开发了一种基于 sense-antisense 结构和双最小沟槽结合特性的探针 PCR 方法，用于血浆样本中大肠癌的早期检测

《Chinese Medical Journal》：Development of a sense-antisense and dual-minor groove binder probe PCR assay in plasma for early detection of colorectal cancer

　　致编辑：自从Cologuard[1]问世以来，该技术能够检测粪便DNA中的血红蛋白、KRAS突变以及两个基因的甲基化，基于粪便DNA甲基化的结直肠癌（CRC）筛查方法受到了越来越多的关注。与基于粪便的检测方法相比，基于无细胞DNA（cfDNA）甲基化的检测方法可能更容易被接受，并且更适合临床应用，尽管目前这些方法的普及程度仍然较低。Septin9代表了一种有前景的初步方法；然而，由于早期敏感性不足的局限，美国胃肠病学会（ACG）的指南目前已不再推荐使用该方法[2]。血液甲基化检测的发展受到几个重大挑战的阻碍，包括cfDNA浓度低、组织可追溯性问题以及白细胞干扰等。解决这些问题的一个潜在方法是寻找更有前景的标志物，这些标志物很可能是全新的目标，因为癌症信号在这些样本类型中的存在机制不同。此外，开发能够检测微量cfDNA的敏感检测技术对于这些检测方法的成功至关重要。在这项研究中，我们通过17个公共的450K/850K微阵列数据集[补充表1，https://links.lww.com/CM9/C390]分三个步骤鉴定了早期CRC的甲基化标志物。这17个数据集包括组织样本、健康全血细胞（WBCs）和血浆cfDNA。第一步是从14个基因表达组（GEO）数据集中识别差异甲基化的CpG（DMC）位点，这些数据集包含CRC、腺瘤和正常邻近组织（NAT）样本。第二步通过应用来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库的31种不同类型的癌症样本，进一步筛选第一步中发现的DMC。第三步使用这三个数据集来验证所识别的候选标志物[图1A]。在第一步中，共有2238个DMC在癌症与正常组织以及腺瘤与正常组织的比较中被识别出来[图1A和补充图1A，https://links.lww.com/CM9/C390]。在这些基因中，有75个在TCGA的30例非CRC病例中被发现是低甲基化的[图1A和补充图1B，https://links.lww.com/CM9/C390]。随后，通过应用LASSO回归将数量减少到8个[图1A和补充图1C，https://links.lww.com/CM9/C390]。其中两个基因，cg14015706和cg08247376，分别位于NTMT1的第一个外显子和MAP3K14-AS1转录起始位点上游200个碱基对处，被确定为适合设计引物/探针的候选基因。此外，这两个探针在所有三个公共验证数据集中都显示出高甲基化[补充图1D–F，https://links.lww.com/CM9/C390]，因此被认定为潜在的候选标志物。

图1：本研究的工作流程和发现。(A) 通过应用指定的筛选标准从17个公共数据库中识别潜在DMC的过程。左列显示了每个筛选步骤中使用的数据集，中间列展示了每个筛选步骤中应用的筛选条件，右列显示了被筛选出的候选DMC的数量。(B) SADMP技术的示意图。对于NTMT1基因，根据正义和反义BS DNA序列以及CBS DNA设计了两个引物对及其相应的MGB探针。对于MAP3K14-AS1基因，根据反义BS DNA和CBS DNA设计了一对引物和两个MGB探针。(C) 使用血浆训练集中的CRC + AA组与对照组，展示了NTMT1和MAP3K14-AS1的ROC曲线。(D) 在训练集、验证集和整个数据集中单独检测以及联合检测NTMT1和MAP3K14-AS1时的敏感性和特异性，以及敏感性和特异性的95%置信区间。(E) 分别单独检测和联合检测时，NTMT1和MAP3K14-AS1在非-AA和AA病例中的甲基化敏感性。(F) 在不同CRC阶段单独检测和联合检测时，NTMT1和MAP3K14-AS1的甲基化敏感性。(G) 单独检测和联合检测时，NTMT1和MAP3K14-AS1在健康样本、NDD样本、ID样本和息肉样本中的甲基化特异性。(E–G)中的误差条代表95%置信区间。AA：晚期腺瘤；BS：亚硫酸盐转化；CBS：正义/反义BS的互补序列；CRC：结直肠癌；DMC：差异甲基化CpG；FDR：假发现率；ID：肠道疾病；LASSO：最小绝对收缩和选择算子；MGB：小沟结合蛋白；NATs：正常邻近组织；NDD：非消化系统疾病；non-AA：非晚期腺瘤；ROC：接收者操作特征；SADMP：正义-反义和双MGB探针。

为了确定这两个候选标志物的临床相关性，我们在郑州大学第一附属医院获得的60个组织样本和709个血浆样本中分析了它们的甲基化状态。本研究遵循了机构审查委员会（IRB）制定的伦理标准，并得到了郑州大学第一附属医院IRB的批准（编号2022-KY-0631-002）。每位参与者都签署了知情同意书。本研究是“血浆中泛癌症DNA甲基化检测的临床研究”（临床试验，编号NCT05685524）的一个子项目。在亚硫酸盐处理后，对NTMT1和MAP3K14-AS1的目标区域进行了Sanger测序，以确认30个CRC组织样本和30个NAT样本中的甲基化状态。所用引物的序列见补充表2，https://links.lww.com/CM9/C390。研究发现，与NAT样本相比，CRC样本中的CpG位点甲基化频率更高[补充图2，https://links.lww.com/CM9/C390]。为了提高候选标志物识别血浆中低丰度cfDNA甲基化信号的能力，我们尝试实施了双链和双小沟结合蛋白（MGB）探针的聚合酶链反应（PCR）方法，我们将其称为正义-反义和双MGB探针（SADMP）技术。对于NTMT1基因，使用了两组引物和探针来同时扩增扩增子区域的正义链和反义链（经过亚硫酸盐转化后）。对于MAP3K14-AS1，使用了一对引物和两个探针来扩增扩增子区域的反义链[图1B]。标准曲线显示，这两种基因的扩增效率分别为98%和110%[补充图3A，D，https://links.lww.com/CM9/C390]，这被认为是令人满意的（在95–110%的范围内）。正如理论预期，SADMP技术使得这两种基因的循环阈值（Ct）值比单链扩增或使用单个探针时提高了一个循环[补充图3B，E，https://links.lww.com/CM9/C390]。此外，SADMP检测对NTMT1和MAP3K14-AS1具有高度敏感性。当没有甲基化DNA存在且存在大量未甲基化DNA（107拷贝/μL）时，未观察到扩增曲线。此外，它们可以在10拷贝/μL和5拷贝/μL的浓度下稳定检测到甲基化DNA[补充图3C，F，https://links.lww.com/CM9/C390]。随后，通过SADMP方法在709名参与者的2毫升血浆中验证了这两个生物标志物。两毫升的血浆cfDNA经过亚硫酸盐转化后，用于甲基化特异性PCR（MSP）。MSP引物和探针的位置和序列见补充表3，https://links.lww.com/CM9/C390，以供参考。PCR溶液的组成见补充表4，https://links.lww.com/CM9/C390。血浆样本来自CRC患者、晚期腺瘤（AA）患者、非晚期腺瘤（non-AA）患者、息肉患者、肠道疾病（ID）患者、非消化系统疾病（NDD）患者和健康受试者。709名受试者的 demographic 和临床病理数据见补充表5，https://links.lww.com/CM9/C390。整个数据集被随机分为训练集和验证集，比例为2:1。最初，使用接收者操作特征（ROC）曲线分析来确定这两个基因的Ct值临界值，将CRC和AA样本视为阳性样本，其余样本视为阴性样本[图1C]。NTMT1和MAP3K14-AS1基因的临界值分别确定为48.2和48.4。当这两个基因联合检测时，如果其中一个基因或两个基因均为阳性，则认为样本具有甲基化。根据上述解读标准，训练集、验证集和整个数据集中的双靶点甲基化检测的敏感性分别为86.4%、81.8%和84.8%，明显高于单一靶点检测的敏感性[图1D]。特异性分别为91.0%（NTMT1）、92.5%（MAP3K14-AS1）和91.5%（双靶点）。在不同年龄、性别、位置和病理类型的CRC患者中，总体敏感性没有显著差异[补充表6，https://links.lww.com/CM9/C390]。双靶点检测在检测早期肿瘤方面表现出有效性，对于AA、I期CRC和II期CRC的敏感性分别为32.0%、75.0%和81.2%[图1E，F]。对120个CRC样本进行了NTMT1/MAP3K14-AS1和Septin9甲基化检测的头部对比研究。结果表明，NTMT1/MAP3K14-AS1的敏感性显著高于Septin9（85.8% vs 61.7%）[补充表6，https://links.lww.com/CM9/C390]。双靶点检测在健康样本中显示出最高的特异性（95.9%），在不同亚组（包括健康个体、NDD样本、ID样本和息肉样本）中表现出一致的性能[图1G]。这表明该检测方法能够抵抗各种良性条件的干扰。先前的研究者已经报道过C9orf50[3]和MAP3K14-AS1[4]在CRC诊断和筛查中的应用。在本研究中，我们发现当它们联合检测时，敏感性显著提高，超过了传统的Septin9检测方法。预计血浆NTMT1/MAP3K14-AS1双靶点甲基化检测将成为一种新的非侵入性CRC筛查工具。

**资助**：本研究得到了河南省科技项目（编号232102310028）的支持。

**利益冲突**：无。