鞘氨醇-1-磷酸通过调节刺猬信号通路效应因子FoxM1，促进肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，并导致肺动脉重构

《Chinese Medical Journal》：Sphingosine-1-phosphate induces pulmonary artery smooth muscle cell proliferation, migration and pulmonary arterial remodeling by modulating sonic hedgehog signaling effector FoxM1

　　**摘要**
**背景**：鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是鞘氨醇的代谢物，与肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的增殖有关。本研究旨在探讨S1P诱导PASMCs增殖的机制，以及这一过程如何促进肺动脉的重塑。

**方法**：原代培养的大鼠PASMCs与S1P共同孵育。使用环孢胺抑制Smoothened（SMO）蛋白的功能，同时通过siRNA转染选择性下调信号转导子和转录激活因子3（STAT3）、胶质瘤相关癌基因同源物1（GLI1）和叉头框M1（FOXM1）的表达。通过5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验来测量细胞增殖情况。利用免疫荧光染色确定Gli1的亚细胞定位。在单硝基苦椒碱（MCT）诱导的肺动脉高压（PAH）大鼠模型中，给予PF543（S1P合成酶抑制剂）、NSC74859（STAT3抑制剂）和环孢胺（ sonic hedgehog [Shh] 受体抑制剂），以评估其对疾病进展的影响。通过血流动力学变化和组织学检查来评价PAH的发展情况。使用免疫印迹法检测鞘氨醇激酶1（SphK1）、磷酸化/总STAT3（p-/t-STAT3）、Shh、Gli1和FoxM1的蛋白水平。

**结果**：S1P通过激活STAT3增加Shh的表达，进而导致PASMCs中Gli1的上调及其向细胞核的迁移。Gli1的激活提高了FoxM1的表达，从而引发了PASMCs的增殖和迁移。在MCT诱导的PAH大鼠模型中，肺组织和血清中的S1P水平升高，导致STAT3活性增加以及肺组织中Shh、Gli1和FoxM1的表达上升。针对这些分子的治疗可以缓解肺动脉重塑并阻止PAH的发展。

**结论**：S1P/STAT3/Shh/Gli1/FoxM1通路在PASMCs增殖和肺动脉重塑中起重要作用。针对这一通路可能具有治疗PAH的潜在价值。

**通俗语言总结**：本研究探讨了鞘氨醇-1-磷酸（S1P）如何促进肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的增殖，这是肺动脉重塑和肺动脉高压（PAH）的关键过程。在原代大鼠PASMCs中，S1P激活了STAT3，进而增加了shock hedgehog（Shh）的表达，导致Gli1上调、向细胞核迁移以及FoxM1表达升高，最终驱动PASMCs的增殖和迁移。在单硝基苦椒碱诱导的PAH大鼠模型中，肺组织和血清中的S1P水平升高，以及STAT3和Shh/Gli1/FoxM1蛋白表达上升。抑制S1P合成酶、STAT3或Smoothened可以减轻肺动脉重塑并减轻PAH症状，表明这一信号通路可能是一个潜在的治疗靶点。

**引言**
肺动脉高压（PAH）是一种危及生命的、多因素引起的疾病，其特征是持续的肺动脉压力升高，导致严重的身体和情绪问题。[1] 尽管PAH有多种形式，但它们具有共同的病理机制，包括肺血管收缩、血管重塑和原位血栓形成。[2] 其中，肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的过度增殖是肺血管重塑的主要驱动力。[3] 因此，探索PASMCs增殖的机制并确定适当的治疗靶点对于PAH的管理至关重要。鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是一种生物活性磷脂，由鞘氨醇通过鞘氨醇激酶1和2（SphK1和SphK2）磷酸化生成。[4] 积累的证据表明，S1P对多种细胞过程至关重要，如小胶质细胞自噬、人类羊膜干细胞的增殖和分化、肿瘤细胞的侵袭、增殖和凋亡。[5–7] 在PAH患者和由慢性缺氧或单硝基苦椒碱（MCT）诱导的动物模型中，均发现S1P水平升高。[8–10] 最近的研究还发现，外源性S1P刺激可以促进PASMCs的增殖和迁移。[11,12] 然而，S1P诱导PASMCs增殖的具体分子机制仍不甚清楚。信号转导子和转录激活因子3（STAT3）是一种已知的转录因子。STAT3在Tyr705位点磷酸化后形成同源或异源二聚体，这些二聚体会转移到细胞核并调节相关基因的转录。[13] 已证明S1P激活的STAT3通路与多种疾病的发展有关，包括心血管疾病、多种恶性肿瘤和炎症性肠病（IBD）。[14–16] 此外，在MCT注射的大鼠肺组织中也检测到STAT3的磷酸化和激活。[17]

Hedgehog（Hh）信号通路是一种进化上保守的通路，参与细胞增殖和分化，与胚胎发育、组织稳态、损伤修复和肿瘤发生有关。[18,19] 该通路的配体（Sonic hedgehog [Shh]、Indian hedgehog [Ihh] 和 Desert hedgehog [Dhh]）与膜受体Patched 1（Ptch1）结合后，可以解除对七跨膜蛋白Smoothened（Smo）的抑制。激活的Smo会诱导下游经典转录因子Gli家族的激活。Gli家族通过调节cyclin D、叉头框蛋白M1（FoxM1）和N-myc原癌基因（MYCN）的表达来促进细胞周期进展和组织稳态。[20–22] 最近的研究表明，与非PAH对照组相比，PAH肺组织中的Shh水平升高，并且Shh可以促进人肺动脉内皮细胞（HPAECs）的增殖。[23] 然而，Shh是否也促进PASMCs的增殖目前尚不清楚。尽管先前的研究显示小鼠中Stat3过表达会增加Shh基因的表达，[24] 但尚不清楚STAT3是否在PASMCs中调节Shh的表达，以及这种调节是否促进了PAH的发病机制。为了验证这些假设，我们研究了S1P对原代培养的大鼠PASMCs的影响，检测了磷酸化/总STAT3（p-/t-STAT3）、Shh、Gli1和FoxM1的mRNA和蛋白水平，并探讨了它们的调控相互作用。此外，还在MCT诱导的PAH大鼠模型中验证了这些发现。右心室收缩压（RVSP）和右心室肥大指数（RVHI）的测量：所有存活的大鼠在第28天通过腹腔注射10%氯醛水合物（3 mL/kg）进行麻醉。通过分离的右侧颈内静脉将充满肝素化盐水的导管插入右心室（RV）。使用Grass多导生理记录仪（AD Instruments，澳大利亚墨尔本）来测量RVSP。完成血流动力学测量后，将心脏解剖成右心室（RV）、左心室（LV）和室间隔（S），然后分别称重。右心室重量与左心室和室间隔重量之和的比值（RV/[LV+S]）被计算为RVHI。

肺血管的组织学分析：从右下肺叶获取样本，并在4%甲醛中固定48小时。通过分级乙醇系列脱水并在二甲苯中透明处理后，按照标准组织学程序将组织包埋在石蜡中。然后将包埋的组织切成5 μm厚的切片，并将其安装在聚-L-赖氨酸涂层的载玻片上。随后，在二甲苯中脱蜡，通过分级乙醇系列重新水化，用苏木精和伊红染色。染色后，再在分级乙醇中脱水，在二甲苯中透明处理，用中性香脂封片，然后在倒置显微镜下观察。通过测量直径为50–200 μm的血管中膜壁厚度（%MT）来评估肺血管重塑。%MT的计算公式为：%MT = (2MT/ED) × 100，其中MT表示内外弹性层之间的距离，血管外径（ED）是通过光学显微镜测量的。

免疫组化：为了评估肺动脉肌化的程度，用抗α-平滑肌肌动蛋白（SMA）抗体（Boster Biological Technology，中国武汉，#BM0002，稀释度1:200）对肺组织切片进行染色，并在光学显微镜（200倍放大）下观察。将这些血管（每只动物30条动脉，直径20–200 μm）分类为肌化、部分肌化或非肌化。计数不同肌化程度的小肺动脉数量，并使用Image Pro Plus图像分析软件（Media Cybernetics，美国马里兰州银泉）计算百分比。根据小肺动脉壁中α-SMA阳性细胞的百分比，将其分类为：非肌化小动脉（<25%阳性细胞）、部分肌化小动脉（25–75%阳性细胞）和完全肌化小动脉（>75%阳性细胞）。

双标记免疫荧光染色：为了评估MCT诱导的肺动脉高压大鼠中PASMC的增殖和动脉重塑，进行了Ki67和α-SMA的共染色。肺切片（5 μm厚）在4°C下与α-SMA（1:200稀释度，Boster Biological Technology）和Ki67（1:1000稀释度，Servicebio, Inc., 美国波士顿）孵育过夜。然后用Alexa Fluor 488标记的二次抗体和Cy3标记的二次抗体染色50分钟，接着用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染10分钟。切片洗涤后成像。

Masson染色：大鼠肺切片在二甲苯中脱蜡，通过递减乙醇系列重新水化，然后用蒸馏水冲洗。按照标准方案进行Masson三色染色。简要来说，切片先用Weigert铁苏木精溶液染色10分钟，然后在流动水中冲洗5分钟。接着在Ponceau S酸品红溶液中孵育10分钟，短暂冲洗蒸馏水，然后在1%磷钼酸溶液中分化5分钟。之后，将切片直接转移到苯胺蓝溶液中染色5分钟以标记胶原纤维。用0.2%乙酸快速冲洗以去除多余的苯胺蓝，然后通过分级乙醇快速脱水，在二甲苯中透明处理，并用中性封片剂封片。

统计分析：使用Prism版本8.0（GraphPad Software，美国加利福尼亚州拉霍亚）软件进行统计分析，P < 0.05被认为具有统计学意义。所有数据均以平均值±标准差表示，并使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行分析。

结果：

体外实验：S1P促进PASMC的增殖和迁移：为了研究S1P对PASMC增殖和迁移的影响，将PASMC与不同浓度的S1P（从0到3 μmol/L）孵育不同时间（12、24、48和72小时）。使用BrdU掺入法评估细胞增殖。如图1A所示，S1P在24小时内以剂量依赖的方式刺激PASMC增殖。值得注意的是，1 μmol/L的S1P与对照组相比显著增加了细胞增殖。图1B表明，1 μmol/L的S1P以时间依赖的方式促进PASMC增殖，在72小时时达到最大效果。此外，还使用Transwell测定法评估了S1P（1 μmol/L，24小时）对PASMC迁移的影响。S1P处理组的迁移细胞数量显著高于对照组[图1C]。综合这些数据表明，S1P有效促进PASMC的增殖和迁移，基于这些结果，选择了1 μmol/L的S1P进行后续细胞实验。

图1：S1P促进PASMC的增殖和迁移。（A和B）PASMC分别与不同浓度的S1P（从0到3 μmol/L）孵育24小时，或与1 μmol/L的S1P孵育不同时间（0–72小时）。细胞增殖通过BrdU测定（每组n = 4）。（C）通过Transwell测定法评估细胞迁移（不同处理后迁移到下层膜表面的细胞用结晶紫染色）。比例尺：50 μm。* P < 0.05 vs. 对照组。BrdU：5-溴-2'-脱氧尿苷；Con：对照组；PASMC：肺动脉平滑肌细胞；S1P：鞘氨醇-1-磷酸。

S1P通过激活STAT3促进配体依赖的Hh通路：为了探讨S1P诱导的PASMC增殖和迁移的分子机制，研究了Hh通路的作用。该通路在小鼠的缺氧诱导的PAH模型中起着关键作用[26]。PASMC与1 μmol/L的S1P孵育0–48小时，然后确定Shh的表达。我们的结果显示，S1P刺激显著增加了Shh的表达，且这种增强是时间依赖的[图2A]。为了确定STAT3激活是否介导S1P诱导的PASMC中Shh的上调，首先用S1P处理细胞，然后检测STAT3的磷酸化。如图2B所示，S1P诱导的STAT3磷酸化在30分钟时达到峰值。为了进一步证明STAT3是否直接参与S1P诱导的Shh上调，使用JASPAR网站（http://jaspar.genereg.net/）预测Shh启动子区域中的STAT3结合位点，发现了五个得分较高的潜在基序[图2C]。此外，在PASMC中应用了siRNA介导的STAT3敲降。图2D显示，特异性STAT3 siRNA转染显著减少了STAT3的表达，STAT3的丧失有效地逆转了S1P诱导的Shh上调[图2E]。此外，我们之前的研究已经表明S1P受体2（S1PR2）介导S1P诱导的PASMC中STAT3的激活[27]，细胞用S1PR2拮抗剂JTE013（10 μmol/L）和STAT3的生理激活剂colivelin（5 μmol/L）处理。结果显示，抑制S1PR2显著减少了S1P诱导的STAT3磷酸化和Shh的增加，但在S1P刺激和S1PR2阻断条件下，重新激活STAT3可以部分逆转Shh的下调[图2F]。

图2：STAT3介导S1P对Shh、Gli1和FoxM1的上调以及PASMC的增殖和迁移。（A）PASMC与1 μmol/L的S1P孵育不同时间（0–48小时），然后通过qRT-PCR和western blotting确定Shh的表达（每组n = 4）。（B）PASMC与1 μmol/L的S1P孵育60分钟。通过免疫印迹法确定STAT3的磷酸化（每组n = 4）。（C）通过JASPAR预测STAT3结合位点，并显示了Shh启动子区域中潜在的STAT3结合位点的示意图。（D）PASMC与STAT3特异性siRNA和非靶向对照siRNA共转染48小时。通过免疫印迹法检测STAT3的蛋白水平（n = 4）。细胞转染STAT3 siRNA 24小时后，再用S1P（1 μmol/L）刺激24小时。（E）通过qRT-PCR和western blotting检测Shh的mRNA和蛋白水平（n = 4）。（F）细胞预先用S1PR2拮抗剂JTE-013（10 μmol/L）和/或STAT3激活剂colivelin（5 μmol/L）处理1小时，然后用S1P（1 μmol/L）刺激24小时。60分钟后检测STAT3的磷酸化，24小时后通过免疫印迹法检测Shh的表达（n = 4）。（G）通过qRT-PCR和western blotting检测Gli1的mRNA和蛋白水平（n = 4）。（H）通过免疫荧光确定Gli1的亚细胞定位。（I）通过qRT-PCR和western blotting检测mRNA和FoxM1的蛋白水平（n = 4）。通过BrdU测定细胞增殖（J）和EdU测定细胞增殖（细胞用EdU [绿色，2小时脉冲] 标记，然后用DAPI [蓝色] 复染，不同处理后）。比例尺：50 μm）（K）。（L）通过Transwell测定细胞迁移（不同处理后迁移到下层膜表面的细胞用结晶紫染色。比例尺：50 μm）。细胞分别转染STAT3或对照siRNA 24小时，然后用S1P（1 μmol/L）单独刺激或同时用S1P（1 μmol/L）和Shh（0.05 μmol/L）刺激24小时。通过western blotting检测Gli1（M）和FoxM1（N）的蛋白水平（n = 4）。* P < 0.05 vs. 对照组，? P < 0.05 vs. S1P处理的细胞，? P < 0.05 vs. S1P和JTE013处理的细胞。§ P < 0.05 vs. S1P和STAT3 siRNA处理的细胞。BrdU：5-溴-2'-脱氧尿苷；Con：对照组；DAPI：4'-二氨基-2-苯基吲哚；EdU：5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；FoxM1：Forkhead box蛋白M1；Gli1：Glioma相关癌基因同源物1；Hh：Hedgehog；mRNA：信使RNA；MW：分子量；PASMC：肺动脉平滑肌细胞；p-STAT3：磷酸化信号转导子和转录激活因子3；qRT-PCR：定量逆转录聚合酶链反应；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；Shh：Sonic hedgehog；siRNA：小干扰RNA；STAT3：信号转导子和转录激活因子3；t-STAT3：总信号转导子和转录激活因子3；TSS：转录起始位点。

Gli1是Hh通路的经典下游转录因子，而FoxM1被认为是Gli1的下游靶标[20]。因此，我们还研究了S1P对Gli1和FoxM1的调节作用。结果显示，S1P刺激后Gli1的表达和核转位增加[图2G和2H]。在S1P刺激的PASMC中，FoxM1在mRNA和蛋白水平上都显著上调[图2I]。最后，沉默STAT3消除了S1P诱导的PASMC增殖和迁移[图2J–L]。同时进行了救援实验。鉴于Shh是一种分泌蛋白，在细胞外发挥作用，在S1P刺激和STAT3敲降的条件下，向PASMC提供外源性的Shh（0.05 μmol/L）。结果表明，外源性的Shh部分恢复了S1P处理PASMC中由STAT3沉默引起的Gli1和FoxM1的下调[图2M和2N]。总体而言，这些结果表明STAT3的激活介导了S1P诱导的Hh通路和PASMC的增殖。Shh介导S1P诱导的Gli1和FoxM1的上调：Shh是Hh通路的典型配体，Shh与细胞膜的结合会诱导Gli1的激活[28]。为了确定Shh是否介导S1P诱导的Gli1上调、FoxM1上调和PASMC增殖，在用S1P刺激细胞之前使用了Shh受体抑制剂cyclopamine（Cyp，5 μmol/L）[29]。如图3A和3B所示，抑制Shh显著减少了S1P诱导的Gli1上调和核转位。此外，阻断Shh受体还减弱了S1P诱导的FoxM1上调[图3C]。Cyclopamine还抑制了S1P诱导的PASMC增殖和迁移[图3D–F]。总之，Shh介导S1P诱导的Gli1激活、FoxM1上调以及PASMC的增殖和迁移。

图3：S1P上调Gli1和FoxM1的表达，并通过诱导Shh来刺激PASMC的增殖和迁移。（A）细胞先用cyclopamine（5 μmol/L）预处理2小时，然后用S1P（1 μmol/L）刺激24小时，通过qRT-PCR和western blotting确定Shm的mRNA和蛋白水平（n = 4）。（B）PASMC与1 μmol/L的S1P孵育60分钟。通过免疫印迹法确定STAT3的磷酸化（每组n = 4）。（C）通过JASPAR预测STAT3结合位点，并显示Shh启动子区域中潜在的STAT3结合位点的示意图。（D）PASMC与STAT3特异性siRNA和非靶向对照siRNA共转染48小时。通过免疫印迹法检测STAT3的蛋白水平（n = 4）。细胞转染STAT3 siRNA 24小时后，再用S1P（1 μmol/L）刺激24小时。（E）通过qRT-PCR和western blotting检测Shh的mRNA和蛋白水平（n = 4）。（F）细胞预先用S1PR2拮抗剂JTE-013（10 μmol/L）和/或STAT3激活剂colivelin（5 μmol/L）处理1小时，然后用S1P（1 μmol/L）刺激24小时。60分钟后检测STAT3的磷酸化，24小时后通过免疫印迹法检测Shh的表达（n = 4）。（G）通过qRT-PCR和western blotting检测Gli1的mRNA和蛋白水平（n = 4）。（H）通过免疫荧光确定Gli1的亚细胞定位。（I）通过qRT-PCR和western blotting检测mRNA和FoxM1的蛋白水平（n = 4）。通过BrdU测定细胞增殖（J）和EdU测定细胞增殖（细胞用EdU [绿色，2小时脉冲] 标记，不同处理后用DAPI [蓝色] 复染）。比例尺：50 μm）（K）。（L）通过Transwell测定细胞迁移（不同处理后迁移到下层膜表面的细胞用结晶紫染色。比例尺：50 μm）。细胞分别转染STAT3或对照siRNA 24小时，然后用S1P（1 μmol/L）单独刺激或同时用S1P（1 μmol/L）和Shh（0.05 μmol/L）刺激24小时。通过western blotting检测Gli1（M）和FoxM1（N）的蛋白水平（n = 4）。* P < 0.05 vs. 对照组，? P < 0.05 vs. S1P处理的细胞，? P < 0.05 vs. S1P和JTE013处理的细胞。§ P < 0.05 vs. S1P和STAT3 siRNA处理的细胞。BrdU：5-溴-2'-脱氧尿苷；Con：对照组；DAPI：4'-二氨基-2-苯基吲哚；EdU：5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；FoxM1：Forkhead box蛋白M1；Gli1：Glioma相关癌基因同源物1；Hh：Hedgehog；mRNA：信使RNA；MW：分子量；PASMC：肺动脉平滑肌细胞；p-STAT3：磷酸化信号转导子和转录激活因子3；qRT-PCR：定量逆转录聚合酶链反应；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；Shh：Sonic hedgehog；siRNA：小干扰RNA；STAT3：信号转导子和转录激活因子3；t-STAT3：总信号转导子和转录激活因子3；TSS：转录起始位点。细胞增殖通过BrdU测定（D）和EdU测定来确定（细胞被EdU标记[绿色，2小时脉冲]，在不同处理后用DAPI[蓝色]复染）。刻度尺：50 μm，E）。(F) 细胞迁移通过transwell测定来测量（迁移到下层膜表面的细胞在不同处理后被结晶紫染色。刻度尺：50 μm）。* P <0.05 vs. 对照组，? P <0.05 vs. S1P处理的细胞。BrdU：5-溴-2'-脱氧尿苷；Con：对照组；Cyp：环巴胺；DAPI：4',6-二氨基-2-苯基吲哚；EdU：5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；FoxM1：Foxhead box蛋白M1；Gli1：胶质瘤相关致癌基因同源物1；mRNA：信使RNA；MW：分子量；qRT-PCR：定量逆转录聚合酶链反应；S1P：鞘氨醇-1-磷酸。Gli1与S1P诱导的FoxM1上调有关。研究表明，转录因子Gli1结合到FoxM1启动子上，并通过萤光素酶报告基因测定和染色质免疫沉淀（ChIP）在多种细胞类型中增强其转录活性。[30,31] 为了进一步研究Gli1是否介导S1P诱导的FoxM1上调，使用siRNA敲低了Gli1。如图4A和4B所示，转染PASMCs的Gli1 siRNA显著降低了其表达，Gli1的缺失减弱了S1P诱导的FoxM1上调。同时，Gli1的敲低显著抑制了S1P诱导的PASMCs增殖和迁移[图4C–E]。这些发现表明Gli1介导了S1P诱导的FoxM1上调。

图4：Gli1介导S1P诱导的FoxM1上调以及PASMCs增殖和迁移。(A) PASMCs被转染Gli1序列特异性siRNA和非靶向对照siRNA 48小时。通过免疫印迹检测Gli1的蛋白水平（n = 4）。细胞被Gli1 siRNA转染24小时后，再接受S1P（1 μmol/L）刺激24小时。(B) 通过qRT-PCR和Western blot检测FoxM1的mRNA和蛋白水平（n = 4）。细胞增殖通过BrdU测定（C）和EdU测定来确定（细胞被EdU标记[绿色，2小时脉冲]，在不同处理后用DAPI[蓝色]复染）。刻度尺：50 μm）(D)。(E) 细胞迁移通过transwell测定来测量（迁移到下层膜表面的细胞在不同处理后被结晶紫染色。刻度尺：50 μm）。* P <0.05 vs. 对照组，? P <0.05 vs. S1P处理的细胞。BrdU：5-溴-2'-脱氧尿苷；Con：对照组；DAPI：4',6-二氨基-2-苯基吲哚；EdU：5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；FoxM1：Foxhead box蛋白M1；Gli1：胶质瘤相关致癌基因同源物1；MW：分子量；PASMC：肺动脉平滑肌细胞；qRT-PCR：定量逆转录聚合酶链反应；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；siRNA：小干扰RNA。FoxM1参与S1P诱导的PASMCs增殖和迁移。为了确定FoxM1是否介导S1P诱导的PASMCs增殖和迁移，细胞首先被转染FoxM1特异性siRNA，然后接受S1P刺激。结果表明，FOXM1的敲低显著抑制了S1P触发的PASMCs增殖和迁移[图5A–D]。此外，先前的研究还发现，FoxM1的过表达增强了小鼠缺氧诱导的肺动脉壁重塑和右心室肥大。[32]

图5：S1P通过诱导FoxM1触发PASMCs增殖和迁移。(A) PASMCs被转染FoxM1序列特异性siRNA和非靶向对照siRNA 48小时。通过免疫印迹检测FoxM1的蛋白水平（n = 4）。对于(B)、(C)和(D)，细胞要么不进行处理，要么单独接受S1P处理，或者先转染对照或FoxM1 siRNA 24小时，然后接受S1P（1 μmol/L）刺激24小时。细胞增殖通过BrdU测定（B）和EdU测定来确定（细胞被EdU标记[绿色，2小时脉冲]，在不同处理后用DAPI[蓝色]复染）。刻度尺：50 μm）(C)。(D) 细胞迁移通过transwell测定来测量（迁移到下层膜表面的细胞在不同处理后被结晶紫染色。刻度尺：50 μm）。* P <0.05 vs. 对照组，? P <0.05 vs. S1P处理的细胞。BrdU：5-溴-2'-脱氧尿苷；Con：对照组；DAPI：4',6-二氨基-2-苯基吲哚；EdU：5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；FoxM1：Foxhead box蛋白M1；MW：分子量；PASMC：肺动脉平滑肌细胞；qRT-PCR：定量逆转录聚合酶链反应；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；siRNA：小干扰RNA。总体而言，这些发现表明S1P导致STAT3激活，进而导致Shh上调，进一步导致Gli1激活和FoxM1过表达，最终引起PASMCs增殖和迁移。

在体内，SphK1/S1P/STAT3/Shh/Gli1/FoxM1轴参与了MCT诱导的PAH（肺动脉高压）。如图6A所示，与对照组相比，MCT诱导的PAH大鼠模型中肺组织和血清中的S1P水平升高。SphK1是产生S1P的关键酶，并已被认为与PAH有关。[10] 为了确认SphK1/S1P/STAT3/Shh/Gli1/FoxM1轴在MCT诱导的PAH大鼠模型中的作用，分析了这一级联反应中每个组分的表达和激活。我们进一步发现，MCT-PAH大鼠的肺组织中SphK1、STAT3磷酸化、Shh、Gli1和FoxM1的水平也显著升高[图6B]。

图6：靶向SphK1/S1P/STAT3/Shh/Gli1/FoxM1轴可以缓解肺动脉重塑和MCT诱导的PAH在大鼠中的发展。SD大鼠被随机分为六组：对照组（Con，n = 10），MCT处理组（注射MCT，n = 10），MCT和PF543处理组（PF543 + MCT，n = 10），MCT和NSC74859组（NSC74859 + MCT，n = 10），MCT和环巴胺组（环巴胺 + MCT，n = 10），MCT和DMSO组（DMSO + MCT，n = 10）。MCT（60 mg/kg）在第1天皮下注射给大鼠。PF543（0.7 mg/kg）、NSC74859（5 mg/kg）、环巴胺（10 mg/kg）和DMSO（10%）连续给药28天。(A) 使用ELISA测量血清和肺组织中的S1P浓度。(B) 通过Western blot检测大鼠肺组织中的SphK1、p/t-STAT3、Shh、Gli1和FoxM1蛋白水平。(C) 每组RVSP的代表性追踪。(D) 每组RVHI的变化。(E) 小肺血管的HE染色和肺动脉中膜壁厚度的定量分析。刻度尺：50 μm。(F) 通过免疫染色α-SMA评估肺动脉的肌化程度，代表性图像显示了不同实验组肺动脉横截面中的α-SMA（棕色）和DAPI（蓝色）染色。刻度尺：50 μm。(G) ki67（用Cy3染色，红色）和α-SMA（用Alexa Fluor 488染色，绿色）以及细胞核（用DAPI染色，蓝色）的共染色显示了PASMCs增殖和动脉重塑。刻度尺：50 μm。(H) 不同组中胶原蛋白的Masson染色，胶原纤维呈现蓝色，平滑肌细胞和细胞质（主要在肌层中）呈现红色，细胞核呈现深蓝色。刻度尺：50 μm * P <0.05 vs. 对照组，? P <0.05 vs. MCT处理组。α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白；Con：对照组；Cy3：Cy3；DAPI：4',6-二氨基-2-苯基吲哚；DMSO：二甲基亚砜；ELISA：酶联免疫吸附测定；FoxM1：Foxhead box蛋白M1；Gli1：胶质瘤相关致癌基因同源物1；HE：苏木精和伊红；LV：左心室；MCT：单克罗汀；MW：分子量；p-STAT3：磷酸化信号转导激活因子3；RV：右心室；RVHI：右心室肥大指数；RVSP：右心室收缩压；S：隔膜；Shh：Sonic hedgehog；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；SphK1：鞘氨醇激酶1；STAT3：信号转导激活因子3。

通过PF543抑制SphK1可以预防MCT诱导的PAH在大鼠中的发生。我们证明，抑制SphK1可以降低MCT诱导的PAH大鼠中的RVSP升高[图6C]。此外，肺动脉重塑得到缓解，表现为右心室肥大减轻，肺动脉小动脉壁厚度降低，肌化的动脉减少[图6D–G]。我们进一步发现，抑制SphK1还可以改善PAH大鼠模型中的胶原蛋白沉积[图6H]。此外，PF543的给药显著降低了PAH大鼠模型中S1P、p-STAT3、Shh、Gli1和FoxM1的蛋白水平[图7A和7B]。这些结果表明，抑制SphK1可以减少S1P的产生，抑制STAT3和Hh通路的激活，并改善MCT处理大鼠的肺动脉重塑和PAH的发展。

图7：抑制SphK1、STAT3和Hh通路可以抑制MCT诱导的大鼠PAH模型中相关蛋白的表达。(A) MCT组：大鼠在第一天接受60 mg/kg MCT的单一腹腔注射。MCT+PF543组：大鼠在第一天MCT注射后连续4周每天接受SphK1抑制剂PF543的腹腔注射。通过ELISA测量血清和肺组织中的S1P浓度。(B) MCT组：大鼠在第一天接受60 mg/kg MCT的单一腹腔注射。MCT+PF543组：大鼠在第一天MCT注射后连续4周每天接受SphK1抑制剂PF543的腹腔注射。通过Western blot检测肺组织中的p/t-STAT3、Shh、Gli1和FoxM1蛋白水平。(C) MCT组：大鼠在第一天接受60 mg/kg MCT的单一腹腔注射。MCT+DMSO组：大鼠在第一天MCT注射后连续4周每天接受10% DMSO的腹腔注射。MCT+PF543组：大鼠在第一天MCT注射后连续4周每天接受SphK1抑制剂PF543的腹腔注射。通过免疫印迹检测肺组织中的Shh、Gli1和FoxM1蛋白水平。(D) MCT组：大鼠在第一天接受60 mg/kg MCT的单一腹腔注射。MCT+cyclopamine组：大鼠在第一天MCT注射后连续4周每天接受SMO抑制剂环巴胺的腹腔注射。不同组中Gli1和FoxM1蛋白水平的代表性Western blot及其定量分析。* P <0.05 vs. 对照组，? P <0.05 vs. MCT处理组。Con：对照组；DMSO：二甲基亚砜；FoxM1：Foxhead box蛋白M1；Gli1：胶质瘤相关致癌基因同源物1；MCT：单克罗汀；MW：分子量；p-STAT3：磷酸化信号转导激活因子3；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；SphK1：鞘氨醇激酶1；t-STAT3：总信号转导激活因子3。

位于S1P下游的STAT3介导了MCT处理大鼠的PAH发展。为了研究S1P诱导的STAT3激活是否促进MCT诱导的PAH大鼠的发展，我们在PAH模型中应用了特定的STAT3抑制剂NSC74859。抑制STAT3显著降低了RVSP升高、右心室肥大、肺动脉小动脉壁厚度、肌化的动脉、PASMCs增殖和胶原沉积[图6D–H]。此外，抑制STAT3导致PAH大鼠模型中Shh、Gli1和FoxM1的表达显著下调[图7C]。这些结果表明，S1P诱导的STAT3激活与MCT处理大鼠中的Hh通路激活和肺动脉重塑有关。为了确定Hh信号是否位于PAH发展中的STAT3下游，应用了Shh受体抑制剂环巴胺。抑制Hh通路降低了RVSP，减轻了右心室肥大、肺动脉小动脉壁厚度、肌化的动脉、PASMCs增殖和胶原沉积[图6D–H]。同时，环巴胺也显著阻断了MCT诱导的PAH大鼠模型中Gli1和FoxM1的上调[图7D]。这些结果表明，Hh信号在调节Gli1和FoxM1表达方面在MCT诱导的PAH大鼠的发展中起重要作用。

讨论：在本研究中，我们证明了S1P通过激活STAT3上调Shh表达，从而导致Gli1上调和核转移。Gli1的激活增加了FoxM1表达，最终导致PASMCs增殖、迁移和肺动脉重塑[图8]。图8：S1P诱导大鼠PASMCs增殖/迁移和肺动脉重塑的分子机制。S1P通过激活STAT3上调Hh通路配体Shh的表达，导致Gli1上调和核转移。Gli1的激活增加了FoxM1表达，从而导致PASMCs增殖/迁移和肺动脉重塑。FoxM1：Foxhead box M1；Gli1：胶质瘤相关致癌基因同源物1；Hh：Hedgehog；Hh R：Hedgehog受体；PASMC：肺动脉平滑肌细胞；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；S1PR：鞘氨醇-1-磷酸受体；Shh：Sonic hedgehog；STAT3：信号转导激活因子3。S1P是一种重要的鞘脂代谢物，调节多种病理生理过程，包括细胞增殖和迁移、细胞因子产生和血管生成。[33–35] 此外，观察到S1P促进PASMCs增殖，这有助于PAH的发展。与这些研究一致，我们观察到S1P在体外刺激了PASMCs的增殖和迁移。此外，我们的体内实验进一步表明，Sphk1/S1P轴被激活并在MCT诱导的PAH大鼠模型中参与肺动脉重塑。STAT家族与多种细胞增殖和抗凋亡有关。在相关细胞中，STAT3在心血管疾病中起着重要作用[36,37]。先前的研究表明，STAT3在响应炎症细胞因子和生长因子时会被激活（在Y705位点磷酸化并转运至细胞核），这与肺动脉高压（PAH）的发病机制密切相关[38,39]。在本研究中，我们发现S1P显著增强了STAT3的磷酸化，导致肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的增殖；同时，S1P水平的升高与p-STAT3的表达增加及随后的PASMCs增殖和肺动脉重构有关。Hh信号通路参与胚胎发育过程中的多种生理过程，其异常激活可引发癌症[19,40]。Hh通路的主要配体Shh与跨膜受体PTCH1结合，解除对Smo的抑制作用。被解除抑制的Smo会激活Gli家族成员，这些成员随后转运至细胞核并启动相关目标基因的转录[41,42]。在静息状态下，Gli1的表达极其微弱，其表达上调及向细胞核的转运被视为Hh通路激活的重要标志[30]。已有研究证实，在STAT3过度表达的小鼠肺部，Shh的表达水平显著升高[24,28]。在本研究中，我们发现S1P通过激活STAT3来上调Shh的表达，进而促进Gli1的表达及其向细胞核的转运，从而引发PASMCs的增殖和迁移。进一步验证显示，类似的机制也参与了MCT诱导的PAH大鼠中PASMCs的增殖和肺动脉重构过程。

Forkhead转录因子家族中的FoxM1主要在高度增殖和永生化细胞中表达，在非增殖及分化细胞中的表达量较低[43,44]。研究表明，FoxM1能够促进细胞增殖、迁移、血管生成以及上皮-间质转化[45–47]。临床实验表明，Gli1可在人类（Hela、293T、HT1080）和小鼠（C3H10T1/2）细胞中上调FoxM1的表达[31]。我们的研究发现，S1P处理过的PASMCs以及MCT诱导的PAH大鼠中，Gli1的表达上调和激活促进了FoxM1的表达升高。尽管取得了这些成果，本研究仍存在一些局限性：一方面，我们使用的是大鼠PASMCs和MCT诱导的PAH大鼠模型来探讨S1P/STAT3/Shh/Gli1/FoxM1信号通路在PASMC增殖、迁移和肺动脉重构中的作用；另一方面，需要进一步研究以确认该通路是否也在人类PAH患者的PASMC增殖和血管重构中发挥作用。此外，虽然通过药物干预研究了各分子在PAH中PASMC增殖和肺动脉重构中的作用，但在转基因动物模型中验证这些机制将提供更为确凿的证据。总之，我们的数据表明，S1P通过依次激活STAT3/Shh/Gli1/FoxM1通路，在培养的PASMCs及MCT诱导的PAH大鼠中促进PASMC的增殖、迁移和肺动脉重构。针对这一通路进行干预能有效抑制PAH大鼠模型中的PASMC增殖和肺动脉重构，显示出其在PAH治疗中的潜在价值。

**致谢**
感谢西安交通大学第一附属医院转化医学中心提供的实验场所和仪器支持。

**资助**
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：81970050、81670051、81800052）及陕西省自然科学基础研究计划（项目编号：2023-JC-QN-0894）的资助。

**利益冲突**
无。