通过单细胞测序技术研究瘢痕组织中血管内皮细胞分化的分子亚型

《Chinese Medical Journal》：Molecular subtypes of vascular endothelial cell differentiation in keloid by single-cell sequencing

　　致编辑：瘢痕疙瘩是一种纤维增生性疾病，其特征是组织向伤口边缘以外的区域侵入性生长，导致显著的生理和心理社会健康问题。持续性的炎症以及活化成纤维细胞和肌成纤维细胞产生的异常细胞外基质沉积是瘢痕疙瘩发病机制的核心。越来越多的证据表明，血管内皮细胞（ECs）在疾病进展中起着关键作用[1]。瘢痕疙瘩中病理性血管生成的特征包括微血管结构紊乱、管腔变平以及功能受损，尽管血流量较高，但这些因素却会引发局部缺氧。这种功能障碍的血管系统增加了血管通透性，促进了炎症细胞和介质在血管周围的积聚，从而加剧了炎症和纤维化过程。值得注意的是，内皮功能障碍（如高血压中所观察到的）与瘢痕疙瘩易感性增加之间的临床关联，突显了内皮细胞在疾病易感性中的核心作用。这些发现表明，血管内皮细胞不仅是促进纤维化微环境的因素，而且可能是诊断和预后评估的潜在指标。因此，评估内皮功能对于预测风险、进行分子分类以及开发精准治疗手段具有重要的临床意义。

本研究整合了微阵列分析、单细胞RNA测序和批量RNA测序数据，重建了瘢痕疙瘩中的内皮亚群及其可能的新生分化轨迹。通过结合多维度生物信息学分析和实验验证，我们建立了一个新的分子分类系统，该系统可能对预后评估和精准治疗的发展具有潜在价值。为了进一步验证这一分类框架的临床相关性，我们在上海长海医院伦理委员会批准（批准编号：CHEC2023-088）并获得所有参与患者的书面知情同意后，对19名接受日间手术的患者捐献的瘢痕疙瘩组织样本及其匹配的临床数据进行了全面的组织病理学和免疫组化分析。研究设计见补充图1（链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。根据各细胞间基因表达谱的相似性，将13,162个内皮细胞分为六个亚群（EC 1–6）。正常疤痕和瘢痕疙瘩之间的亚群分布存在显著差异：EC 5（高表达冯维勒布兰德因子[VWF]）和EC 2主要存在于正常疤痕中，而EC 1和EC 6（高表达I型胶原蛋白α2 [COL1A2]）各自占瘢痕疙瘩内皮细胞的50%以上。值得注意的是，EC 3和EC 4在正常疤痕和瘢痕疙瘩中的比例分布相似，这表明它们在这两种组织状态下可能具有相对稳定的功能。六个内皮亚群之间表现出强烈的细胞间通信。EC 3在通信网络中处于中心位置，主要介导与其他类型细胞的信号传递，其中趋化因子配体12（CXCL12）被确定为关键配体（见补充图2，链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。伪时间轨迹分析重建了这六个内皮亚群的分化顺序：EC 1位于分化轨迹的起始位置，并逐渐向EC 2转化；EC 2分化为两个不同的分支，两个分支最初都共享EC 3作为共同前体。如补充图3（链接：https://links.lww.com/CM9/C755）所示，上分支最终分化为EC 6，而下分支最终分化为EC 4。关键差异表达基因（间隙连接蛋白α4 [GJA4]、hes家族bHLH转录因子4 [HES4]、溶酶体相关蛋白跨膜蛋白5 [LAPTM5]、足板蛋白 [PDPN]、视黄醇结合蛋白4 [RBP4] 和stathmin 1 [STMN1]）在决定细胞命运中起着决定性作用（见补充图3和图4，链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。单细胞和微阵列转录组数据的综合分析确定了在正常疤痕组织中表达水平显著高于瘢痕疙瘩的内皮命运相关基因（DEEFRGs），这提示它们具有潜在的诊断价值（见补充图5，链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。基于非参数检验和皮尔逊相关性分析，我们构建了一个共表达调控网络。在该网络中，节点按颜色编码以突出控制细胞向五种不同分化状态转变的关键基因：超过三分之一的基因（绿色显示）被确定为驱动内皮细胞向状态1转化的关键决定因素；此外，7个基因（紫色）分别特别促进向状态2、3、4和5的分化。从该调控网络中提取的基因随后进行了聚类分析，根据凝聚性聚类图谱，这些基因被稳健地划分为三个不同的簇。热图展示了这些命运相关基因在三个簇以及不同时间点、性别和年龄组中的表达水平。这一可视化结果揭示了三个共识簇与前述临床病理特征之间的显著关联，进一步强调了内皮细胞命运决定与基于共识的聚类之间的强相关性：决定命运的基因在共识簇3中高度表达，而在共识簇1和2中的表达水平相当但显著低于簇3。大多数这些基因（如磷脂磷酸酶3 [PLPP3]、骨髓间质细胞抗原2 [BST2]、caveolae相关蛋白2 [Cavin-2] 和DIX结构域蛋白1 [DIXDC1]）与血管生成和内皮细胞功能相关：PLPP3增强细胞间黏附和内皮屏障完整性[2]；BST2促进内皮前体细胞黏附[3]；Cavin-2通过调控eNOS支持内皮细胞功能[4]；DIXDC1介导VEGF–Wnt/β-连环蛋白相互作用以协调血管发育[5]。这些基因的高表达与增强的血管生成和更高的血管稳定性相关。这支持了我们的假设，即更高的内皮成熟度（更强的血管生成能力和更稳定的内皮功能）与瘢痕疙瘩患者的更好预后相关（见补充图6，链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。卡方检验进一步确认了三个共识簇在诊断时间（P <0.001）和诊断类别（P <0.001）方面的显著差异。数据还表明，簇3与最佳预后相关，并主要出现在健康个体中；簇2预后中等；而簇1在瘢痕疙瘩患者中最常见，与最差预后显著相关。基于这些发现，我们将内皮细胞分为三个不同的临床亚型：低风险组（共识簇3）、中等风险组（共识簇2）和高风险组（共识簇1）。此外，使用最小绝对收缩和选择算子回归选出的11个DEEFRGs构建的主成分分析模型在训练和测试集中的预后预测性能均非常出色（曲线下面积[AUC] >0.86）（见补充图6，链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。鉴于DEEFRGs表达水平与临床亚型之间的显著关联，我们根据生物学功能和表达模式确定了每个亚型的标记基因：低风险组（骨髓间质细胞抗原2 [BST2]+）、中等风险组（磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸Rac交换因子1 [PREX1]+）和高风险组（BST2–）（见补充图7，链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。通过对关键生物标志物（包括差异表达的转录因子、DEEFRGs、信号通路和免疫细胞）进行共表达分析，我们为不同的瘢痕疙瘩临床亚型构建了特异性调控网络，并确定了与关键DEEFRGs显著相关的转录因子和下游通路。在风险组之间，核心基因及其上下游调控关系存在显著差异。在低风险组中，BST2和跨膜蛋白70（TMEM70）起核心调控作用——BST2与转录因子TCF7L1正相关，抑制雄激素反应通路；TMEM70与Ring1和YY1结合蛋白（RYBP）、B细胞特异性Moloney小鼠白血病病毒插入位点1（BMI-1）及TCF7L1共表达，激活Wnt/β-连环蛋白信号通路。在中等风险组中，冯维勒布兰德因子A 1（VWA1）（由BMI-1调控）和基质金属蛋白酶10（MMP10）（受肿瘤蛋白P63 [TP63]控制）起着关键作用：VWA1强烈促进胆汁酸代谢和蛋白质分泌通路；MMP10显著抑制mTORC1信号通路。在高风险组中，synaptotagmin 1（SYT1）和跨膜蛋白178A（TMEM178A）占主导地位——SYT1与同源框C9（HOXC9）、Runt相关转录因子1（RUNX1）和TP63共同调节，激活转化生长因子-β（TGF-β）信号通路；TMEM178A在GATA结合蛋白3（GATA3）和Runt相关转录因子1（RUNX1）的调控下，强烈刺激Notch和Wnt/β-连环蛋白通路（见补充图8，链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。综合化学化合物分析表明，左旋丙咪嗪可能逆转高风险组中的异常基因表达，显示出潜在的治疗价值（见补充图9，链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。19个临床样本的免疫组化分析进一步验证了我们的发现。在血管形态方面，高风险组的血管数量更多，但管腔明显更窄；而低风险组的血管形态更接近正常组织。这些免疫组化结果中各种标记基因的分布也支持了我们的早期发现，进一步证实了分析的准确性，结果显示低风险组中BST2、MMP10和TMEM70的表达水平显著高于其他亚组，而PREX1在中等风险组中表达最丰富。相比之下，高风险组中BST2和PREX1的表达显著降低。这些形态学和分子特征之间的对应关系进一步验证了本研究中提出的“内皮成熟度”概念的临床可行性（见补充图10，链接：https://links.lww.com/CM9/C755）。与临床表型的相关性表明，高风险组的患者更容易出现感觉异常（包括疼痛和瘙痒），并且瘢痕疙瘩伴有异常色素沉着的比率显著更高。对瘢痕疙瘩组织的组织病理学评估进一步显示，低风险组含有更多形态正常的血管，而高风险组则以血管阻塞为主。在预后方面，高风险组的复发率最高，其次是中等风险组，低风险组未观察到复发事件（尽管部分患者失去随访）。Vancouver疤痕量表（VSS）评分在高风险组显著升高，反映了该分子分类系统的稳健性和临床有效性。通过单细胞转录组分析，我们在瘢痕疙瘩和正常疤痕组织中识别出六个不同的内皮细胞亚群，伪时间轨迹分析进一步揭示了从不成熟到成熟内皮状态的连续发育过程。此外，基于DEEFRGs，我们首次提出了“内皮成熟度”概念，并建立了三种与临床预后显著相关的瘢痕疙瘩分子亚型。这一分类系统不仅阐明了内皮发育状态与疾病严重程度之间的内在关系，而且还展示了强大的临床可行性：关键标记基因（如BST2和PREX1）可以通过免疫组化或RT-qPCR在常规病理标本中轻松检测到，适用于术后风险分层和早期干预以防止疤痕恶化。值得注意的是，这些分子亚型与VSS评分之间存在强相关性，强调了它们在指导个性化治疗决策方面的潜在效用——高风险患者可能受益于强化联合疗法，而低风险患者可能通过保守或局部干预得到有效管理。然而，这项研究也存在一些局限性。由于完全依赖生物信息学分析，难以完全捕捉内皮细胞发育轨迹和分化状态的复杂性。未来的工作应结合细胞和动物实验，以验证所识别的DEEFRGs与表型结果之间的因果关系，并从多个维度评估这种新的瘢痕疙瘩分子分类的临床价值。此外，当前的临床样本量有限，需要进一步纳入更多样本进行实验验证。针对这种分类的药物开发的可行性和治疗潜力也将是后续研究的重点。我们还旨在在疤痕形成的早期阶段检测DEEFRGs，以实现分子分类并提前预警瘢痕风险。总之，本研究提出的基于内皮命运相关基因的瘢痕疙瘩分子分类不仅加深了对瘢痕疙瘩中血管内皮异质性的理解，还为更精确的疤痕预防和治疗提供了理论基础，具有重要的临床转化潜力。

本工作得到了中国国家重点研发计划（编号：2024YFA1108405）、国家自然科学基金（编号：82472546）、上海市科学技术委员会科技创新项目（编号：25CL2900703）、上海市优先科研中心项目（编号：2023ZZ02013）以及上海市科学技术委员会优秀学术带头人项目（编号：23XD1425000）的资助。利益冲突：无。