对于携带ALK融合基因的III期非小细胞肺癌（NSCLC），诱导使用阿莱克替尼（Alectinib）或克唑替尼（Crizotinib）：一项包含4年随访的研究

《Chinese Medical Journal》：Induction alectinib or crizotinib for stage III NSCLC harboring ALK fusion: A study with 4-year follow-up

　　**摘要**

**背景：** 尽管对于携带ALK融合基因的晚期非小细胞肺癌（NSCLC），ALK酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的使用已显示出更高的响应率和长期的疗效，但在局部晚期NSCLC中早期使用ALK-TKIs的作用仍缺乏充分研究。本研究旨在探讨ALK靶向诱导治疗在III期肺癌中的短期和长期疗效。

**方法：** 我们从2016年起连续收集了广东省肺癌研究所的患者数据，其中经病理学确认为IIIa–IIIB期NSCLC并最初接受ALK-TKIs诱导治疗的患者符合后续分析的条件。我们对患者的临床病理特征及治疗管理进行了全面回顾。对接受阿莱替尼治疗的患者的纵向单细胞RNA测序数据进行了分析。使用Fisher精确检验比较两个分类变量，并在可能的情况下应用Kaplan–Meier方法绘制生存曲线并估算中位数和95%置信区间（CI）。

**结果：** 共有40名III期NSCLC患者接受了阿莱替尼或克唑替尼的治疗。在需要进行手术的患者中，所有患者均实现了R0切除（完全切除），术后未接受放疗。根据Clavien–Dindo评分，仅有两名患者出现了二级术后并发症。阿莱替尼在病理反应方面显示出优于克唑替尼的显著效果：主要病理反应（MPR）率为11/17（64.7% vs 6/13，P = 0.46）和完全病理反应（pCR）率为6/17（35% vs 2/13，P = 0.41）。接受阿莱替尼治疗的患者无进展生存期（PFS）显著更长（未达到[NR] vs 17.9个月，P < 0.001），总体生存期也有所改善（NR vs NR，P = 0.092）。阿莱替尼组的患者脑转移是最常见的复发类型。纵向单细胞RNA测序显示，残留肿瘤具有更高的干细胞特性，并诱导出更具抑制性的免疫微环境；而实现pCR的切除标本则表现出高度炎症的微环境以及浸润的调节性T细胞和耗竭的T细胞减少。

**结论：** AKT-TKIs的诱导治疗为局部晚期ALK阳性NSCLC提供了一种临床有效且耐受性良好的治疗方案。

**通俗语言摘要：** 本研究评估了在局部治疗前（即诱导治疗阶段）开始使用ALK-TKIs对III期ALK阳性NSCLC是否安全有效。40名患者分别接受了阿莱替尼或克唑替尼治疗。所有接受手术治疗的患者均实现了完全切除（R0），无需术后放疗，仅两名患者出现二级并发症。阿莱替尼组的MPR（64.7% vs 46.2%）和pCR（35% vs 15%）率更高，PFS也更长（未达到[NR] vs 17.9个月，P < 0.001）。脑转移是最常见的复发形式。单细胞RNA测序显示，残留肿瘤更偏向干细胞特性，且具有免疫抑制作用；而pCR样本则具有高度炎症的免疫微环境。总体而言，ALK-TKIs诱导治疗有效且耐受性良好。

**常见问题解答：**
**引言：** 局部晚期NSCLC的治疗效果依然不理想，III期患者的5年总体生存率仅为15–20%[1–4]。局部晚期NSCLC的治疗方案取决于疾病是否可切除。数十年来，无论是否可切除，化疗一直是标准治疗方式[5–7]。随着靶向治疗和免疫治疗的快速发展，转移性NSCLC的预后显著改善[8]。对于携带驱动基因突变的晚期NSCLC患者，靶向治疗的无进展生存期（PFS）和总体生存期（OS）明显优于传统化疗[9]，这促使人们考虑将靶向治疗引入疾病早期阶段。CTONG1103（NCT01407822）是唯一一项评估表皮生长因子受体（EGFR）突变可切除III期NSCLC的新辅助和辅助厄洛替尼治疗的随机对照试验[10]。尽管与术前化疗相比，厄洛替尼的PFS有所提高，但客观反应率（ORR）的改善并不显著，且两组之间的残留活肿瘤（RVT）中位数相似，提示短期内使用EGFR-TKI的新辅助治疗效果相对较弱。ALK融合在早期和转移性NSCLC中的发生率远低于EGFR突变[11,12]。然而，ALK-TKIs在晚期NSCLC中表现出显著疗效，ORR更高，总体生存期也有所改善[13,14]。应用高效ALK-TKIs可能重新定义可切除疾病的边界，并改善异质性III期疾病的预后，但目前尚不确定。近期阿莱替尼在携带ALK融合的早期NSCLC辅助治疗中的进展引发了对其在术前应用疗效的进一步评估兴趣[15]。由于ALK融合的发生率极低，目前只有少数前瞻性试验探讨了ALK-TKIs的诱导治疗可行性，且尚未有研究公布最终结果。我们之前报告了一项基于两个中心的回顾性真实世界研究，显示新辅助克唑替尼在携带ALK融合的局部晚期NSCLC中具有较高的响应率和令人印象深刻的病理完全反应率[16]。本文报告了扩展样本量和长期随访的更新分析，内容包括病理反应、手术结果、PFS/OS、复发模式以及诱导治疗前后样本的单细胞测序分析。

**方法：** 我们回顾了2016至2022年间在广东省人民医院诊断为cIIIA-IIIB期NSCLC（允许N3/IIIB期患者）的464名患者，通过下一代测序（NGS）或免疫组化（IHC，D5F3试剂，Ventana Medical Systems，Tucson，AZ）/荧光原位杂交（FISH）确认ALK融合。纳入标准为：（1）作为一线治疗接受ALK-TKIs；（2）在ALK-TKIs使用前未使用其他靶向治疗或免疫治疗；（3）允许进行局部治疗，包括放疗和手术。共收集了40名患者的连续数据用于后续分析。是否适合接受根治性手术或确定性放疗由经验丰富的外科医生和放射科医生判断。患者在接受ALK-TKIs诱导治疗后，可继续接受局部手术、放疗或持续TKIs治疗。治疗前每位患者均签署了知情同意书，并获得了伦理委员会批准（批准编号2019-246H-01）。

**初始分期和随访：** 初始分期评估包括增强型胸部CT扫描加脑部MRI或PET/CT；怀疑有纵隔淋巴结转移的患者需进行支气管内超声（EBUS）以进一步确认N2状态。病理学确认为IIIB/N3期的患者也被纳入研究。所有分期标准均基于第8版TNM系统。长期随访中，每3–6个月进行常规胸部CT扫描和腹部超声检查，必要时进行脑部MRI。当出现相关症状时进行骨扫描。怀疑疾病复发时进行全身PET/CT检查，并进行强制性活检（除非为脑转移）。后续治疗根据疾病进展情况决定。

**结果评估：** 共有30名患者符合病理反应评估条件（10名未接受手术的患者被视为无主要病理反应[MPR]），40名患者用于更新PFS/OS分析，21名患者用于复发模式和后续治疗分析。PFS/OS定义为从诊断开始至疾病进展或患者死亡的时间间隔。主要病理反应（MPR）和完全病理反应（pCR）定义为原发肺癌中残留活肿瘤比例不超过10%且无残留病灶。复发模式包括局部复发/转移和远处转移。

**单细胞RNA测序：** 新鲜切除的组织在手术后的半小时内保存在MACS组织储存液中（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国），直至处理。样本先用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，冰上切碎至约1 mm3大小，然后加入250 U/mL胶原酶I（Worthington Biochemicals，Lakewood，NJ，USA）、100 U/mL胶原酶IV（Worthington Biochemicals）和30 U/mL DNase I（Worthington Biochemicals，Lakewood，NJ，USA）在37°C下酶解45分钟。酶解后通过70 μm孔径的细胞过滤器过滤并离心300 × g 5分钟。去除上清液后，将沉淀的细胞悬浮在红细胞裂解缓冲液中（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）以裂解红细胞。用含0.04%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤后，细胞重新悬浮在含0.04% BSA的PBS中，并通过35 μm孔径的过滤器过滤。利用Countstar荧光细胞分析仪（Countstar Altair，上海，中国）对分离出的单细胞进行活性评估。

**scRNA-seq：** 使用10X Genomics Chromium Controller仪器和Chromium Single Cell 3’ V3试剂盒（10X Genomics，Pleasanton，CA，USA）生成scRNA-seq文库。将细胞浓度调整至1000 cells/uL，每个通道加载约8000个细胞，生成单细胞凝胶珠（GEMs），每个样本生成约5000个单细胞的mRNA条形码。逆转录后，断裂GEMs，纯化并扩增条形码cDNA。扩增后的cDNA片段化、加A尾、连接适配器，并进行索引PCR扩增。最终文库使用Qubit高灵敏度DNA检测仪（Thermo Fisher Scientific，上海，中国）进行定量，Bioanalyzer 2200（Agilent，Bangalore，India）上的高灵敏度DNA芯片确定文库大小分布。所有文库使用HiSeq 10X（Illumina，San Diego，CA）进行测序。

**单细胞RNA数据分析：** 应用FASTQ数据，通过默认参数过滤掉适配器序列并去除低质量读段。使用CellRanger v3.1.0（Pleasanton，USA）将读段与人类基因组（GRCh38）对齐，得到特征-条形码矩阵。细胞包含超过200个表达基因，且线粒体独特分子标识符（UMI）比例低于20%的细胞通过细胞质量过滤。线粒体基因从表达表中移除，但仍用于细胞表达回归，以便进行聚类分析和标记基因分析。使用Seurat包（版本2.3.4，https://satijalab.org/seurat/）进行细胞归一化和基于UMI计数的回归分析。基于归一化数据进行了主成分分析（PCA），并使用top 10主成分构建t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding（tSNE）。使用R包scran（v1.10.2）的fastMNN函数（k = 5，d = 50，approximate = TRUE，auto.order = TRUE）校正样本间的批量效应。基于PCA前10个主成分进行无监督细胞聚类，并使用FindAllMarkers函数和Wilcoxon秩和检验算法计算标记基因。

**统计方法：** SPSS软件（版本25.0，IBM，Armonk，NY，USA）、GraphPad Prism（版本8.0，GraphPad Software，San Diego，CA）和R软件（版本4.0，R Foundation，Vienna，奥地利）用于统计和生存分析。连续变量以中位数和全范围表示；分类变量以频率和百分比表示。连续变量使用学生t检验或Mann–Whitney U检验进行比较；分类变量使用卡方检验或Fisher精确检验进行比较。Kaplan–Meier分析用于比较各组间生存差异，计算log-rank检验的P值。所有报告的P值均为双尾分布，统计显著性定义为P <0.05。结果：纳入患者的人口统计学特征。共有40名来自同一中心的患者符合纳入标准，被纳入后续分析。28名患者的ALK融合状态通过NGS得到确认，其余患者则通过免疫组化/荧光原位杂交（IHC/FISH）进行检测。其中17名患者被诊断为cIIIA型，23名患者被诊断为cIIIB型。在40名患者中，19名接受了克里佐替尼（crizotinib）治疗，21名接受了阿来替尼（alectinib）作为新辅助治疗[图1A]。在阿来替尼组中，9名（42.9%）患者最初被认为无法手术切除，而在克里佐替尼组中，19名患者中有8名（42.1%）在多学科讨论后被认为无法手术切除。基线特征在克里佐替尼组和阿来替尼组之间没有统计学差异，包括年龄、性别、吸烟状况和局部治疗方式。接受新辅助阿来替尼治疗的患者的治疗持续时间略长于接受克里佐替尼治疗的患者（中位数分别为103.5天 vs 81.5天；U = 5.26，P = 0.031）。为了解决可能因治疗持续时间不同而产生的偏倚问题，我们分析了治疗持续时间与放射学/病理学缓解程度之间的相关性，但未发现显著差异[补充图1，https://links.lww.com/CM9/C599]。最终，克里佐替尼组中有13名患者接受了手术、1名患者接受了放疗，5名患者继续接受了TKI治疗；而阿来替尼组中分别有17名患者接受了手术、3名患者接受了放疗，1名患者继续接受了TKI治疗。未接受手术的原因包括患者拒绝手术以及两组患者在接受诱导治疗后疾病仍然无法切除但未出现临床进展或恶化。对患者的放射学和病理学反应进行了严格评估[图1B、C]。在接受手术的患者中，有4名（30.8%）由于肺切除术或经济原因未接受辅助治疗，而克里佐替尼组中的其他患者则继续接受了辅助克里佐替尼治疗。在阿来替尼组中，有2名（11.8%）患者由于经济原因或个人意愿未接受辅助治疗，其余患者则继续接受了辅助阿来替尼治疗。辅助治疗的中位持续时间为12.7个月和16.9个月。关于医疗记录，克里佐替尼组中有19名（57.9%）患者进行了常规脑部成像检查，阿来替尼组中有13名（61.9%）患者进行了此类检查；其他患者则在出现中枢神经系统相关症状时接受了成像检查。详细的临床病理学特征总结在表1中。

图1：接受ALK-TKI诱导治疗的NSCLC患者的临床病理学特征和反应评估。（A）研究流程图概述。（B和C）ALK-TKI诱导前后的放射学和病理学反应对比。（D）使用ALK（D5F3）抗体评估ALK状态，特别是对于那些被评估为MPR或pCR的患者，以防假阴性结果。条形图的比例设为20倍。（D）不同治疗下的临床病理学特征和病理学缓解程度。（E）比较ALK-TKI诱导治疗前后患者的病理学反应，使用比值比进行差异估计。（F）不同ALK变异类型的病理学反应，使用Fisher精确检验计算不同变异类型之间的显著性差异。ALK-TKIs：间变性淋巴瘤激酶-酪氨酸激酶抑制剂；CI：置信区间；FISH：荧光原位杂交；IHC：免疫组化；KCNG3：钾电压门控通道亚家族G成员3；MPR：主要病理学反应；NSCLC：非小细胞肺癌；nMPR：非主要病理学反应；PR：部分反应；RECIST：实体瘤反应评估标准；RT：放疗；SD：疾病稳定；Tx：治疗；V：变异。

表1 - 接受ALK-TKI治疗的ALK+ NSCLC患者的基线特征。特征 总计（N = 40） 阿来替尼组（n = 21） 克里佐替尼组（n = 19） 统计值 方法 P值 年龄，平均值 ± 标准差 49.0 ± 10.2 50.7 ± 9.9 46.5 ± 10.4 –1.31 t检验 0.198 性别，n (%) <0.01 卡方检验 1.000 女性 19 (47.5) 10 (47.6) 9 (47.4) ? 男性 21 (52.5) 11 (52.4) 10 (52.6) ? 吸烟状况，n (%) 0.03 Yates’ 0.712 从未吸烟 31 (77.5) 17 (81.0) 14 (73.7) 校正 存在吸烟 9 (22.5) 4 (19.0) 5 (26.3) ? TNM分期，n (%) 1.52 卡方检验 0.337 IIIA 17 (42.5) 7 (33.3) 10 (52.6) ? IIIB 23 (57.5) 14 (66.7) 9 (47.4) ? N分期，n (%) 2.28 Yates’ 0.965 N0 3 (7.5) 2 (9.5) 1 (5.3) 校正 N1 2 (5.0) 1 (4.8) 1 (5.3) N2 23 (57.5) 12 (57.1) 11 (57.9) N3 12 (30.0) 6 (28.6) 6 (31.5) 局部治疗方式，n (%) 4.11 Yates’ 0.126 手术 30 (75.0) 17 (80.9) 13 (68.4) ? 放疗 4 (10.0) 3 (14.3) 1 (5.3) ? 继续TKI治疗 6 (15.0) 1 (4.8) 5 (26.3) ? Omaha分类法（ORR） 96.0 (80.3, 136.3) 103.5 (90.0, 157.5) 81.5 (59.3, 96.5) 5.26 Wilcoxon 0.031

治疗反应和围手术期安全性：所有患者均以初始剂量每日250毫克或600毫克服用克里佐替尼或阿来替尼。详细的临床病理学特征、病理学缓解程度和基因组特征在图1D中进行了描述。19名患者接受了克里佐替尼治疗，总缓解率（ORR）为73.7%。阿来替尼组的ORR与克里佐替尼组相似，71.4%的患者达到了部分反应（PR）或完全反应（CR）。在25名基线时病理学确认为N阳性的患者中，进行了手术的患者中，总体N降期率为60.0%（克里佐替尼组15/25，阿来替尼组分别为71.4%和45.5%）。克里佐替尼组中有1名患者接受了肺切除术，阿来替尼组中有4名患者接受了亚肺叶切除术；选择亚肺叶切除术而非全肺叶切除术的原因包括N3期疾病以及ALK-TKI诱导治疗后的手术困难。所有患者均接受了系统性淋巴结清扫，除了阿来替尼组中有1名患者仅进行了淋巴结采样。尽管未发现统计学差异，但阿来替尼组表现出更高的主要病理学反应（MPR，64.7% vs 46.2%；比值比：0.43；95%CI：0.11–1.57；P = 0.22）和pCR（35.3% vs 15.4%；比值比：0.24，95%CI：0.04–1.67；P = 0.24），这可能反映了其在晚期NSCLC中的高效性和更长的生存益处[图1E]。在ALK变异类型方面，阿来替尼组和克里佐替尼组之间没有显著差异[图1F]。在诱导治疗期间，未观察到严重的不良事件。克里佐替尼最常见的不良事件是恶心和AST/ALT升高，而阿来替尼的不良事件包括AST/ALT升高和皮疹。3–5级不良事件的发生率分别为9.5%（2/21）和26.3%（5/19）[图2]。在接受手术的患者中，所有患者均实现了R0切除，且没有手术延迟。手术时间、住院时间和术中出血量分别为150分钟、5天和37.5毫升。新辅助阿来替尼组相比克里佐替尼组估计的出血量略有减少（30毫升 vs 60毫升，Z = 0.04，P = 0.03），但手术时间和住院时间无差异[表2]。只有2名患者在术后出现了Clavien-Dindo评分中的2级并发症，并需要输血。阿来替尼组和克里佐替尼组之间均未观察到30天或90天的死亡事件。

表2：接受阿来替尼和克里佐替尼治疗的非小细胞肺癌患者的外科结果比较。所有患者（N = 30） 治疗方案 统计值（Wilcoxon-rank检验） 阿来替尼组（n = 17） 克里佐替尼组（n = 13） 手术时间（分钟） 150 ± 57 150 ± 65 160 ± 43 0.62 0.80 出血量（毫升） 38 (10–400) 30 (10–400) 60 (20–400) 0.04 0.03 住院时间（天） 5.0 ± 2.1 4.0 ± 1.2 5.0 ± 2.7 0.72 0.15

长期生存和复发模式分析：经过48.3个月（19.3–87.2个月）的中位随访时间后，接受ALK-TKI诱导治疗的患者的中位无进展生存期（PFS）为26.0个月，而中位总生存期（OS）未达到[图3A和B]。具体而言，4名接受阿来替尼治疗的患者出现了疾病进展或复发，而17名接受克里佐替尼治疗的患者出现了PFS事件。阿来替尼组的中位PFS显著更长（未达到[NR] vs 17.9个月，HR = 0.13 [0.04–0.39]，P <0.001）。关于OS，未发现统计学差异（NR vs NR，对数秩P = 0.092），这可能是由于随访时间相对较短以及ALK-TKI的长期疗效更优[图3C和D]。进行了单变量和多变量Cox回归分析，结果表明治疗方式（阿来替尼/克里佐替尼）是PFS的独立预测因子，而非病理学反应、后续治疗和临床分期[图3E]。总体而言，在长期随访期间，21名患者出现了疾病复发或进展。在4名接受阿来替尼治疗后进行手术的患者中，1名患者出现局部复发并伴有新的肺部病变和病理学确认的纵隔淋巴结转移，其余患者出现新的脑部或肝脏病变，这可能是由于停止了阿来替尼辅助治疗。重新使用阿来替尼后，局部复发的病变和远处转移通过增强CT扫描和MRI迅速缩小。在克里佐替尼组中，17名患者出现了疾病复发或进展，其中多达64.7%（11/17）的患者最初仅发现脑部转移病变[图3F]。2名在复发后接受化疗的患者OS显著缩短，分别为15.2个月和25.6个月。其他接受ALK-TKI治疗的患者（73.3%，其中部分接受了伽玛刀治疗[26.7%]）获得了持续的反应，大多数患者（80.0%）仍然存活[图3G]。

图3：长期生存和复发模式的分析。治疗时间和不同放射学及病理学反应的关联。（A）所有入组患者的无进展生存期（PFS）和（B）总生存期（OS），以及（C和D）按不同诱导治疗方案分层的分析。使用Cox回归和对数秩检验来评估生存的显著性；（E）根据不同临床特征和反应的单变量和多变量Cox回归分析。（F）阿来替尼和克里佐替尼治疗后疾病复发部位的分布。（G）接受阿来替尼或克里佐替尼治疗后疾病复发的患者的治疗时间框架。M：转移部位；MPR：主要病理学反应；nMPR：非主要病理学反应；P：病理反应；PFS：无进展生存期；PR：部分反应；RT：放疗；S：疾病稳定；T：治疗；TKI：酪氨酸激酶抑制剂。

尽管ALK-TKI在晚期NSCLC中的放射学反应率极高，但诱导治疗策略提供了另一个用于疗效评估的微观终点：病理学反应，这补充了传统的放射学评估。两名患者的治疗后标本或连续标本进行了单细胞RNA测序（scRNA），以探索可能的反应机制或耐药机制。两名患者均接受了阿来替尼治疗，其中一名（PT1）实现了病理学完全反应（pCR），另一名（PT2）则仍有残留肿瘤。详细的临床信息和分析流程图见图4A。我们首先研究了响应者（PT1）和非响应者（PT2）治疗后的免疫微环境和上皮细胞的差异。图4B展示了不同细胞类型的整体映射和特征基因。在浸润性T淋巴细胞中，我们识别出8个簇，这些簇可以被具体标记为CD4+Na?ve（CCR7）、CD4+效应记忆T细胞（Tem）（IL7R）、CD4+Th1样（CXCL13）、CD4+Treg（Foxp3）、CD8+Na?ve（LEF1）、CD8+效应T细胞（Tef, CX3CR1）、CD8+Tem（IL7R）和CD8+耗竭T细胞（Tex, PDCD1）[图4C]。值得注意的是，响应者组的CD8+Tef和CD4+Tem比例较高，而非响应者组中则观察到CD8+Tex、CD4+Na?ve、CD4+Th1样和CD4+Treg比例显著较高[图4D]。T淋巴细胞在响应者和非响应者之间的差异基因表达显示，响应者的炎症表型更为明显，CX3CR1、TNF和GNLY的表达显著升高[图4E]。此外，响应者组中CD48的表达也显著升高，这与浸润的细胞毒性T细胞、B细胞和Th1细胞的高相关性一致。Pseudotime分析也显示了响应者组中T淋巴细胞的激活状态，而非响应者组的抑制状态更为明显[图4F]。对于上皮细胞，五个特定的亚型通过特征标志物被清晰标注[补充图2A，https://links.lww.com/CM9/C599]，并应用InferCNV来识别主要属于俱乐部细胞的恶性肿瘤细胞[补充图2B，https://links.lww.com/CM9/C599]。通过CytoTrace分析，非应答者的上皮细胞的细胞分化程度明显低于应答者[补充图2C，https://links.lww.com/CM9/C599]。图4：通过单细胞分析比较不同的病理反应。(A) 两名接受阿莱卡替尼诱导治疗并表现出不同病理反应的患者的单细胞测序分析流程图。(B) 治疗后样本中带有特征标志物的细胞簇标注。(C) 通过气泡图显示T淋巴细胞亚群的基因表达。(D) 病理应答者和非应答者之间不同浸润T细胞亚群的比例。(E) 应答者和非应答者之间的差异基因表达。(F) 病理反应后CD4+和CD8+ T亚群的伪时间分析。pCR：病理完全缓解；SLD：系统性淋巴结清扫；TIME：肿瘤免疫微环境。在残留肿瘤中抑制网络增强和癌症干性升高 我们进一步比较了一名治疗效果相对较差且残留肿瘤细胞较多的患者治疗前后的样本差异。标注了八大主要细胞簇，发现T/NK细胞显著增加，而上皮细胞在阿莱卡替尼诱导后减少[图5A和B]。我们使用copyKat来识别治疗前后的恶性上皮细胞进行比较，发现化疗吸引相关基因（CXCL1和CXCL8）在治疗后显著下调。相反，公认的癌症干性标记物CD44以及在肺气道中与抗炎相关的SCGB3A2在治疗后显著上调[图5C]。此外，我们对上皮细胞进行了CytoTrace分析，结果也显示治疗后恶性上皮细胞表现出更强的干性潜能[图5D]。对治疗前后的T淋巴细胞进行了标注，发现CD4+Th1样、CD4+na?ve和CD8+Tex亚群的浸润显著增加，而CD4+Treg显著减少[补充图3，https://links.lww.com/CM9/C599]。我们使用CellChat探索治疗前后恶性上皮细胞与T细胞亚群之间的潜在相互作用。在白细胞介素10（IL10）信号通路中观察到增强的相互作用，特别是对于CD4+Na?ve和CD8+Tex，而IL1信号通路没有显著变化。此外，在阿莱卡替尼诱导后，CD4+Naive、CD8+Tem和CD8+Tex之间的CXCL信号通路也观察到增强的相互作用[图5E]。治疗后的CellChat分析确认了IL4信号通路的免疫抑制网络增强，而CX3C信号通路的相互作用减弱，后者涉及响应性T淋巴细胞[补充图4，https://links.lww.com/CM9/C599]。图5：阿莱卡替尼诱导前后纵向样本的单细胞分析。(A) 治疗前后样本的均匀流形近似和投影（UMAP）。(B) 阿莱卡替尼诱导前后不同细胞类型的比例。(C) 治疗前后恶性上皮细胞的差异基因表达。(D) 纵向样本的CytoTrace分析，发现治疗后的样本分化潜能显著增加。* P <0.001。(E) 关于IL-1、IL10、WNT和CXCL信号通路的上皮细胞与T细胞亚群之间的Cellchat。CXCL：C-X-C基序趋化因子配体；IL：白细胞介素。讨论 在这项单中心回顾性分析中，我们的目标是评估阿莱卡替尼诱导治疗的临床可行性，并比较阿莱卡替尼与克唑替尼的临床结果，同时研究复发模式和后续治疗。尽管ALK TKIs已被确立为切除的早期和晚期ALK融合NSCLC的标准治疗[13,15,17–19]，但诱导化疗或放化疗仍是III期NSCLC的标准治疗[1,5]。一项评估EGFR突变IIIA/N2 NSCLC新辅助厄洛替尼的随机对照试验未能在反应率和总生存期方面显示出显著优势[20]。多项涉及早期NSCLC新辅助靶向治疗的前瞻性试验仍在等待初步结果。在早期NSCLC中，ALK融合已被确定为与不良预后相关的预测生物标志物，这突显了ALK TKIs在局部疾病中的未满足临床需求[12,21]。几项回顾性研究和病例报告表明，阿莱卡替尼诱导治疗在III期ALK融合NSCLC中具有临床潜力[16,22]。然而，样本量有限、生存数据不成熟以及缺乏后续管理可能会进一步阻碍ALK TKIs在III期NSCLC中的临床可行性。在本研究中，通过整合一个相对大规模的ALK阳性III期NSCLC队列并进行长期随访，我们发现接受阿莱卡替尼诱导治疗的患者可以获得令人满意的PFS和OS。尽管由于样本量有限，没有统计学显著性，但阿莱卡替尼诱导治疗在病理反应和生存获益方面均优于克唑替尼诱导治疗。调整所有临床病理特征后，阿莱卡替尼仍然是PFS的独立预测指标。在Chekcmate816研究（NCT02998528）中，病理反应状态已被证明与无事件生存期相关。然而，很少有研究评估新辅助靶向治疗对患者生存期的影响。在我们的队列中，我们没有发现两组之间的病理反应与生存期之间存在显著相关性，可能需要更长时间的随访来验证这些相关性。此外，鉴于接受ALK TKIs治疗的ALK融合晚期NSCLC患者的长期生存情况，我们还分析了侵袭性手术在这些患者中可能的作用。尽管两组之间没有观察到生存差异，但由于这是样本量有限的亚组分析，因此应谨慎解释这些结果。与之前涉及围手术期EGFR-TKIs的随机试验类似[20,23]，阿莱卡替尼诱导治疗最常见的复发模式是脑转移。值得注意的是，克唑替尼组中超过60%的患者有孤立性脑转移，而阿莱卡替尼组的脑转移风险显著降低，这突显了在新辅助治疗中使用新型ALK TKIs的优越性。实际上，从克唑替尼切换到第二代ALK TKIs（无论是否使用伽玛刀）的患者也可能有持续的响应持续时间。先前的研究已经探讨了可能影响TKIs疗效的肿瘤内在或免疫机制，包括PD-L1的表达[24]、共存突变[25]和免疫环境[26]。Bivona等人[26]探讨了肺癌的治疗诱导演变，发现残留肿瘤（应答者）含有更高度炎症的微环境，T淋巴细胞增加而Treg浸润减少。此外，与进展性疾病相比，残留肿瘤的功能受损T淋巴细胞显著减少，但NK/NKT细胞增加[26]。然而，这项研究仅采集了活检样本，没有进行完整的病理评估。我们收集了两名在阿莱卡替尼诱导治疗后表现出不同病理反应的患者的纵向样本，并进行了单细胞测序。pCR患者表现出更高度炎症的免疫微环境，而具有大量残留肿瘤的患者则表现出广泛的抑制性微环境。此外，这些残留肿瘤细胞中的CD44表达显著上调，而CXCL1、CXCL8和IL6表达下调，表明浸润淋巴细胞受到抑制，肿瘤细胞的干性增加。后续分析显示，在阿莱卡替尼诱导后，耐药肿瘤中的肿瘤细胞干性和T淋巴细胞中的抑制网络增强，提供了可能影响阿莱卡替尼疗效的肿瘤内在和免疫机制。由于回顾性研究的性质，进一步解释这项研究时应考虑几个注意事项。首先，样本量有限和不同的治疗持续时间可能会影响临床结果，尽管阿莱卡替尼和克唑替尼的中位治疗持续时间相当。此外，尽管该队列的中位随访时间长达48.3个月，但对于ALK融合NSCLC（尤其是III期疾病）来说，随访时间可能仍然不够，导致阿莱卡替尼组的PFS事件和两组OS事件都较少。此外，围手术期未提供化疗，这与当前的标准有所不同。然而，最近发布的ALINA研究数据显示，单独使用阿莱卡替尼辅助治疗可以比传统化疗获得更好的无病生存（DFS），这突显了ALK TKIs在早期NSCLC中的优先性。最后但同样重要的是，本研究的转化发现基于仅两名患者的纵向样本，这可能使得结果的推广变得困难。然而，这些发现与更大规模的晚期疾病队列的结果部分一致，这可能会证实其科学普遍性[26]。总之，这项研究提供了关于在ALK融合的III期NSCLC中使用阿莱卡替尼诱导治疗的临床证据，并首次呈现了接受阿莱卡替尼诱导治疗患者的手术结果、长期预后和复发模式。当用于诱导治疗时，阿莱卡替尼显示出比克唑替尼更好的疗效和更长的生存期。此外，我们还暂时使用了单细胞测序来研究与阿莱卡替尼诱导治疗相关的反应或耐药机制。我们的发现表明，残留肿瘤中的抑制微环境和肿瘤干性增加，而非残留肿瘤则表现出高度炎症的免疫微环境，为治疗诱导的肿瘤内在和免疫反应机制提供了见解。确实，如ALNEO（NCT05015010）和NAUTIKA1（NCT04302025）等进一步的前瞻性研究有助于阐明ALK TKIs在早期疾病中的围手术期作用。致谢 作者感谢所有参与患者的支持。作者还感谢NovelBio提供的scRNA-seq和生物信息学分析支持。资助 本研究得到了非传染性慢性疾病-国家科技重大项目（编号2024ZD0529400）、国家自然科学基金（编号82241235）、国家自然科学基金重大研究计划综合项目（编号82503897和92259303）、国家高层次人才特殊支持计划（****）（KA0120231004）、广东省基础与应用基础研究基金（编号2019B1515130002）、高层次医院建设项目（编号DFJH201801）和广东省肺癌转化医学重点实验室（编号2017B030314120）的资助。利益冲突 Wenzhao Zhong收受了AstraZeneca、Roche、Eli Lilly和Pfizer的演讲酬金。Yilong Wu接受了Roche的研究资助，并从AstraZeneca、Roche、Eli Lilly、Pfizer和Sanofi收到了演讲酬金，同时担任AstraZeneca的研究顾问。