使用快速床旁基质金属蛋白酶-7检测方法对胆道闭锁进行鉴别诊断：一项多中心诊断研究

《Hepatology》：Differentiation of biliary atresia using a rapid point-of-care matrix metalloproteinase-7 assay: A multicenter diagnostic study

　　**摘要**
**背景：**胆道闭锁（BA）预后不良的主要原因是诊断和手术延误。这种延误通常归因于当前门诊评估方法的复杂性。虽然通过现有的方法（如ELISA）进行的血清MMP-7分析具有较高的诊断准确性，但其在外科门诊环境中的实用性常常受到检测时间长的限制。为了解决这一挑战，我们开发并评估了MMP-7快速检测方法，以准确区分BA。

**方法：**
这项多中心前瞻性诊断研究于2021年11月至2024年12月在5家三级医院的儿科外科门诊部门进行。共有423名6个月以下的婴儿因持续性黄疸被纳入研究。2021年11月至2023年5月收集的样本通过ELISA方法进行了分析（n=221），每周检测一次或两次。2024年6月至12月，样本使用了MMP-7快速检测方法进行检测。

**结果：**
在202名接受快速检测的婴儿中，98名被诊断为BA。快速检测方法的灵敏度为91.84%（95%置信区间：86.42%–97.26%），阴性预测值为92.00%（95%置信区间：86.68%–97.32%）。这些诊断参数与ELISA方法相当，ELISA的灵敏度为90.82%，阴性预测值为91.74%。快速检测在15分钟内提供结果，每次检测费用为14美元，而ELISA检测需要分批处理，平均耗时3天，费用更高（70美元）。

**结论：**MMP-7快速检测是一种快速、准确且经济高效的筛查工具，适用于门诊环境，有助于BA的早期诊断。

**引言：**
胆道闭锁（BA）是一种严重的炎症性和进行性纤维化胆道疾病，是婴儿胆汁淤积的主要原因。尽管原发性肝移植可提供更好的长期生存率，但所需的终身免疫抑制对幼儿来说带来了重大挑战和长期并发症。因此，Kasai胶管肠吻合术（KPE）仍然是大多数儿科外科医生推荐的一线治疗方法。然而，在常规门诊环境中确诊BA仍然困难，这是延误治疗的重要原因。KPE的成功在很大程度上取决于患者的手术年龄。手术年龄越小，生存率越低。因此，及时准确地诊断BA至关重要。但目前从理想手术窗口（<30天）到实际临床情况之间存在显著差距。诊断的金标准——术中胆道造影具有侵入性且需要麻醉，不适合常规的早期评估。此外，儿科医生通常采取谨慎的态度，避免对自限性胆汁淤积的婴儿进行过度检查，但这可能导致必要的评估推迟并延长诊断时间。虽然存在有效的筛查方法（如分阶段测量胆红素和粪便颜色卡），但其广泛实施受到后勤和经济障碍的阻碍。因此，晚期就诊和复杂的诊断流程仍然是主要问题。基质金属蛋白酶-7（MMP-7）被认为是一种有前景的BA生物标志物，但现有的定量方法（如ELISA）受到检测时间长和复杂性的限制，影响了其在门诊环境中的实际应用。为了克服这一限制，我们在实际临床环境中评估了MMP-7快速检测（TACRO，中国），这是一种15分钟的即时免疫层析测定方法。本研究旨在确定该快速检测的诊断性能及其临床效益。

**研究设计和伦理批准：**
这项前瞻性多中心诊断研究在华中科技大学同济医学院附属医院儿科外科、首都医科大学北京儿童医院、西安儿童医院、河北儿童医院以及遵义医科大学附属医院儿科外科进行。研究方案遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并获得了各参与中心的伦理批准。该试验在中国临床试验注册系统中获得批准和注册（编号：ChiCTR1900028456）。所有参与者的父母或法定监护人签署了书面知情同意书。

**患者人群：**
2021年11月至2024年12月期间，前瞻性地招募了6个月以下的婴儿。符合条件的患者是那些因持续性黄疸（定义为直接胆红素水平>17 μmol/L）而到门诊就诊且诊断不明确的婴儿。排除标准包括：超过14天接受肠外营养、已知恶性肿瘤、有肝胆手术史、活动性细菌或真菌感染或原发性溶血性疾病。如果初次就诊时已明确诊断或监护人不愿提供同意书或不遵守随访协议，患者也被排除。

**研究程序和数据收集：**
纳入研究时，收集了常规肝功能检测的剩余血清用于MMP-7检测。研究分为两组：ELISA组（n=221）和MMP-7快速检测组（n=202）。
- **ELISA组（2021年11月至2023年5月）：**使用Human Total MMP-7 Quantikine ELISA Kit（R&D，美国）测量血清MMP-7水平。进行8倍和32倍稀释，结果>26 ng/mL视为阳性。ELISA检测每周进行一次或两次。
- **快速检测组（2023年6月至2024年12月：**使用MMP-7快速检测（TACRO，中国）进行检测，这是一种快速的即时荧光免疫层析测定方法。每个样本单独分析，血清样本稀释5倍后加入检测卡中。15分钟后读取结果。为确定MMP-7快速检测的最佳cut-off值，对200份回顾性血清样本进行了接收者操作特征（ROC）曲线分析和曲线下面积（AUC）计算。

**MMP-7快速检测cut-off值的确定：**
选择了2020年6月至2023年1月收集的回顾性样本来确定MMP-7快速检测的cut-off值。为减少分析前误差，要求样本在收集后立即分装、用干冰运输并保存在?80°C。只纳入未经历冷冻-解冻循环的样本。为确保定量准确性，使用8份由定量ELISA（R&D）交叉验证的参考血清样本校准MMP-7快速检测的标准曲线。所有研究样本还使用ELISA（R&D）进行了并行检测以验证一致性。

**结果：**
共622名婴儿接受了评估，其中423名被纳入分析，根据研究时间分为两组。快速检测组98名被诊断为BA，灵敏度为91.84%，阴性预测值为92.00%，与ELISA相当（灵敏度90.82%，阴性预测值91.74%）。快速检测在15分钟内提供结果，每次检测费用为14美元，而ELISA需要约3天，费用为70美元。

**统计分析：**
使用SPSS（v29.0）进行数据分析。缺失数据超过50%的患者被排除在外。为了确保估计MMP-7快速检测的灵敏度和特异性，样本量至少为175名。表2 - 包含的非胆道闭锁（BA）患者的疾病分布
疾病 患者数量
特发性胆汁淤积 64
胆总管囊肿 42
巨细胞病毒性肝炎 38
Alagille综合征 25
α-1-抗胰蛋白酶缺乏症 16
柠檬酸缺乏症 10
胆结石 8
Niemann-Pick病 5
Gilbert综合征 3
肝淤血相关性胆汁淤积 3
I型进行性家族性肝内胆汁淤积 2
梅毒性肝炎 2
关节挛缩、肾功能障碍和胆汁淤积综合征 2
肝豆状核变性 1
Dubin-Johnson综合征 1
乙型病毒性肝炎 1

缩写：BA，胆道闭锁

回顾性队列中的ROC分析
基于对200份回顾性血清样本的ROC分析（详细诊断分布见表3），确定了最佳临界值为>30 ng/mL。在该阈值下，MMP-7快速测试的灵敏度为93.28%，特异性为90.48%，AUC为0.968（95% CI 0.949–0.988）（补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C326）。

表3 - 回顾性样本的疾病分布
疾病 患者数量
胆道闭锁 98
特发性胆汁淤积 34
胆总管囊肿 21
巨细胞病毒性肝炎 20
Alagille综合征 10
α-1-抗胰蛋白酶缺乏症 5
柠檬酸缺乏症 4
胆结石 3
Gilbert综合征 2
乙型病毒性肝炎 1
肝淤血相关性胆汁淤积 1
Dubin-Johnson综合征 1

MMP-7快速测试试剂盒的诊断性能
MMP-7快速测试的分析性能，包括精度、胆红素干扰以及在不同储存条件下的样本稳定性，详见补充结果和补充图S3–S4（https://links.lww.com/HC9/C326）。图3显示了每位患者通过MMP-7快速测试和ELISA测得的相应血清MMP-7值。在快速测试组202名患者中，98名被最终诊断为BA。MMP-7快速测试正确分类了98名BA患者中的90名，灵敏度为91.84%（95% CI，86.42%–97.26%），特异性为104名患者中的92名[88.46%（95% CI，82.32%–94.60%）]，阳性预测值为102名患者中的90名[88.24%（95% CI，81.98%–94.49%]，阴性预测值为100名患者中的92名[92.00%（95% CI，86.68%–97.32%]，阳性比值比为7.96（95% CI，4.66–13.60），阴性比值比为0.09（95% CI，0.05–0.18）（表4）。

图3：通过MMP-7快速测试和ELISA测得的血清MMP-7水平比较。比较了BA患者和非BA患者的血清MMP-7水平，分别使用MMP-7快速测试（Q-BA，Q-non-BA）和ELISA（E-BA，E-non-BA）进行测量。红点代表单次测量结果。蓝线连接同一患者使用两种方法得到的成对测量结果。
缩写：BA，胆道闭锁；E-BA，ELISA胆道闭锁组；E-non-BA，ELISA非胆道闭锁组；ELISA，酶联免疫吸附测定；MMP-7，基质金属蛋白酶-7；non-BA，非胆道闭锁；Q-BA，快速测试胆道闭锁组；Q-non-BA，快速测试非胆道闭锁组。

表4 - MMP7快速测试和ELISA测试的性能特征
特征 快速测试 ELISA
敏感性 90/98 91.84 (86.42–97.26) 89/98 90.82 (85.10–96.53) 1.000
特异性 92/104 88.46 (82.32–94.60) 100/104 96.15 (92.46–99.85) 0.039
阳性预测值 90/102 88.24 (81.98–94.49) 89/93 95.70 (91.58–99.82) 0.020
阴性预测值 92/100 92.00 (86.68–97.32) 100/109 91.74 (86.58–96.91) 0.531
比值比 NA 7.96 (4.66–13.60) NA 23.61 (9.01–61.85)
阴性比值比 NA 0.09 (0.05–0.18) NA 0.10 (0.05–0.18)

缩写：ELISA，酶联免疫吸附测定；MMP-7，基质金属蛋白酶-7；NA，不适用。

将8例假阴性病例（<30 ng/mL）与真阳性队列（≥30 ng/mL）进行比较，发现中位年龄、胆红素或氨基转移酶水平没有显著差异。我们进一步按年龄将患者分组（<30天 vs. ≥30天）。尽管30天内新生儿中的假阴性病例比例高于真阳性队列（37.50% vs. 17.78%），但这种差异无统计学意义（p=0.182）（补充表S1，https://links.lww.com/HC9/C326）。然而，假阴性组的γ-GT水平显著较低。关于假阳性结果，在12名MMP-7水平升高的非BA患者中，8例被诊断为特发性胆汁淤积，2例为α-1-抗胰蛋白酶缺乏症，2例为胆总管囊肿。比较诊断性能后发现，ELISA方法的特异性高于MMP-7快速测试（96.15% vs. 88.46%，p=0.039），相应的阳性预测值也有差异（95.70% vs. 88.24%，p=0.020）。然而，排除BA的指标在两种方法之间较高且相当，包括敏感性（90.82% vs. 91.84%，p=1.000）和阴性预测值（91.74% vs. 92.00%，p=0.531）。通过贝叶斯分析进一步证明了其临床实用性；将测试的比值比与临床评估的预测试概率结合使用，显著提高了确认或排除BA的后的测试概率（补充表S2、S3，https://links.lww.com/HC9/C326，以及补充图S5，https://links.lww.com/HC9/C326）。

实施MMP-7快速测试还使得KPE的中位年龄显著提前（50天 vs. 57天；p=0.012）。在快速测试漏掉的8例中，有3例的误差范围在10%以内。对于这些患者，高临床怀疑度导致通过术中胆道造影立即进行了验证。其余5名患者通过标准临床协议得到诊断，中位时间为6天。与血清MMP-7水平低（通过ELISA检测）的10名BA患者对照组相比，中位诊断时间相同（6天）。这表明假阴性或临界快速测试结果并未延迟诊断或手术干预。快速测试在15分钟内提供结果，而ELISA工作流程需要中位3天（范围1–7天，因为需要批处理）。此外，快速测试具有经济优势。每次测试的成本为14美元，而标准实验室ELISA的成本为70美元。

讨论
在这项前瞻性、多中心诊断研究中，我们证明了MMP-7快速测试是一种准确的床旁检测工具，通过显著缩短BA的诊断时间来优化诊断流程。快速测试的临界值经过优化，以实现高灵敏度和阴性预测值，从而提高了其作为排除工具的实用性。测试的假阳性率为11.54%（12/104），这与某些报告一致，如胆总管囊肿或原因不明的胆汁淤积可能导致MMP-7水平升高。我们观察到假阴性率为8.16%（98例中的8例），这归因于多种因素。首先，40%（20例中的8例）的不一致结果位于诊断阈值的10%范围内（27–33 ng/mL），表明一些差异可能是由于测量变异性造成的。其次，较年幼婴儿的早期疾病阶段可能表现为初始水平较低，但随着时间推移会升高，这一点通过2例在一周后随访测试转为阳性的患者得到证实。我们的亚组分析还显示，新生儿（<30天）占假阴性病例的37.50%，而真阳性组中仅为17.78%，尽管这一趋势无统计学意义。基于此，建议对任何临床怀疑BA的婴儿即使在初始结果为阴性时也要在一周后重复测试。相反，持续的低MMP-7水平可能归因于生物学异质性，如特定的BA亚型或基因变异。值得注意的是，假阴性病例的γ-谷氨酰转移酶（GGT）水平显著较低。由于MMP-7是一种重塑因子，这种低MMP-7/低GGT的结合可能反映了广泛的细胞损伤状态，这会损害这些酶的合成和分泌。需要进一步研究以确定某些BA婴儿MMP-7水平不升高的具体生物学原因。对于这些病例，诊断不应依赖于单一指标，而应采用多模式方法以确保准确识别。尽管存在假阴性结果，但诊断时间与传统方案相当。这表明快速测试能够补充临床决策，而不会产生虚假的安全感。MMP-7快速测试解决了标准ELISA固有的关键后勤限制，因为生成标准曲线的高成本使得单患者测试不切实际。鉴于BA是一种罕见疾病，在许多中心的检测量相对较低，实验室通常依赖批量测试，导致诊断延迟。相比之下，快速测试能够进行经济有效的即时单患者测试，周转时间为15分钟。虽然阳性结果会促使加速进行BA特异性程序，但其高阴性预测值（92.00%）使儿科医生能够迅速排除该疾病，有效减轻了常常导致患者就诊过程延长的诊断不确定性。快速测试直接解决了这一挑战，提供了快速的风险分层。使用贝叶斯方法：对于预测试概率为40%的婴儿，阳性结果将后的BA概率提高到84.14%，而阴性结果将其降低到5.79%。这种确定性变化，结合测试的简单操作、易于阅读的结果和快速周转时间，有助于儿科医生做出更自信和及时的决策。此外，其成本优势和独立性使其成为全球应用的解决方案，特别是在资源有限的地区。我们的临界值（30 ng/mL）与标准ELISA临界值（>26.37 ng/mL）之间的轻微差异可归因于平台差异，如抗体表位识别的变化、液体和固相之间的相互作用以及不同的信号生成机制。尽管存在这些方法学差异，诊断性能仍然稳健。虽然MMP-7快速测试的灵敏度与ELISA相当，但我们观察到其特异性统计上较低（88.46% vs. 96.15%，p=0.039）。这种权衡通常在从实验室定量检测向快速侧向流动免疫测定过渡时存在。然而，在筛查像BA这样的危及生命的疾病时，优先事项是确保不遗漏任何可疑病例。阳性快速测试并不立即要求手术，而是作为一个关键信号，启动一个顺序工作流程，以便后续观察、排除非手术原因并进行最终确认。此外，大多数假阳性结果发生在患有严重肝内胆汁淤积的婴儿中，如α-1-抗胰蛋白酶缺乏症或严重的新生儿肝炎。在初级保健或社区环境中，这些婴儿不是“健康的假阳性”患者，而是需要专科转诊的高风险患者。

我们的研究存在局限性。首先，快速测试未能排除8例血清MMP-7水平较低的BA患者，这表明在存在强烈临床指标（如无胆汁粪便或GGT显著升高）的情况下，不应单独使用该测试。对于初始结果为阴性的婴儿，连续测试可能有价值。其次，我们的研究人群主要为汉族 Chinese，这可能限制了其普遍性，因为最近的报告显示MMP-7在西方人群中的表现可能不那么稳健。未来的研究应重点在初级保健环境中验证该测试，以确定其作为一线筛查工具的作用。此外，评估其在不同人群中的成本效益和性能对于指导广泛实施至关重要。

结论
总之，本研究验证了MMP-7快速测试作为一种快速有效的筛查工具，适用于门诊环境。通过提供早期风险分层，该测试优化了胆汁淤积婴儿的诊断流程。