基于组织病理学图像的深度学习方法用于葡萄膜黑色素瘤的风险分层

《Chinese Medical Journal》：Histopathological images-based deep-learning for risk stratification of uveal melanoma

　　致编辑：葡萄膜黑色素瘤（UVM）是一种罕见的但恶性程度很高的癌症，起源于眼睛的血管层——葡萄膜，包括虹膜、睫状体和脉络膜。[1,2]尽管UVM的发病率低于其他类型的黑色素瘤，但由于其容易发生转移，因此死亡率较高。[3]肝脏是UVM最常见的转移部位，一旦癌症扩散到肝脏，由于治疗选择有限，预后会显著恶化。[4]早期发现以及对UVM及其转移模式的深入理解对于改善患者预后至关重要。[5]为应对这些挑战，我们开发了一个全面的深度学习网络，用于诊断UVM患者的组织学类型并预测肝转移。此外，我们还创建了一个深度学习的Cox模型进行风险分类，进行了生物信息学分析以探索亚型的生物学特征，并构建了一个在多个队列中得到验证的预后基因签名。进一步地，通过整合临床和分子变量，开发了一个列线图模型[图1]。图1：当前研究的整体流程图。(A) 构建集成深度学习网络的详细工作流程。(B) 生物信息学分析和实验验证的流程图。AUC：曲线下面积；CV：交叉验证；DGE：差异基因表达；DL：深度学习；LASSO：最小绝对收缩选择算子；KM：Kaplan–Meier；RF：随机森林；WSIs：全切片图像。

在这项研究中，我们分析了来自癌症基因组图谱葡萄膜黑色素瘤（TCGA-UVM）的80张全切片图像（WSIs）以及来自中国成都华西医院的68名UVM患者的验证队列（HX-UVM）的图像。这些接受根治性眼球摘除术的UVM患者的WSIs是在他们的同意和书面知情同意下获得的。华西医院伦理委员会批准了这项研究（编号20242000），该研究遵守了《赫尔辛基宣言》的原则。WSIs作为研究UVM患者组织学类型和肝转移的基础。此外，我们还获得了来自五个开放获取的UVM队列（E-MTAB-4097、GSE22138、GSE27831、GSE44295和GSE84976）的RNA测序（RNA-seq）数据和临床特征。TCGA-UVM队列被随机分为训练数据集（70%）和测试数据集（30%）。训练集用于开发模型和微调超参数，而测试集和HX-UVM数据集用于评估模型的预测性能。使用了数据归一化和增强技术，如水平翻转、垂直翻转和随机旋转，以提高训练数据的多样性和质量。在弱监督下，使用组织学类型作为监督信息，训练了一个ResNet50模型，训练周期为20个周期，采用随机梯度下降（SGD）优化器，学习率为10^-2，并进行了L2正则化。ResNet50架构中的分类器为图像块分配标签，生成了整个WSI的概率预测热图。这些概率块创建了一个表示整个WSI上概率分布的热图，并通过分析块概率分数的直方图来估计深度学习（DL）特征。首先使用Wilcoxon检验或Kruskal–Wallis检验识别差异表达的DL特征。接着应用Lasso回归或随机森林模型来精简和去除冗余的DL特征。最后，使用选定的特征子集训练了10个传统的机器学习模型，并通过10折交叉验证进行了评估，以构建一个稳健的预测深度学习网络，用于诊断组织学类型和基于DL特征预测肝转移病例。详细的方法和统计分析见补充材料，https://links.lww.com/CM9/C538。使用TCGA-UVM数据集和HX-UVM队列，严格验证了该组织学分类器在诊断UVM患者组织学类型（上皮样型、混合型和梭形型）方面的性能。在块级别，使用多种指标和可视化方法评估了分类器的性能。接收者操作特征曲线（ROC）和精确度-召回率曲线（PRC）显示，对于上皮样型、混合型和梭形型的诊断，曲线下面积（AUC）分别为1.000、0.984和0.986。评估扩展到了测试数据集和HX-UVM队列，在测试数据集中，分类器的宏AUC分别为0.989和0.984。在HX-UVM队列中，模型的宏AUC分别为0.992和0.983[补充图1，https://links.lww.com/CM9/C538]。通过整合多个可能的块，在WSI级别创建了一个综合热图。使用梯度加权类激活映射（Grad-CAM）来可视化深度学习模型最终卷积层的热图。叠加在原始图像上的热图突出了模型关注的区域[补充图2，https://links.lww.com/CM9/C538]。然后使用块概率的直方图来评估整个切片，提取了101个DL特征。通过Kruskal–Wallis检验和假发现率（FDR）调整，选出了61个DL特征进行进一步分析。利用Gini重要性选择的顶级10个特征，在10个机器学习算法中进行了验证，并通过10折交叉验证进行了验证。XGBoost、AdaBoost、GradientBoosting和NaiveBayes分类器取得了最高的准确率。XGBoost模型在训练数据集、测试数据集和HX-UVM数据集中都能准确区分组织学类型[补充图3，https://links.lww.com/CM9/C538]。UVM的主要死因是远端肝转移，这与组织病理学亚型密切相关。使用DL特征构建了一个肝转移预测模型。Wilcoxon检验和FDR调整选择了57个在UVM肝转移患者中差异表达的DL特征。Lasso回归进一步降低了维度，识别出六个显著的候选变量。这些特征使用10个机器学习算法进行了验证，其中Extra-Trees分类器被选用于肝转移预测。在训练数据集、测试数据集和HX-UVM数据集中，ROC和PRC分别为0.962和0.939、0.826和0.860、0.860和0.288[补充图4，https://links.lww.com/CM9/C538]。使用与肝转移相关的六个DL特征开发了一个DL Cox风险模型。TCGA-UVM队列中的风险热图显示了风险评分、生存状态和DL特征评分的分布。根据最佳截断值，患者被分为高风险和低风险亚型。生存分析显示高风险患者的生存率较差。ROC曲线在1年、3年和5年时间点的AUC值分别为0.589、0.679和0.686。在HX-UVM队列中，患者同样被分层，生存曲线表明高风险个体的预后更差。基因集变异分析（GSVA）评估了50个癌症标志通路中的差异表达模式。十二个通路在两种亚型之间显示出差异表达。卡方检验显示临床参数（如生存状态、转移、染色体3状态和分期）在亚型之间存在显著差异。探讨了免疫特征，生成了22种免疫细胞、免疫相关特征和免疫检查点基因的全面热图。Wilcoxon检验表明，仅分化簇（CD）4记忆活化T细胞和NK静息细胞存在差异表达。“maftools”软件包突出了亚型特异性的突变模式，包括显著的突变基因如GNAQ、GNA11和SF3B1。在特征2（载脂蛋白B编辑催化多肽样突变[APOBEC]介导的活性）、APOBEC特征和微卫星不稳定性（MSI）中也观察到了显著差异[补充图5，https://links.lww.com/CM9/C538]。接下来，使用连通性图（CMap）预测UVM的潜在药物治疗方案。使用CMap数据库分析了150个上调基因和150个下调基因的基因表达谱。这项分析确定了五种潜在药物的最高评分：巯嘌呤、花生四烯三氟甲烷、STOCK1N.35696、exisulind和他克莫司。然后开发了一个基因风险签名，以指导UVM的预后和治疗策略。TCGA-UVM队列被用作训练集，其他数据集也进行了额外验证。使用DL签名将患者分为高风险和低风险亚组。差异表达分析识别出29个差异表达基因（DEGs），其中10个基因与生存显著相关。通过Lasso惩罚选择，确定了九个具有强大预测能力的基因。六基因签名（CCND3、ENTPD6、IL17RC、KCNK2和SEMA3C）获得了最高的AUC值0.832，显示出其预后潜力。在独立队列中的验证结果一致。元分析确认了该基因签名是影响UVM生存的重要风险因素，风险比为3.58[补充图6，https://links.lww.com/CM9/C538]。进一步在Mel270（原发性）和Omm2.3（转移性）细胞系中检查了这六个基因签名的相对表达，发现显著差异（引物序列列在补充表1中，https://links.lww.com/CM9/C538）。此外，6-巯嘌呤和花生四烯三氟甲烷（AACOCF3）被发现可以抑制UVM细胞系的增殖。伤口愈合力测定显示Mel270和Omm2.3细胞侵袭受到显著抑制。Transwell侵袭实验证实AACOCF3治疗显著减少了细胞侵袭[补充图7，https://links.lww.com/CM9/C538]。开发了一个准确的列线图模型来预测UVM的预后。单变量Cox分析显示DL签名、基因签名、年龄、组织学类型、分期、染色体3状态和转移与总生存（OS）之间存在显著关联。同时，多变量Cox分析确定了年龄、分期和转移为显著因素。结合这些变量构建了一个全面的列线图模型，估计了五年生存概率。研究人群被分为三个风险组，生存曲线显示出出色的区分能力。时间依赖的ROC曲线显示一年、三年和五年的预测AUC值分别高于0.890。校准曲线显示预测结果与观察结果之间有很好的一致性，决策曲线分析表明与分期和转移相比有更高的净效益[补充图8，https://links.lww.com/CM9/C538]。通过这些分析，成功构建了一个全面的深度学习网络和基因签名模型，用于诊断UVM的组织学类型并预测肝转移。实验性药物疗效研究进一步验证了这些模型。总之，将深度学习模型应用于分析苏木精和伊红（H&E）染色的组织病理学图像，在提高UVM患者的诊断、预后和治疗方面显示出巨大潜力。这些模型使临床医生能够做出更明智的决策，制定个性化治疗策略，最终改善患者预后。预计基于深度学习的组织病理学分析的持续研究和进展将推动精准医学和患者护理的发展。

**资助**：本工作得到了四川省科学技术厅（编号2024NSFSC1720）和成都市科学技术局重点研发支持计划（编号2023-YF09-00041-SN）的支持。

**利益冲突**：无。