慢。(35,36) 为了在生物学相关条件下加速降解，我们使用了蛋白酶K，这是一种丝氨酸蛋白酶，其催化机制类似于铜绿假单胞菌等病原菌分泌的蛋白酶。(46,47) 这种方法实现了快速且可控的PLA切割，为研究酶促降解路径提供了一个稳健的模型系统。为了在分子水平上监测降解，我们利用定量质子核磁共振(1H-qNMR)光谱实时跟踪37°C下的降解产物的变化（图3a–e，详见支持信息）。聚合物（在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，pH 7.4）和酶（在Tris–HCl中，pH 7.4）的浓度保持恒定，以确保不同类型囊泡之间的可靠比较。无酶的对照实验确认了囊泡在21小时内的稳定性（图S5–S8）。相比之下，经酶处理的囊泡显示出了随时间变化的共振峰，对应于单体乳酸(LA，δ 1.21–1.16 ppm)、寡聚乳酸(OLA，δ 1.34–1.27 ppm)和残留的聚合物乳酸(PLA，δ 1.48–1.40 ppm)（图3a和S9–S12），这通过纵向T1和横向T2松弛分析得到了验证（图S13）。定量跟踪显示了所有类型囊泡中从PLA到OLA再到LA的顺序切割机制（图3b–d）。PLA组分在最早的时间点达到峰值，随后随时间减少，产生了OLA中间体，之后OLA逐渐减少，而LA持续积累。在降解结束时，LA是主要成分（51–54%），其次是OLA（27–31%），而PLA仅以微量存在（≤2%）。通过总和PLA、OLA和LA的总量，动力学分析显示了降解速率在尺寸和形状上的显著差异（图3e）。在整个9小时的降解研究过程中，蛋白酶K的活性基本保持不变（图S14），排除了酶失活作为观察到的动力学差异的因素。小囊泡（SPsome和SSto）降解迅速，在1小时内达到约80%的水解，而大囊泡（LPsome和LSto）在同一时间段内降解较慢（分别为约51%和约24%）。长时间孵育（4–6小时）最终使两种大囊泡类型都达到了类似的约80%的降解水平，表明尺寸决定了降解动力学，但最终的降解程度是一致的。由于在9小时后NMR管中观察到沉淀物，因此没有任何一种囊泡类型实现了完全水解（图S15）。我们将残留的沉淀物归因于聚集体的形成，这阻碍了蛋白酶K的accessibility。

图3
图3. 聚合物囊泡的形状和大小依赖的降解动力学。(a) 在37°C下进行9小时酶促水解后，SSto释放的降解产物的实时1H NMR光谱，显示了对应于PLA（δ 1.48–1.40 ppm）、寡聚乳酸(OLA，δ 1.34–1.27 ppm）和乳酸(LA，δ 1.21–1.16 ppm)的甲基质子信号。(b–e) 在37°C下，四种囊泡类型中酶促水解时间函数的降解产物LA (b)、OLA (c)、PLA (d) 和 PLA + OLA + LA (e)的定量。产品定量详情见支持信息。b–d中的虚线作为视觉辅助线；e中的虚线表示对一级反应模型的拟合。(f) 与LPsome和SPsome孵育10分钟后的膜插入分子探针的相对荧光强度(FI)。数据表示平均值±标准差（n = 3）。(g,h) 在37°C下暴露于蛋白酶K时，四种囊泡类型的Dh（%）相对于起始点（g）的相对变化以及相应的PDI（h），通过DLS测量，标准差以阴影区域表示（n = 3）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

为了量化动力学，1H-qNMR数据被拟合为一阶衰减模型，得出反映水解速度的速率常数（k）和代表平台转化的最大降解程度（Dmax）（表S1及相关讨论）。小囊泡的降解速度快一个数量级，其中SPsome（k = 7.4 h–1，Dmax = 80.1%）和SSto（k = 7.1 h–1，Dmax = 84.9%）明显快于LPsome（k = 0.8 h–1，Dmax = 79.6%）和LSto（k = 0.3 h–1，Dmax = 84.2%）。

为了研究小囊泡降解动力学更快的原因，我们通过冷冻TEM测量了膜厚度，并确认所有四种类型的囊泡厚度相当（约20 nm，图S20a），表明它们的双层结构和链扩展是相似的。相比之下，小囊泡的更高曲率增加了外层片层的横向间距，导致平面内聚合物链的堆积更加松散，且缺陷更多。这一结构特征可能增强了酶的可达性，从而解释了SPsome和SSto相对于其较大对应物的加速降解。这种尺寸依赖性与基于PLA的块状材料（如固体微/纳米颗粒和薄膜）的报告趋势不同，后者由于酸性物质的积累而加速降解。(48,49) 相反，关于自组装的含PLA纳米结构的研究表明，PLA在水合和纳米尺度下显示出比块状PLA更快的降解速度，这是由于酶的可达性增强所致，(13) 与我们的观察结果一致。形状引入了第二层控制。由于内陷形态，口胞细胞的局部曲率高于聚合物囊泡，这预计会加速降解。然而，口胞细胞狭窄的开口（LSto，21 ± 4 nm；SSto，15 ± 3 nm，图S20b）对酶的进入（约4 nm大小）施加了扩散限制(50,51)，从而抵消了曲率驱动的加速作用。根据Renkin的模型，即使扩散物质明显小于孔径，通过收缩孔道的扩散也会受到空间排斥和流体动力阻力的显著阻碍。(52) 定量分析表明，酶通过口胞细胞开口的扩散仅限于自由扩散的约26–40%（详见支持信息）。因此，在小囊泡中，曲率增强和扩散限制大致相互抵消，导致SSto和SPsome的降解速率相当。在较大的囊泡中，曲率可以忽略不计，扩散限制占主导地位，使得LSto的降解速度比LPsome慢。这些结果共同分离了尺寸和形状的贡献，表明曲率和形状因素（口胞细胞的开口）共同决定了不同囊泡架构下的酶降解动力学。

为了探究与囊泡曲率相关的膜堆积差异，我们使用了我们小组最近开发的荧光探针pyrene-EG4-OH来评估膜的可达性。(53) 该探针通过范德华相互作用将其疏水性芘部分插入PEG冠层（图S16b），荧光强度反映了膜的可达性。在相同条件下，SPsome和LPsome与等量的聚合物和探针一起孵育10分钟。SPsome的荧光强度比LPsome高21%（图3f），表明在高曲率囊泡中膜堆积更为松散。为了进一步支持荧光探针实验所显示的膜堆积差异，我们在两种样品的总聚合物量相同的情况下，量化了SPsome和LPsome囊泡中的聚合物堆积密度。利用测量的囊泡半径、膜厚度和粒子浓度（表S2）以及方程式（S1–S3），我们发现SPsome的堆积密度低于LPsome（??SPsome??LPsome = 0.85，详见支持信息）。这一定量估计提供了额外证据，表明SPsome中的更高曲率与更松散的膜堆积和更多的堆积缺陷相关（图S17），这与之前的实验和模拟研究结果一致，无论是在脂质还是聚合物自组装中。(54?57)

为了补充分子层面的见解，我们使用时间分辨DLS监测了37°C下降解过程中的纳米尺度尺寸变化（图3g,h）。在没有蛋白酶K的情况下，所有囊泡的Dh和PDI在pH 7.4下保持稳定，最长可达5天（图S18a,b）。即使在酸性条件下（pH 5.5），9小时内也没有观察到显著变化（图S18c,d），证实了囊泡的完整性。加入酶后，尺寸效应立即显现：小囊泡降解更快，SPsome在10分钟内Dh增加了920%，PDI为0.47，而LPsome的Dh变化最小（8%）。当比较形状效应时，口胞细胞在Dh和PDI上显示出更温和的变化。9小时后，在DLS样品中观察到聚集物（图S19），这与NMR管中9小时后观察到的沉淀物一致（图S15）。这种行为表明口胞细胞遵循不同的降解路径，我们通过检查降解过程中的形态变化进一步进行了研究。

为了直接可视化囊泡形状如何决定降解路径，我们使用冷冻TEM观察了四种PEG-b-PLA囊泡类型在37°C下与蛋白酶K反应的情况（图4a–d，S21和S22）。有趣的是，显微图显示了两种不同的形状依赖路径。无论大小如何，球形聚合物囊泡都经历了整体膜塌陷（图4a,b），表明存在渗透压不平衡。为了探究这一点，我们监测了混合物的渗透压，在加入酶后立即为20 mOsmol kg–1，2小时后在37°C下增加到24 mOsmol kg–1（n = 3，图S23）。尽管空间平均的总体渗透压增加幅度不大，但聚合物链的酶解特别是在外层片层中产生了可溶性产物，如LA和OLA。这些产物在膜界面短暂产生了局部放大的渗透压应力，并与降解引起的膜弱化共同作用，导致水外流和聚合物囊泡的塌陷（图4e，塌陷路径；详见支持信息）。

图4. 聚合物囊泡的形状依赖性降解路径。(a–d) 冷冻TEM图像显示了SPsome（a）、LPsome（b）、SSto（c）和LSto（d）在37°C下与蛋白酶K反应2小时前后的形态演变。刻度尺为200 nm。在口胞细胞中，降解通过选择性失去外膜进行：片段脱落（白色箭头），逐渐消失（绿色箭头），并在周围溶液中观察到（红色箭头），而内膜在随后降解之前保持大部分完整且可辨识（黄色箭头）。相比之下，聚合物囊泡经历了整体塌陷。(e) 两种形状依赖性降解路径的示意图。无论大小如何，聚合物囊泡（SPsome和LPsome）在渗透压应力下都会塌陷，而口胞细胞（SSto和LSto）则遵循双层分辨的路径，在此过程中内膜得以保留，因为口胞细胞的开口允许可溶性降解产物的平衡，防止渗透压不平衡。

相比之下，口胞细胞由于其独特的内陷内膜而经历了逐步的双层分辨降解路径（图4c,d）。外膜首先降解，碎片逐渐脱落（白色箭头），导致不完整的口胞细胞，膜的部分缺失。偶尔在周围环境中观察到脱落的外膜碎片（红色箭头）。随着时间的推移，外膜完全消失，而内膜在整个2小时的实验观察窗口内基本上保持完整且可辨识，形成了具有剩余开口的单层囊泡（绿色箭头）。只有在外膜去除后，内膜才会经历随后的降解（黄色箭头），最终消失且无法通过成像检测到。值得注意的是，没有外膜的保护，口胞细胞并未发生塌陷。口胞细胞的开口为可溶性降解产物提供了在内外腔之间平衡的扩散路径，从而缓解了渗透压应力，防止了导致快速膜塌陷的渗透压不平衡（图4e，双层分辨顺序路径）。这种行为进一步支持了我们对聚合物囊泡降解路径的解释，即球形聚合物囊泡缺乏这样的开口，导致渗透压不平衡的产生和最终的整体塌陷。内陷的双层结构赋予了结构韧性：口胞细胞的开口允许降解产物进入内腔，缓解了渗透压应力，并在中间阶段保持了囊泡的完整性。相比之下，简单的聚合物囊泡缺乏这种缓冲能力。总体而言，这些结果表明，囊泡的形状而不是大小决定了降解路径，突出了超分子结构作为设计具有可编程响应性降解的聚合物纳米结构的关键参数。

除了本研究揭示的形状和尺寸效应外，我们的发现还可能为其他结构的聚合物纳米颗粒（如管状和盘状颗粒）的降解行为提供有用见解，强调了内在物理参数（包括分子堆积和曲率）在控制降解动力学和路径中的潜在作用。

我们的研究揭示了一个以前未被认识到的原理，即通过内在结构来编程合成囊泡的降解。通过利用囊泡的形状和大小而非传统的化学修饰，我们证明了对降解动力学和降解路径的精确控制。小囊泡由于更高的膜曲率而表现出更快的降解动力学，这松动了聚合物的堆积并增强了酶的可达性。我们进一步识别出两种不同的路径：球形聚合物囊泡经历快速的整体塌陷（塌陷路径），而内陷口胞细胞则通过逐步的双层分辨路径降解，在较长时间内保持内膜的完整性（双层分辨顺序路径）。这些不同的路径可以根据不同的应用进行定制。塌陷路径实现了快速局部释放，而双层分辨顺序路径支持不同货物的多阶段顺序释放。总的来说，我们的发现建立了一个将超分子结构与可编程的时空控制降解联系起来的机制框架，并为设计适应性可降解纳米结构提供了基础，包括药物输送和人工通信等应用。