Lumican与TLR4之间的相互作用通过激活肝星状细胞加速肝纤维化进程

《Hepatology Communications》：Lumican–TLR4 interaction accelerates hepatic fibrosis by activating hepatic stellate cells

　　**摘要**
**背景：** Lumican的表达与各种原因引起的肝纤维化有关。然而，其在肝纤维化中的确切作用及其潜在机制仍不清楚。

**方法：** 制备了Lumican基因敲除（Lum KO）小鼠，并通过胆管结扎（BDL）和四氯化碳（CCl4）诱导肝纤维化，以研究Lumican在体内的作用。进行了蛋白质组学分析和靶点验证，以阐明Lumican促进肝纤维化的机制。

**结果：** Lumican主要在肝星状细胞（HSCs）中表达，并促进其活化。Lumican缺乏可减轻BDL和CCl4处理后小鼠的肝纤维化进展。蛋白质组学分析发现Lumican是Toll样受体4（TLR4）的配体。Lumican直接与TLR4结合，激活下游的SMAD3介导的促纤维化信号通路，从而促进HSC活化并促进肝纤维化的发展。

**结论：** Lumican通过Lumican–TLR4–SMAD3轴在HSC活化和肝纤维化进展中起关键作用，这使其成为抗纤维化干预的潜在治疗靶点。

**通俗语言总结：**
本研究探讨了Lumican如何促进肝纤维化。研究人员使用Lum KO小鼠，通过胆管结扎（BDL）和四氯化碳（CCl4）诱导肝纤维化，以测试其在体内的功能。研究发现Lumican主要由肝星状细胞（HSCs）产生，并促进其活化；而Lumican缺乏可减轻这两种模型中的纤维化程度。蛋白质组学分析表明Lumican是Toll样受体4（TLR4）的配体，它能直接与TLR4结合并激活SMAD3介导的促纤维化信号通路。这些发现确立了Lumican–TLR4–SMAD3轴作为肝纤维化的关键驱动因素和有前景的治疗靶点。

**常见问题解答：**
**引言：**
肝纤维化是慢性肝病最常见的临床表现。包括病毒性肝炎、酒精滥用、胆汁淤积和代谢相关性脂肪性肝炎等多种原因可导致慢性肝损伤，最终进展为纤维化和肝硬化。肝纤维化是一个动态的病理过程，其特征是细胞外基质（ECM）的合成、降解和沉积失衡，伴随肝脏内结缔组织的异常增生。目前，肝移植仍是治疗终末期肝纤维化的唯一有效方法。然而，其临床应用受到供体器官短缺、术后并发症和重大经济负担的限制。尽管许多化合物在临床前模型中显示出抗纤维化潜力，但尚未有抗纤维化药物获准临床使用。因此，进一步阐明肝纤维化的发病机制并开发新的抗纤维化治疗策略具有重要意义。

**Lum基因：**
Lum基因位于12号染色体12q21.3–q22区域，编码小亮氨酸丰富蛋白聚糖（SLRP）家族的成员，最初在鸡角膜中被发现。Lumican包含4个结构域：(i) 一个16个氨基酸的信号肽；(ii) 一个富含酪氨酸硫酸盐和二硫键的负电荷N端区域；(iii) 6–10个亮氨酸重复（LRR）基序，这些基序通过保守的分子结构促进蛋白质-蛋白质相互作用；(iv) 一个含有2个保守半胱氨酸残基的C端区域。作为ECM的重要组成部分，Lumican在维持组织结构稳态和调节细胞因子活性中起关键作用。过度沉积的ECM是肝纤维化的核心病理特征，会破坏正常的肝脏结构和功能，最终导致不可逆的肝脏损伤。鉴于非恶性肝纤维化是肝细胞癌（HCC）发展的主要风险因素，阐明Lumican在肝纤维化进展中的失调模式、生物学作用和分子机制可能为该疾病的管理提供新的治疗策略。

**方法：**
有关抗体和试剂的信息详见指定部分，并在补充表S1（https://links.lww.com/HC9/C327）中列出。临床样本收集来自温州医科大学第一附属医院内分泌科。所有涉及人类样本的实验均获得温州医科大学伦理委员会的批准（批准编号KY2021-173），并符合《赫尔辛基宣言》的原则。纤维化的诊断标准参考了中国医学会肝病学会发布的《代谢功能障碍相关（非酒精性）脂肪肝病防治指南》（2024版）。排除标准包括：急性或慢性病毒性肝炎、药物引起的肝病、酒精依赖（男性成人每周摄入量≥140克，女性每周摄入量≥70克）、自身免疫性肝病、肝硬化、肾功能衰竭、甲状腺功能障碍、急性感染、严重心血管疾病、恶性肿瘤、精神疾病以及正在服用全身性皮质类固醇的患者。所有受试者均签署了书面知情同意书。本研究共纳入202例纤维化患者和132例非纤维化患者。基线特征详见补充表S2（https://links.lww.com/HC9/C327）。血液样本在空腹12小时后采集，血清样本制备后立即在-80°C下冷冻。

**小鼠实验：**
小鼠实验在温州医科大学动物政策和福利委员会审查并批准护理和实验程序后开始（批准文件编号wydw2021-0182）。所有动物实验均符合NIH指南（《实验室动物护理和使用指南》）。实验中使用的是6–8周大的Lum KO雄性小鼠（C57BL/6品系）和野生型C57BL/6雄性小鼠（WT）。小鼠饲养在无菌环境中，温度为22±2°C，湿度为50%–60%，光照周期为12:12小时。小鼠可获得充足的食物和水分。通过尾部分析提取cDNA，使用特异性引物鉴定WT型和Lum KO型。详细实验步骤见补充表S3（https://links.lww.com/HC9/C327），引物序列见补充表S4（https://links.lww.com/HC9/C327）。

**实验设计：**
- **CCl4诱导的肝纤维化：** 6–8周大的雄性小鼠每周两次接受四氯化碳（CCl4，浓度为1:3的玉米油溶液，每公斤体重1毫升）腹腔注射，持续4周。对照组小鼠接受玉米油（每公斤体重0.5毫升）注射， ebenfalls持续4周。
- **胆管结扎（BDL）诱导的肝纤维化：** 8周大的小鼠接受胆管结扎手术以诱导胆汁淤积性肝纤维化。假手术组接受相同操作但不进行胆管结扎。假手术组和BDL组在手术后第14天被处死，收集肝脏组织和血清。
- **TLR4抑制剂实验：** 18只C57BL/6雄性小鼠接受BDL并随机分为4组：BDL+PBS（n=6）、BDL+rhLUM（n=6）、BDL+TAK-242（n=6）和BDL+TAK-242+rhLUM（n=6）。TAK-242以3毫克/公斤/天的剂量腹腔注射，rhLUM以0.02毫克/公斤/天的剂量通过尾静脉注射，持续7–14天。处死后收集肝脏组织和血清。

**细胞分离与分析：**
从Lum KO小鼠或WT小鼠中分离原代肝细胞、Kupffer细胞和HSCs。使用异氟醚麻醉确保手术过程的人道性和有效性。原代肝细胞通过胶原酶灌注和差速离心 two-step 工艺提取。首先将导管插入门静脉，然后切断下腔静脉以促进灌注。肝脏用含有IV型胶原酶和476 mM CaCl2的消化缓冲液灌注以消化肝基质并释放细胞。通过3次低速离心（50g/分钟，每次3分钟）获得肝细胞；上清液中的细胞用15 mL RPMI/1640稀释并再次离心（50g/分钟，三次）以获得Kupffer细胞；然后上清液用400g离心3分钟以分离HSCs。使用Nycodenz梯度（覆盖Hank’s缓冲液）根据密度分离HSCs。

**细胞培养与处理：**
LX-2细胞（Cat: CL-0560）购自Pricella Biotechnology Co., Ltd（武汉，中国）；HEK-293T细胞（Cat: YC-A007）购自Ubigene Bioscience（广州，中国）。细胞培养在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。

**血清酶检测：**
使用Jiancheng Bioengineering Research Institute（南京，中国）提供的试剂盒检测血清中的肝酶水平（ALT、AST、ALP、HYP和TBIL），以评估肝功能。

**免疫组化与荧光染色：**
样品首先在4%福尔马林溶液中固定48小时，然后包埋在石蜡中切成5微米厚的切片。切片经过脱蜡和水化处理后，用Hematoxylin和Eosin（H&E）、Masson Trichrome和Sirius Red染色。

**RT-qPCR与Western blot：**
RNA提取使用Trizol Reagent（Invitrogen，美国）。cDNA合成使用PrimeScript RT Reagent Kit和gDNA Eraser（Takara，Ann Arbor，MI）。实时PCR使用TB Green Premix Ex Taq II（Takara）和CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，Hercules，CA）进行。相对基因表达水平通过2^-ΔΔCt方法测定，以Actb作为参考基因。引物序列见补充表S5（https://links.lww.com/HC9/C327）。数值被标准化为相应的内参蛋白。质粒和小型干扰RNA（siRNA）的构建以及His-Lumican、Myc-TLR1、Myc-TLR2、Myc-TLR4、Myc-TLR5和Myc-TLR6的过表达质粒和针对LUM的siRNA是由Genscript（南京，中国）和Tsingke（北京，中国）公司委托构建的。质粒和siRNA是通过LipofectAMINE3000（目录号：L3000150；Thermo Fisher Scientific）进行转染的。共免疫沉淀分析（Co-IP）：对于Co-IP，从同时转染了相应质粒的小鼠肝组织、LX-2细胞或HEK-293T细胞中提取蛋白质。每种细胞提取物总共500微克在4℃下使用相应的一抗进行过夜免疫沉淀。这一步骤有助于富集含有目标蛋白质的蛋白质-蛋白质复合物。免疫复合物按照制造商的协议使用BeyoMag Protein A + G磁珠（Beyotime，中国）进行沉淀。这种方法有效地捕获了用于后续分析的抗体-抗原复合物。免疫沉淀后，通过Western blot检测沉淀的复合物中特定蛋白质的存在。菌落形成分析：LX-2细胞以每孔1×10^3的密度接种在6孔板中，并在有或没有rhLUM的情况下处理2周。细胞用4%甲醛固定15分钟，然后在室温下用0.1%结晶紫溶液染色30分钟。用PBS洗涤菌落直至去除多余的染料，随后使用ImageJ对染色的菌落进行量化。LC–MS/MS分析：HEK-293T细胞被转染His-LUM质粒。Lumican抗体被加入裂解物中进行IP实验，IgG作为阴性对照。然后，由上海Majorbio（上海，中国）进行LC–MS/MS分析。单细胞测序分析：每组3只小鼠的肝非实质细胞被合并并加载到10× Genomics Chromium单细胞芯片中。根据制造商的说明，使用Chromium Single Cell 3’ GEM Library & Gel Bead Kit v3（10× Genomics，目录号：PN-1000075）制备文库，并在Illumina Novaseq（圣地亚哥，CA）上进行测序。测序数据使用带有修改的Seurat（v3）单细胞分析管道进行处理。伪时间轨迹使用Slingshot推断。数据可视化通过Lianchuan生物云平台（https://www.omicstudio.cn/）进行。RNA-seq数据和在线单细胞测序分析：RNA-seq数据从基因表达组学数据库（GEO）（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中检索。选择了五个数据集，包括GSE182235、GSE222576、GSE14323、GSE49541、GSE4505024。Lum水平通过阵列数据分析工具或高通量测序数据的基因ID转换工具来确定。对于正常人和肝纤维化受试者的单细胞测序数据，我们从公共单细胞测序数据库（http://www.gepliver.org/#/home）获取并可视化结果。统计分析：本研究的统计分析使用了GraphPad Prism 9.5.1。数据来源于至少3个独立实验，表示为平均值±标准误（SEM），其中“n”表示生物重复次数。对于成对比较，应用了双尾Student t检验，而对于多组比较，则使用带有Tukey事后分析的1-way ANOVA。显著性阈值设定为p<0.05。

结果：肝纤维化中HSC来源的Lumican显著上调。我们首先评估了人类肝纤维化及其对应实验模型中的Lumican表达。3个人类数据集（GSE14323、GSE49541、GSE45050）的转录组分析显示，纤维化肝组织中的LUM mRNA水平显著高于正常或轻微纤维化样本（图1A–C）。同样，在两种小鼠纤维化模型中，肝Lum表达也高于对照组（图1D、E）。与这些结果一致，我们自己建立的BDL诱导和CCl4诱导的小鼠模型也表现出Lum mRNA水平升高（图1F、G）以及Lumican蛋白增加（图1H、I和补充图1A、B，https://links.lww.com/HC9/C328）。血清中的Lumican浓度在纤维化受试者中也更高（图1J）。此外，血清Lumican与临床纤维化指标呈正相关，包括肝脏硬度测量（LSM；图1K）和控制的衰减参数（CAP；图1L），表明其具有强烈的促纤维化作用。公共单细胞RNA-测序数据显示，Lumican主要在肝星状细胞（HSCs）中表达，并在纤维化人类肝脏中显著上调（补充图S2A–C，https://links.lww.com/HC9/C328）。同样，我们对对照组和CCl4处理的小鼠肝脏进行的scRNA-seq分析也证实了HSC的主导表达（图1M–O）。为了验证这一点，我们分离了原代小鼠肝细胞、Kupffer细胞和HSCs。RT-qPCR（图1P）和Western blotting（图1Q）确认Lumican表达仅限于HSCs。总体而言，这些数据在人类和小鼠纤维化中均显示Lumican在转录和蛋白质水平上的上调，强调了其作为纤维生成关键介质的潜力。

Lumican缺乏可减轻小鼠BDL诱导的肝纤维化：为了研究Lumican在体内肝纤维化中的作用，我们生成了Lumican敲除（Lum KO）小鼠，并将它们分别进行假手术或胆管结扎（BDL；补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C328，和图2A）。通过基因分型和免疫印迹验证了Lum KO小鼠中Lumican的成功删除（补充图S3B–D，https://links.lww.com/HC9/C328）。正如预期的那样，BDL显著增加了WT小鼠的血清ALT、AST、ALP和TBIL，而在Lum KO小鼠中这些指标显著降低（图2B–D）。组织病理学显示WT小鼠出现了严重的BDL诱导的肝损伤，表现为结构紊乱、肝细胞凋亡和炎症浸润，这些变化在Lum KO小鼠中得到缓解（图2E）。Masson三色染色和Sirius Red染色显示BDL后有大量的胶原沉积，而在Lum KO小鼠中这一沉积显著减少（图2E、F）。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫组化染色显示BDL后显著诱导，但在Lum KO小鼠中受到强烈抑制（图2E、F）。RT-qPCR显示BDL后与炎症和纤维化相关的基因显著上调，所有这些都在Lum KO小鼠中显著降低（图2G、H）。免疫印迹确认BDL后COL1和α-SMA蛋白水平增加，而在Lum KO小鼠中这两种蛋白均显著降低（图2I、J）。总体而言，这些发现表明Lumican缺乏通过限制肝细胞损伤、胶原积累和HSC激活来防止BDL诱导的肝纤维化。

Lumican缺乏可减轻小鼠CCl4诱导的肝纤维化：然后，我们使用了另一种由CCl4诱导的小鼠纤维化模型（补充图S4A，https://links.lww.com/HC9/C328）。与先前的发现一致，CCl4导致了严重的肝损伤，表现为血清ALT、AST、ALP和羟脯氨酸（HYP）升高。Lum KO显著减轻了这些升高（补充图S4B–D，https://links.lww.com/HC9/C328）。形态学和组织学分析显示CCl4暴露后有广泛的胶原沉积，而Lum KO显著减少了肝胶原积累（补充图S4E、F，https://links.lww.com/HC9/C328）。RT-qPCR和Western blotting也证实了Lum KO对炎症反应和肝纤维化的保护作用（补充图S4G–J，https://links.lww.com/HC9/C328）。总体而言，这些结果表明Lumican缺乏可以减轻CCl4诱导的肝纤维化。Lumican既是促进HSC激活、增殖和ECM产生的必要条件，也是充分条件。为了研究Lumican如何调节纤维生成，进行了体外实验。用重组人Lumican（rhLUM，50 ng/mL）处理LX-2细胞24小时后，显示与纤维化相关的基因（ACTA2、COL1A1、COL3A1）和蛋白质（COL1和α-SMA）显著上调（图3A–C）。免疫荧光显示rhLUM处理的LX-2细胞中α-SMA的表达强烈（图3D、E）。为了评估HSC的增殖，菌落形成分析显示rhLUM处理后菌落数量显著增加（图3F、G）。为了深入理解Lumican在HSC激活中的作用，我们使用siRNA沉默了LX-2细胞中的Lumican。RT-qPCR和免疫印迹的结果表明Lumican缺乏显著减轻了HSC的激活以及纤维化相关基因和蛋白质的水平（图3H–J）。总体而言，这些发现表明Lumican直接促进HSC的激活、增殖和ECM的产生。

Lumican通过非典型途径通过SMAD3磷酸化激活HSC：肝纤维化的一个特征是HSC的激活，其中最重要的途径是TGFβ–SMAD信号通路。为了确认Lumican是否通过TGFβ–SMAD通路激活HSC，我们在HEK-293T细胞中过表达了Lumican，并收集条件培养基（LUMOE-CM）处理LX-2细胞24小时。SMAD3的磷酸化水平显著升高（图4A、B）。此外，LX-2细胞暴露于rhLUM 24小时后，p-SMAD3的蛋白质表达也显著增加（图4C、D）。同样，体内p-SMAD3的水平也显示出相同的结果（图4E、F）。为了进一步澄清HSC来源的Lumican激活HSC的自分泌回路，我们使用small interfering RNA（siRNA）沉默了LX-2细胞中的Lumican，并收集条件培养基处理LPS+PA处理的LX-2细胞24小时。Western blot结果显示，当Lumican被沉默后，再次暴露于缺乏Lumican的条件培养基中时，未能诱导HSCs的激活和SMAD3的磷酸化（图4G–J）。作为经典的受体激活的SMAD蛋白，SMAD3的磷酸化包括经典和非经典途径。为了进一步阐明Lumican如何激活SMAD3的磷酸化，应用了TGFβ途径抑制剂（LY2109761）。如图4K、L所示，rhLUM处理增加了COL1、α-SMA和p-SMAD3的表达，而在预先使用LY2109761处理后，这些效应仍然存在。这些结果表明，HSC衍生的Lumican通过一种自分泌机制，特别是通过非经典途径激活SMAD3的磷酸化。

**图4：Lumican通过非经典途径通过SMAD3磷酸化激活HSCs。**
(A, B) 在HEK-293T细胞中过表达His-Lumican 24小时。收集条件培养基并应用于LX-2细胞24小时。（A）p-SMAD3和SMAD3的表达水平；（B）密度计定量分析。（C, D）LX-2细胞暴露于50 ng/mL的rhLUM 24小时。（C）p-SMAD3和SMAD3的表达水平；（D）密度计定量分析。（E, F）WT和Lum KO小鼠肝脏中p-SMAD3和SMAD3的表达水平及密度计定量分析。（G, H）转染si-LUM或si-NC的LX-2细胞中的LUM蛋白质表达；（G）密度计定量分析。（I, J）LX-2细胞转染si-LUM 24小时后，再暴露于条件培养基（CM）24小时，COL1、α-SMA、p-SMAD3和SMAD3的蛋白质表达；（I）密度计定量分析。（K, L）rhLUM（50 ng/mL）和/或TGF-β信号抑制剂LY2109761（1 μM）处理24小时后，COL1、α-SMAD3和SMAD3的蛋白质表达；（K）密度计定量分析。数据以平均值±SEM表示，动物实验每组n=6，细胞实验每组n=3；*p<0.05。缩写：α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；CM，条件培养基；COL1，I型胶原；HSCs，肝星形细胞；LUM，lumican；p-SMAD3，磷酸化的SMAD3；rhLUM，重组人lumican；si-LUM，靶向LUM的小干扰RNA；si-NC，小干扰RNA阴性对照；SEM，平均值的标准误差；TGF-β，转化生长因子-β；WT，野生型。

**Lumican直接与TLR4相互作用**
鉴于Lumican是分泌型的，我们假设它是通过与跨膜受体的相互作用来发挥其效应的。为了识别潜在的Lumican受体，我们进行了共免疫沉淀（Co-IP）后进行质谱分析（图5A）。质谱结果显示TLR4是一个候选的相互作用蛋白（图5B）。TLR4是一个特征明确的跨膜受体，在肝纤维化中起着关键作用。因此，我们推测TLR4介导Lumican从细胞外环境到细胞质的信号传导。Co-IP测定在LX-2细胞和纤维化肝组织中证实了Lumican与TLR4的相互作用（图5C, D）。在HEK-293T细胞中共转染Lumican和TLR4过表达质粒进一步验证了这种相互作用（图5E, F）。重要的是，重组人Lumican（rhLUM）与重组人TLR4的细胞外结构域（rhTLR4）之间的共免疫沉淀显示了直接结合（图5G）。为了明确结合特异性，我们构建了多个TLR家族成员（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6）的表达质粒。Lumican仅与TLR4结合，证实了这种特异性相互作用（补充图S5A–E，https://links.lww.com/HC9/C328）。总的来说，这些结果提供了有力证据，表明Lumican直接与TLR4的细胞外结构域结合以发挥其生物学效应。

**图5：Lumican直接与TLR4相互作用。**
(A) 定量蛋白质组学筛选以识别与Lumican结合的蛋白质的示意图。（B）TLR4肽段的质谱/质谱（MS/MS）光谱。（C, D）LX-2细胞（C）和肝组织（D）中Lumican和TLR4的共免疫沉淀。（E, F）HEK-293T细胞转染Lumican-His和TLR4-Myc质粒，检测到Lumican和TLR4的共免疫沉淀。（G）rhLUM-rhTLR4相互作用的共免疫沉淀测定。数据以平均值±SEM表示，每组n=3；*p<0.05。缩写：Lum，lumican；MS/MS，串联质谱；rhLUM，重组人lumican；rhTLR4，重组人Toll样受体4；SEM，平均值的标准误差；TLR4，Toll样受体4。

**TLR4在HSCs激活中桥接细胞外的Lumican和细胞内的SMAD3信号**
先前的研究表明，在肝纤维化中，SMAD3是TLR4信号的下游效应器，这促使我们假设Lumican通过TLR4–SMAD3轴激活HSCs并推动纤维化进程。为了确定TLR4是否对于Lumican介导的SMAD3磷酸化是必需的，我们使用了TLR4抑制剂TAK-242。LX-2细胞先预处理1 μM TAK-242 1小时，然后暴露于rhLUM（50 ng/mL）24小时。TAK-242显著抑制了TLR4–SMAD3轴，表现为p-SMAD3水平降低（图6A, B）。TAK-242还显著下调了与纤维化相关的基因的mRNA和蛋白质表达（图6C）。一致地，ECM蛋白COL1和α-SMA在TAK-242处理后也减少（图6D, E）。这些结果共同表明，TLR4是Lumican诱导的SMAD3磷酸化和HSCs激活的重要中介。

**图6：TLR4在HSCs激活中桥接细胞外的Lumican和细胞内的SMAD3信号**
LX-2细胞先预处理1 μM TAK-242（一种TLR4抑制剂）1小时，然后暴露于50 ng/mL的rhLUM 24小时。（A, B）WT和Lum KO小鼠肝脏中p-SMAD3和SMAD3的表达水平及密度计定量分析。（C）COL1A1、FN1、ACTA2和COL3A1的mRNA水平。数据以ACTB为基准进行归一化。（D-E）与纤维化相关的蛋白质的表达水平及密度计定量分析。数据以平均值±SEM表示，每组n=3；*p<0.05。缩写：HSC，肝星形细胞；Lum，lumican；KO，敲除；p-SMAD3，磷酸化的SMAD3；rhLUM，重组人lumican；SEM，平均值的标准误差；TLR4，Toll样受体4。

**Lumican在体内的促纤维化效应依赖于TLR4**
为了评估TLR4是否对于Lumican在体内的促纤维化效应是必需的，小鼠接受了TAK-242（每2天3 mg/kg）以抑制TLR4信号传导，并同时静脉注射PBS或rhLUM（每2天0.05 mg/kg）1周。通过BDL诱导肝纤维化2周（图7A）。我们的结果显示，BDL+TAK-242组和BDL+rhLUM+TAK-242组之间的血清ALT和AST水平没有显著差异（图7B, C）。此外，H&E染色、Masson三色染色、Sirius red染色和α-SMA免疫组化显示，当TLR4被抑制时，rhLUM并未加剧肝纤维化（图7D, E）。一致地，TAK-242消除了Lumican诱导的与纤维化相关的基因和蛋白质的上调（图7F–H）。这些发现表明，Lumican的促纤维化效应完全依赖于TLR4信号传导。

**图7：Lumican在体内的促纤维化效应依赖于TLR4。**
(A) 动物实验的分组和步骤示意图。（B）血清ALT和AST。（C）血清ALP。（D）血清TBIL。（E）从指定组别中获取的肝脏组织图像，并通过苏木精和伊红（H&E）染色、Masson三色染色和免疫组化（IHC）检测肝脏损伤情况。（F）Masson三色染色、Sirius red染色和α-SMA的相对阳性染色面积（比例尺=50 μm）。（G）Il6、Il1b和Tnf的mRNA水平。数据以Actb为基准进行归一化。（H）Acta2、Col1a1、Fn1、Col3a1和Mmp9的mRNA水平。数据以Actb为基准进行归一化。（I, J）与纤维化相关的蛋白质的表达水平及密度计定量分析。数据以平均值±SEM表示，每组n=6；*p<0.05。缩写：ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸氨基转移酶；H&E，苏木精和伊红；IHC，免疫组化；Il1b，白细胞介素-1β；Il6，白细胞介素-6；Mmp9，基质金属蛋白酶9；SEM，平均值的标准误差；TBIL，总胆红素；Tnf，肿瘤坏死因子-α。

**讨论**
在由各种原因引起的肝脏损伤（包括肝炎病毒感染、慢性酒精滥用和自身免疫性疾病）中，静息HSCs活化成肌成纤维细胞样细胞是推动肝纤维化进展的核心病理事件。因此，阐明调节HSCs激活的分子靶点对于开发有效的抗纤维化疗法具有重要意义。在本研究中，我们证明了Lumican主要在HSCs中表达，并且在纤维化肝脏中显著上调。Lumican促进静息HSCs的激活，从而加剧肝纤维化过程。机制上，Lumican由活化的HSCs分泌到细胞外空间，在那里它通过自分泌方式直接与HSCs的TLR4结合，导致SMAD3的转活化并随后诱导纤维化反应。相反，Lumican的缺乏显著减弱了HSCs的激活，减少了ECM的积累，并减轻了小鼠的肝纤维化进展。总的来说，我们的发现强调了Lumican在HSCs激活和纤维化重塑中的关键作用，突显了其作为抗纤维化干预治疗目标的潜力。Lumican属于SLRP家族，其特点是含有丰富的亮氨酸重复（LRR）基序，这些基序构成了其与其它分子相互作用的结构基础。先前的研究已经表明Lumican参与了肝纤维化的进展。本研究进一步揭示了Lumican促进肝纤维化进展的详细分子机制。在本研究中，我们确认了Lumican与TLR4之间的直接相互作用，并确定TLR4是Lumican的新膜受体。实际上，Lumican核心蛋白调节TLR4介导的先天免疫反应。TLR4是一种经典的Toll样受体家族跨膜受体，由三个结构域组成：细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。值得注意的是，细胞外结构域含有LRR基序，为配体识别提供了特异性结合位点。基于Lumican和TLR4的LRR结构域之间的结构相似性，我们假设它们的相互作用是通过这些保守的基序介导的。有趣的是，在细胞表面表达的TLR家族成员（包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10）中，我们观察到Lumican与TLR4之间的选择性结合亲和力。这种特异性表明它们的相互作用可能存在更精确的分子机制，这在本研究中尚未完全阐明，需要进一步研究。TLR是最早被发现的模式识别受体（PRRs），能够检测广泛的病原体，并在先天免疫反应中起关键作用。其中，TLR4通过两种不同的途径传导细胞内信号：依赖于MyD88的途径和不依赖于MyD88（依赖于TRIF的途径）。配体结合后，TLR4的细胞内结构域二聚化，促进适配器蛋白MyD88和TIRAP的招募。随后的磷酸化事件激活白细胞介素-1受体相关激酶（IRAKs），这些激酶与转化生长因子β激活的激酶1（TAK1）相互作用。TAK1与适配器蛋白TRAF6、TAB2和TAB3一起增强下游激酶信号传导。活化的TAK1进一步刺激丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs），最终激活关键转录因子如核因子-κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1）。这些转录因子调控多种促炎细胞因子的表达。慢性炎症是肝纤维化的特征。因此，Lumican可能通过调节TLR4介导的炎症信号传导来促进肝纤维化的进展。转化生长因子β1（TGF-β1）是通过经典磷酸化途径激活SMAD3的主要诱导因子。然而，研究还表明脂多糖（LPS）可以通过非经典途径激活SMAD3。具体来说，LPS在丝氨酸179（Thr179）和丝氨酸208（Ser208）处激活SMAD3的磷酸化，而不在经典的C端位点丝氨酸423（Ser423）和丝氨酸425（Ser425）。进一步的研究表明，在TLR4缺陷模型中，LPS诱导的SMAD3磷酸化显著减弱，这表明TLR4和SMAD3之间可能存在相互作用。实际上，现有研究表明TLR4可能通过激活Src家族激酶EGFR来重新激活SMAD3。尽管如此，TLR4和SMAD3之间相互作用的确切机制仍有待阐明，需要进一步研究。鉴于Lumican的直接促纤维化作用，基于Lumican开发靶向抗纤维化疗法具有显著的转化潜力。一种有前景的方法是设计Lumican拮抗剂，包括竞争性肽和中和抗体。为此，首先需要阐明Lumican–TLR4相互作用的结构构象，这将指导针对关键结合界面的抗体的合理设计。此外，可以通过计算机辅助分子设计和基于人工智能的高通量筛选来开发竞争性肽。此外，动物模型中的临床前研究表明，腺相关病毒（AAV）介导的基因疗法通过调节分子水平的异常纤维生成基因表达，在治疗肝纤维化方面具有显著的效果。在多种AAV血清型中，AAV6已被有效用于体内重编程活化的肝干细胞（HSCs），通过将肝脏转录因子或sh-Nestin传递给纤维化小鼠模型中的Nestin+ HSCs来实现这一目标。另一项研究还发现，AAV6介导的针对HSCs的THBS2基因沉默能够缓解小鼠的肝纤维化。基于这些发现，使用AAV6载体传递Lumican特异性的短发夹RNA（shRNA）以选择性沉默HSCs中的Lumican，为治疗肝纤维化提供了一种有前景的策略。这种方法不仅为精准的抗纤维化治疗提供了新的途径，还扩展了基于AAV的基因疗法在纤维化疾病中的应用前景。

**结论** 总之，本研究揭示了Lumican在肝纤维化中的具体作用及其分子机制，表明干扰Lumican的表达可能是开发新型抗纤维化策略的有希望的方法。