CRISPLD2通过GRP78抑制HMGB1/TLR4轴介导的STING棕榈酰化作用，从而保护肝脏免受炎症和纤维化的侵害

《Holistic Nursing Practice》：CRISPLD2 protects against liver inflammation and fibrosis via GRP78 to repress HMGB1/TLR4 axis–mediated STING palmitoylation

　　**摘要（通俗语言总结）**

**背景**：由慢性炎症引起的肝纤维化仍然是多种肝脏疾病的主要驱动因素。然而，目前针对肝纤维化的有效治疗方法仍然有限。本文阐明了肝纤维化背后的复杂分子机制。

**方法**：将原代肝细胞与JS-1细胞共培养。通过ELISA检测炎症细胞因子水平。通过Western blotting和免疫组化染色检测肝纤维化标志物及目标分子的水平。利用酰基生物素交换（ABE）测定、共免疫沉淀（Co-IP）、邻近连接测定、生物素沉淀和GST沉淀等技术分析分子机制。通过免疫荧光染色观察分子的共定位和亚细胞定位。在小鼠中通过CCl4诱导肝纤维化，并用Masson Trichrome和Sirius Red染色进行检测。通过HE染色、血清ALT和AST水平评估肝损伤。

**结果**：高移动性组盒1（HMGB1）与Toll样受体4（TLR4）结合，促进干扰素基因刺激物（STING）的棕榈酰化，从而在体外引发肝细胞炎症和JS-1细胞活化。此外，富含半胱氨酸的分泌蛋白LCCL结构域蛋白2（CRISPLD2）阻断了HMGB1/TLR4介导的STING棕榈酰化及随后的肝纤维化。CRISPLD2通过招募78 kDa葡萄糖调节蛋白（GRP78），通过自噬-溶酶体途径触发TLR4降解。CRISPLD2处理通过抑制HMGB1/TLR4/STING途径缓解了CCl4诱导的炎症和肝纤维化。

**结论**：CRISPLD2通过与GRP78的相互作用，抑制HMGB1/TLR4途径，从而减轻肝细胞的炎症反应和纤维化。

**引入**：肝纤维化被认为是多种慢性肝脏疾病的最终阶段。如果没有有效控制，肝纤维化可能发展为肝硬化，这是全球第11大死亡原因。在肝脏损伤条件下，肝星形细胞被激活并释放多种促炎细胞因子，导致持续炎症。这种失控的炎症可能导致不可逆的损伤和最终的肝纤维化。因此，抑制炎症是减轻肝纤维化的有效策略。

**方法**：我们从肝癌切除术中收集非纤维化肝组织（n=5）和肝硬化术后肝活检中的肝纤维化组织（n=18）。取出后立即用液氮冷冻肝组织。所有实验均符合赫尔辛基宣言和伊斯坦布尔宣言的要求，并已获得中南大学第三湘雅医院伦理委员会的批准（批准号：2021-S278）。所有患者在手术前均签署了书面知情同意书。

**细胞培养和治疗**：从雄性C57BL/6J小鼠（8周龄；上海SLAC实验动物中心）中提取原代肝细胞，并用RPMI 1640培养基（Gibco，NY，美国）和10%胎牛血清（FBS；Gibco）进行培养。JS-1和HEK293T细胞从Procell（武汉，中国）购买，并用含有10% FBS的DMEM（Gibco）培养。原代肝细胞分别用5 μg/mL重组小鼠HMGB1蛋白（50913-M01H；北京Sino Biological）处理3、9、18、24和48小时，或用1、5、10和20 μg/mL重组小鼠CRISPLD2蛋白（CSB-YP805372MO；湖北武汉Cusabio）处理24小时。对照组原代肝细胞用20 μg/mL重组小鼠IgG3蛋白（51096-MNAH；北京Sino Biological）处理。CRISPLD2重新悬浮并溶解在磷酸盐缓冲 saline (PBS) 中。通过迁移测定评估纯化的CRISPLD2蛋白活性。在含有1.25×10^4个原代肝细胞的无血清培养基中放置Transwell膜，Transwell插入物放置在含有1、5、10和20 μg/mL CRISPLD2的24孔板中24小时。IgG3培养基作为阴性对照。通过台盼蓝排除法在实验前检测细胞活力。

**实验步骤**：
1. **细胞转染**：使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）将野生型STING（STING-WT）和突变型STING C64（STING-Mut或STING-C64A）转染到HEK293T细胞（每孔5×10^5个细胞）中。
2. **酶联免疫吸附测定（ELISA）**：使用Mouse IL-6 ELISA Kit（SEKM-0007）、Mouse IL-1β ELISA Kit（SEKM-0002；Solarbio，北京）和Mouse TNF-α ELISA Kit（SEKM-0034；Solarbio，北京）检测原代肝细胞和小鼠血清上清液中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。
3. **Western blotting**：使用蛋白质提取试剂盒（KGB5303；KeyGEN，南京）从原代肝细胞和JS-1细胞中提取总蛋白，并用BCA kit（KGB2101；KeyGEN）定量。蛋白样品通过SDS-PAGE分离，然后转移到聚烯丙基乙烯 fluoride膜上，用5% skim milk封闭1小时后，与针对α-SMA、FN、col1a1、CRISPLD2、TLR4、ATG3等 Primary 抗体孵育。
4. **酰基树脂辅助捕获（Acyl-RAC）**：将原代肝细胞裂解后，用NEM在50°C下封闭游离硫醇1小时。用70% acetone沉淀后，样品用1% SDS、1 mM EDTA、100 mM HEPES重悬。S-palmitoylated蛋白与Thiopropyl Sepharose（Sigma-Aldrich）结合，并在室温下旋转4小时。再用1% SDS、1 mM EDTA、100 mM HEPES冲洗后，用SDS-PAGE洗脱蛋白并通过Western blotting检测。
5. **酰基生物素交换（ABE）**：使用先前描述的方法检测STING的棕榈酰化。
6. **共免疫沉淀（Co-IP）**：将原代肝细胞用Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit（P0033；Beyotime，海门，中国）裂解。蛋白A/G磁珠分别与anti-LC3、anti-p62、anti-TLR4或anti-GRP78结合2小时。然后通过Western blotting检测免疫沉淀的蛋白。
7. **GST沉淀**：将GRP78片段插入pGEX-4T-1载体中，将重组质粒和pGEX-4T-1载体转化到大肠杆菌BL21中，并在20°C下用0.5 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）诱导重组蛋白表达过夜。细菌收获后离心，再用谷胱甘肽磁珠纯化蛋白。
8. **邻近连接测定（Co-IP）**：使用Duolink proximity ligation assay kit（DUO92007；Sigma-Aldrich）检测GRP78和TLR4蛋白之间的相互作用。
9. **动物模型**：雄性C57BL/6J小鼠（8周龄）随机分为对照组、CCl4组、CCl4+CRISPLD2组、CCl4+shNC组、CCl4+shSTING组、CCl4+shSTING+STING-WT组和CCl4+shSTING+STING-C64A组（每组n=6）。通过每周两次腹腔注射0.5 mL/g CCl4（Sigma-Aldrich，MO，美国）诱导肝纤维化。此外，每周三次静脉注射100 ng/g重组CRISPLD2蛋白。

**结论**：CRISPLD2通过招募GRP78抑制HMGB1/TLR4途径，从而减轻肝细胞的炎症反应和纤维化。腺相关病毒8型（AAV8）能够高效地促进外源基因在肝脏中的特异性表达。从Genomeditech（中国上海）购买了携带shNC、shSTING、STING-WT或STING-C64A的AAV8，并通过尾静脉注射的方式以1.5×10^11病毒的剂量注入每只小鼠体内。在最后一次注射CCl4后2天，对小鼠实施安乐死，并收集血液和肝脏组织。对肝脏组织进行组织病理学检查：将组织用4%的甲醛固定，嵌入石蜡中，切制成4微米的切片。使用Hematoxylin和Eosin（HE）染色试剂盒（G1120；Solarbio）观察肝脏组织的形态。根据先前的研究，使用0-3的评分标准对肝脏小叶炎症进行了半定量评估。根据制造商的说明，分别使用Masson Trichrome染色试剂盒（G1340；Solarbio）和Modified Sirius Red染色试剂盒（G1472；Solarbio）评估肝脏纤维化程度。使用ImageJ软件分析纤维化区域。血清生化检测：收集外周血样本，在4°C下以3000转/分钟的速度离心20分钟分离血清。通过自动生化分析仪（Sysmex BX-3010，日本神户）检测血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。免疫荧光染色：按照上述方法制备的肝脏切片首先在柠檬酸钠缓冲液中修复抗原，然后用0.2%的Triton X-100渗透处理，接着用2%的牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。原代肝细胞用4%的甲醛固定，用0.2%的Triton X-100渗透处理，并用2%的BSA封闭1小时。随后，将组织切片或原代肝细胞与抗LC3（ab192890，1:50；Abcam）、p62（ab109012，1:50；Abcam）、TLR4（MA5-16216，1:50；Thermo Fisher Scientific）、GRP78（MA5-27686，1:100；Thermo Fisher Scientific）和CRISPLD2（orb478011，1:100；Biorbyt，美国北卡罗来纳州）的一抗在4°C下孵育过夜。洗涤后，用山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488，ab150077，1:200；Abcam）或山羊抗鼠IgG H&L（Cy5，ab6563，1:100；Abcam）孵育1小时。用DAPI进行核染色后，在激光共聚焦显微镜下观察荧光。免疫组化染色：将肝脏切片脱蜡、复水并在柠檬酸钠缓冲液中修复抗原。恢复至室温后，将切片暴露在3%的H2O2中30分钟。随后，用正常的马血清封闭切片，并在4°C下与抗α-SMA（ab7817，1:50；Abcam）、FN（ab2413，1:50；Abcam）和col1a1（ab279711，1:50；Abcam）的一抗孵育过夜。应用生物素化二抗后，用DAB显色剂处理切片。数据统计：结果以3次独立实验的平均值±标准差（SD）表示。使用GraphPad Prism 8.0软件进行Student t检验（2组）或单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验（3组或更多组）。p值<0.05被认为具有统计学意义。

结果：HMGB1通过激活TLR4诱导肝细胞炎症反应和纤维化：为了评估HMGB1在肝脏纤维化中的作用，将用HMGB1重组蛋白处理的原代肝细胞与JS-1细胞共培养。HMGB1重组蛋白时间依赖性地增强了原代肝细胞释放促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α（图1A）。此外，HMGB1处理还时间依赖性地提高了JS-1细胞中肝脏纤维化标志物α-SMA、FN和col1a1的蛋白水平（图1B）。为了验证TLR4在HMGB1促纤维化功能中的作用，将TLR4抑制剂TAK-242与HMGB1重组蛋白一起加入原代肝细胞中。我们发现TAK-242部分抑制了HMGB1介导的IL-6、IL-1β和TNF-α的释放（图1C）。此外，TAK-242部分逆转了HMGB1在JS-1细胞中诱导的α-SMA、FN和col1a1的上调（图1D）。这些结果表明HMGB1/TLR4通路的激活导致了肝细胞炎症反应和纤维化。

图1：HMGB1/TLR4轴的激活诱导了肝细胞炎症反应和纤维化。(A) 原代肝细胞用5 μg/mL的HMGB1处理3、9、18、24和48小时。通过ELISA检测培养基中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。(B) JS-1细胞与用5 μg/mL HMGB1处理3、9、18、24和48小时的原代肝细胞共培养，通过Western blotting检测JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1蛋白含量。(C) 原代肝细胞加入5 μg/mL的HMGB1，并加入或不加入10 nM的TAK-242处理24小时，通过ELISA检测培养基中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。(D) 不同处理的原代肝细胞与JS-1细胞共培养，通过Western blotting分析JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1蛋白水平。n=3。进行单因素方差分析（ANOVA）以进行统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写：α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；ANOVA，方差分析；COL1A1，I型胶原蛋白α1链；ELISA，酶联免疫吸附测定法；FN，纤维连接蛋白；HMGB1，高迁移率蛋白组1；IL，白细胞介素；TNF-α，肿瘤坏死因子α。

HMGB1/TLR4轴促进了STING在C64位点的棕榈酰化，从而触发肝细胞炎症反应和纤维化：为了探讨HMGB1/TLR4轴在肝脏纤维化中的下游机制，我们关注了STING，这是一种调节肝脏纤维化的因子。通过ABE分析，HMGB1增强了原代肝细胞中STING的棕榈酰化水平，而这种变化被TAK-242减弱（图2A）。此外，棕榈酰化增强剂palmostatin B随着时间的延长增强了原代肝细胞中STING的棕榈酰化水平（图2C）。如图2D所示，预测小鼠和大鼠的STING蛋白在C64位点被棕榈酰化。STING-WT的转染显著提高了HEK293T细胞中STING的棕榈酰化水平，而在C64位点突变后这种效果消失（图2E）。此外，与突变型STING C64（STING-C64A）组相比，无论是否存在HMGB1给药，STING-WT转染都显著增加了IL-6、IL-1β和TNF-α的释放以及α-SMA、FN和col1a1的水平（图2F，G）。而且，STING下调降低了原代肝细胞上清液中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平，而STING-WT可以逆转这一效应，但STING-C64A没有这种效果（补充图S1A，https://links.lww.com/HC9/C330）。此外，STING沉默降低了JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1表达，而STING-WT逆转了这一变化，而不是STING-C64A（补充图S1B，https://links.lww.com/HC9/C330）。在体内实验中，STING耗尽减轻了CCl4暴露引起的肝脏组织的明显病理变化和纤维化（补充图S2A，https://links.lww.com/HC9/C330）、血清ALT和AST水平的升高（补充图S2B，https://links.lww.com/HC9/C330）、纤维化标志物（α-SMA、FN和col1a1）（补充图S2C，https://links.lww.com/HC9/C330）以及炎症细胞因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）（补充图S2D，https://links.lww.com/HC9/C330）；然而，shSTING的抑制作用被STING-WT中和，但不是STING-C64A。总之，HMGB1/TLR4通路的激活在C64位点棕榈酰化了STING，导致了炎症反应和肝脏纤维化。

图2：STING在C64位点的棕榈酰化参与了HMGB1/TLR4轴介导的肝细胞炎症反应和纤维化。(A) 原代肝细胞用5 μg/mL的HMGB1处理3、9、18、24和48小时。通过ELISA检测培养基中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。(B) JS-1细胞与用5 μg/mL HMGB1处理3、9、18、24和48小时的原代肝细胞共培养，通过Western blotting检测JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1蛋白含量。(C) 原代肝细胞加入5 μg/mL的HMGB1，并加入或不加入10 nM的TAK-242处理24小时，通过ELISA检测培养基中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。(D) 不同处理的原代肝细胞与JS-1细胞共培养，通过Western blotting分析JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1蛋白水平。n=3。进行单因素方差分析（ANOVA）以进行统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写：α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；ANOVA，方差分析；COL1A1，I型胶原蛋白α1链；ELISA，酶联免疫吸附测定法；FN，纤维连接蛋白；HAM，羟胺；HMGB1，高迁移率蛋白组1；IL，白细胞介素；TNF-α，肿瘤坏死因子α。

CRISPLD2通过抑制STING的棕榈酰化阻断了HMGB1/TLR4轴介导的肝细胞炎症反应和纤维化：CRISPLD2已被确定为HMGB1/TLR4通路的抑制剂。我们进一步验证了CRISPLD2是否会影响HMGB1/TLR4介导的STING棕榈酰化。首先，我们通过Transwell迁移实验验证了CRISPLD2的活性。如补充图S3所示（https://links.lww.com/HC9/C330），与IgG3处理的细胞相比，1、5、10和20 μg/mL的CRISPLD2促进了细胞通过Transwell膜迁移，表明CRISPLD2蛋白的功能或活性得以保持。如图3A所示，CRISPLD2重组蛋白的共处理浓度依赖性地减少了HMGB1诱导的原代肝细胞释放的IL-6、IL-1β和TNF-α。此外，随着CRISPLD2重组蛋白浓度的增加，与HMGB1处理的原代肝细胞共培养的JS-1细胞中α-SMA、FN和col1a1的表达逐渐降低（图3B）。值得注意的是，CRISPLD2重组蛋白以剂量依赖的方式抑制了HMGB1介导的原代肝细胞中的STING棕榈酰化（图3C）。因此，CRISPLD2通过抑制HMGB1/TLR4介导的STING棕榈酰化来保护肝细胞免受炎症反应和纤维化。

图3：CRISPLD2使HMGB1/TLR4轴失活，从而抑制STING的棕榈酰化，进而抑制肝细胞炎症反应和纤维化。用1、5、10和20 μg/mL的CRISPLD2进一步刺激HMGB1处理的原代肝细胞24小时后，与JS-1细胞共培养。(A) 通过ELISA检测原代肝细胞上清液中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。(B) 通过Western blotting检测JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1蛋白含量。(C) 通过ABE检测原代肝细胞中STING的棕榈酰化水平。细胞加入羟胺（+HAM）缓冲液或裂解缓冲液（-HAM）。PALM-STING，STING棕榈酰化。(D) 不同物种中STING蛋白序列的保守性分析。(E) HEK293T细胞转染STING-WT或STING-C64A，通过Acyl-RAC测定STING的棕榈酰化水平。用携带STING-WT或STING-C64A的慢病毒感染原代肝细胞，并用5 μg/mL的HMGB1处理，随后与JS-1细胞共培养。(F) 通过ELISA检测原代肝细胞上清液中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。(G) 通过Western blotting检测JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1蛋白含量。n=3。进行单因素方差分析（ANOVA）以进行统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写：ABE，酰基-生物素交换；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；ANOVA，方差分析；COL1A1，I型胶原蛋白α1链；ELISA，酶联免疫吸附测定法；FN，纤维连接蛋白；HAM，羟胺；HMGB1，高迁移率蛋白组1；2-BP，2-溴棕榈酸；STING，干扰素基因刺激因子；STING-WT，野生型STING。

CRISPLD2通过抑制STING的棕榈酰化阻断了HMGB1/TLR4轴介导的肝细胞炎症反应和纤维化：CRISPLD2已被确定为HMGB1/TLR4通路的抑制剂。我们进一步验证了CRISPLD2是否会影响HMGB1/TLR4介导的STING棕榈酰化。首先，我们通过Transwell迁移实验验证了CRISPLD2的活性。如补充图S3所示（https://links.lww.com/HC9/C330），与IgG3处理的细胞相比，1、5、10和20 μg/mL的CRISPLD2促进了细胞通过Transwell膜的迁移，支持CRISPLD2蛋白的功能或活性。如图3A所示，CRISPLD2重组蛋白的共处理依赖浓度地减少了HMGB1诱导的原代肝细胞释放的IL-6、IL-1β和TNF-α。此外，与HMGB1处理的原代肝细胞共培养的JS-1细胞中增加的α-SMA、FN和col1a1表达随着CRISPLD2重组蛋白浓度的增加而逐渐降低（图3B）。值得注意的是，CRISPLD2重组蛋白以剂量依赖的方式抑制了HMGB1介导的原代肝细胞中的STING棕榈酰化（图3C）。因此，CRISPLD2通过抑制HMGB1/TLR4介导的STING棕榈酰化来保护肝细胞免受炎症反应和纤维化。

图3：CRISPLD2使HMGB1/TLR4轴失活，从而抑制STING的棕榈酰化，从而抑制肝细胞炎症反应和纤维化。用1、5、10和20 μg/mL的CRISPLD2进一步刺激HMGB1处理的原代肝细胞24小时后，与JS-1细胞共培养。(A) 通过ELISA检测原代肝细胞上清液中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。(B) 通过Western blotting检测JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1蛋白含量。(C) 通过ABE检测原代肝细胞中的STING棕榈酰化水平。细胞加入羟胺（+HAM）缓冲液或裂解缓冲液（-HAM）。PALM-STING，STING棕榈酰化。(D) 不同物种中STING蛋白序列的保守性分析。(E) HEK293T细胞转染STING-WT或STING-C64A，通过Acyl-RAC测定STING的棕榈酰化水平。用携带STING-WT或STING-C64A的慢病毒感染原代肝细胞，并用5 μg/mL的HMGB1处理，随后与JS-1细胞共培养。(F) 通过ELISA检测原代肝细胞上清液中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。(G) 通过Western blotting检测JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1蛋白含量。n=3。进行单因素方差分析（ANOVA）以进行统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写：ABE，酰基-生物素交换；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；ANOVA，方差分析；COL1A1，I型胶原蛋白α1链；ELISA，酶联免疫吸附测定法；FN，纤维连接蛋白；HAM，羟胺；HMGB1，高迁移率蛋白组1；2-BP，2-溴棕榈酸；STING，干扰素基因刺激因子；STING-WT，野生型STING。

CRISPLD2通过自噬-溶缩写：ANOVA，方差分析；ATG，自噬相关蛋白；CQ，氯喹；Co-IP，共免疫沉淀；CRISPLD2，富含半胱氨酸的分泌蛋白LCCL结构域2；HMGB1，高迁移率室蛋白1；LC3，微管相关蛋白1轻链3；MG132，蛋白酶体抑制剂；TLR4，Toll样受体4。

CRISPLD2促进了GRP78从细胞质向细胞膜的转运。生物信息学预测CRISPLD2可能与GRP78相互作用。因此，我们旨在研究CRISPLD2在原代肝细胞中对GRP78的调节作用。Western blotting结果表明，经过CRISPLD2、HMGB1或其组合处理后，肝细胞中的GRP78蛋白含量没有变化（图5A）。CRISPLD2处理促进了肝细胞中CRISPLD2和GRP78蛋白之间的相互作用，而HMGB1的共同给药则减弱了这种相互作用（图5B）。此外，生物素拉下实验显示CRISPLD2直接与原代肝细胞细胞膜中的GRP78结合（图5C）。GST拉下实验进一步验证了CRISPLD2和GRP78之间的直接相互作用（补充图S5A，https://links.lww.com/HC9/C330）。此外，CRISPLD2还促进了细胞膜中CRISPLD2和GRP78蛋白之间的相互作用，但这种效应被HMGB1削弱（图5D）。通过免疫荧光染色观察到CRISPLD2处理后的原代肝细胞中CRISPLD2和GRP78蛋白的共定位（图5E）。此外，GRP78主要表达在肝细胞的细胞质中，CRISPLD2处理促进了GRP78从细胞质向细胞膜的转运；然而，HMGB1的共同处理部分抑制了CRISPLD2介导的GRP78的细胞膜转运（图5F）。总体而言，CRISPLD2/HMGB1轴调节了原代肝细胞中GRP78的细胞膜转运。

图5：CRISPLD2促进了GRP78的细胞膜转运。原代肝细胞暴露于5 μg/mL HMGB1、10 μg/mL CRISPLD2或其组合。（A）通过Western blotting分析GRP78蛋白水平。（B）通过Co-IP评估CRISPLD2和GRP78蛋白之间的相互作用。（C）通过生物素拉下实验验证CRISPLD2与原代肝细胞细胞膜中GRP78蛋白的结合。（D）Co-IP验证了细胞膜中CRISPLD2和GRP78蛋白之间的相互作用。（E）通过免疫荧光染色观察到CRISPLD2处理后的原代肝细胞中CRISPLD2和GRP78的共定位（比例尺=25 μm）。（F）通过免疫荧光染色评估原代肝细胞中GRP78的亚细胞定位，细胞膜用WGA染色标记（比例尺=25 μm）。n=3。进行单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。

CRISPLD2招募GRP78来降解TLR4，从而抑制STING棕榈酰化介导的肝细胞炎症反应和纤维化。为了验证GRP78在CRISPLD2介导的对抗肝纤维化保护中的作用，在原代肝细胞中敲低了GRP78。通过Western blotting验证了shGRP78的沉默效率（图6A）。Co-IP实验显示，GRP78敲低后，CRISPLD2诱导的肝细胞中GRP78和CRISPLD2之间的相互作用减弱（图6B）。此外，GRP78缺乏削弱了CRISPL2存在下细胞膜中CRISPLD2和GRP78蛋白之间的相互作用（图6C，D）。此外，经过CRISPL2处理后，GRP78从细胞质转运到细胞膜，而GRP78沉默减少了这种转运（图6E）。邻近连接实验验证了CRISPLD2在肝细胞中招募GRP78到TLR4（补充图S5B，C，https://links.lww.com/HC9/C330）。此外，Co-IP实验证明CRISPLD2重组蛋白处理增强了肝细胞中GRP78与TLR4的结合（补充图S5D，https://links.lww.com/HC9/C330）。此外，GRP78耗竭消除了CRISPLD2诱导的ATG7和LC3 II/I比值的上调以及TLR4和p62的下调（图6F）。GRP78缺乏抑制了CRISPLD2介导的TLR4与LC3或p62的结合（图6G和补充图S6A，https://links.lww.com/HC9/C330）。在HMGB1处理的肝细胞中，shGRP78部分逆转了CRISPLD2对STING棕榈酰化的抑制（补充图S6B，https://links.lww.com/HC9/C330）。因此，GRP78敲低抵消了HMGB1存在下CRISPLD2介导的原代肝细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的释放（补充图S6C，https://links.lww.com/HC9/C330），以及JS-1细胞中的α-SMA、FN和col1a1表达（补充图S6D，https://links.lww.com/HC9/C330）。接下来，我们在人类肝活检样本中检测了CRISPLD2、GRP78和STING棕榈酰化的表达，并评估了它们之间的相关性。我们发现，与正常非纤维化肝样本相比，肝纤维化样本中的CRISPLD2和GRP78水平较低，而STING蛋白水平和STING棕榈酰化水平较高（补充图S7A，https://links.lww.com/HC9/C330）。此外，肝纤维化样本中CRISPLD2和GRP78的水平与STING棕榈酰化水平呈负相关（补充图S7B，https://links.lww.com/HC9/C330）。上述观察结果表明，CRISPLD2在细胞膜中与GRP78相互作用，导致TLR4降解，从而抑制STING棕榈酰化，减轻肝细胞炎症反应和纤维化。

图6：CRISPLD2与GRP78相互作用，导致TLR4降解，从而抑制STING棕榈酰化介导的肝细胞炎症反应和纤维化。（A）感染携带shNC或shGRP78的慢病毒的原代肝细胞中GRP78蛋白水平的Western blotting分析。（B）通过Co-IP分析CRISPLD2与GRP78蛋白的结合。（C，D）通过生物素拉下和Co-IP实验验证细胞膜中CRISPLD2和GRP78蛋白之间的相互作用。（E）通过免疫荧光染色观察原代肝细胞中GRP78的亚细胞定位（比例尺=25 μm）。（F）Western blotting分析TLR4、ATG7、LC3 II/I和p62蛋白水平。（G）Co-IP评估TLR4与LC3或p62的结合。n=3。进行学生t检验（对于A）和单因素方差分析（对于B-G）进行统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写：ANOVA，方差分析；ATG7，自噬相关蛋白7；Co-IP，共免疫沉淀；CRISPLD2，富含半胱氨酸的分泌蛋白LCCL结构域2；GRP78，78 kDa葡萄糖调节蛋白；LC3，微管相关蛋白1轻链3；shNC，非靶向短发夹RNA对照；shGRP78，靶向GRP78的短发夹RNA；STING，干扰素基因刺激因子；TLR4，Toll样受体4。

CRISPLD2在体内抑制了炎症反应和肝纤维化。最后，在体内评估了CRISPLD2对肝纤维化的影响。组织病理学检查显示，CCl4暴露导致肝脏出现明显的病理变化和纤维化，而CRISPL2处理可以缓解这些变化（图7A，B）。CRISPLD2处理组中CCl4挑战小鼠的血清ALT和AST水平升高被消除（图7C）。此外，CCl4刺激的肝脏中细胞膜CRISPLD2和GRP78蛋白、TLR4以及LC3或p62蛋白的共定位减少，这种变化部分被CRISPL2逆转（图7D，E）。此外，CCl4暴露小鼠的肝组织中STING棕榈酰化水平升高，而CRISPL2抑制了这种升高（图7F）。正如预期的那样，CRISPL2抑制了CCl4响应中的炎症细胞因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）和纤维化标志物（α-SMA、FN和col1a1）的水平（图7G，H）。总之，CRISPL2缓解了体内的炎症反应和肝纤维化。

图7：CRISPLD2在体内缓解了炎症和肝纤维化。CCl4挑战的小鼠接受了重组蛋白CRISPL2的治疗。（A）通过HE染色评估肝脏的病理变化（比例尺=50 μm）。（B）通过Masson Trichrome和Sirius Red染色检查肝纤维化（比例尺=50 μm）。（C）评估血清ALT和AST水平。（D，E）通过免疫荧光染色评估肝脏组织中CRISPLD2和GRP78、TLR4或p62的共定位（比例尺=50 μm）。（F）通过ABE实验分析肝脏中的STING棕榈酰化水平。样品添加了羟胺（+HAM）缓冲液或裂解缓冲液（?HAM）。Palm-STING，STING棕榈酰化。（G）通过ELISA检测血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平。（H）通过免疫组化染色检查肝脏组织中的α-SMA、FN和col1a1表达（比例尺=50 μm）。n=6。进行单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写：ABE，酰基-生物素交换；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；ANOVA，方差分析；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸氨基转移酶；COL1A1，I型胶原α1链；CRISPLD2，富含半胱氨酸的分泌蛋白LCCL结构域2；ELISA，酶联免疫吸附试验；FN，纤维连接蛋白；GRP78，78 kDa葡萄糖调节蛋白；HAM，羟胺；HE，苏木精和伊红；LC3，微管相关蛋白1轻链3；Palm-STING，STING棕榈酰化；STING，干扰素基因刺激因子；TLR4，Toll样受体4。

讨论：肝纤维化仍然是一个全球性的健康问题，可能导致终末期肝病，包括肝硬化和癌症。目前，尚缺乏有效的治疗肝纤维化的药物。炎症被认为是肝纤维化的关键促成因素。抑制炎症为延缓肝纤维化的进展提供了一种有希望的方法。我们的数据表明，CRISPL2招募GRP78来阻断HMGB1/TLR4途径介导的STING棕榈酰化，从而抑制炎症，减轻肝纤维化。这些结果突显了CRISPL2对肝纤维化的有益效果，表明其在终末期肝病中的治疗潜力。作为重要的炎症介质，HMGB1在慢性炎症期间被激活，并是肝纤维化的主要驱动因素。TLR4是HMGB1的模式识别受体之一。已经证明HMGB1与TLR4结合会触发炎症，从而加剧肝纤维化。我们的发现表明，TLR4抑制剂TAK-242可以减轻HMGB1诱导的肝细胞炎症反应和纤维化。然而，HMGB1/TLR4途径促进肝纤维化的具体机制仍不清楚。研究已确定STING是肝炎症的关键因素。棕榈酰化在STING的激活中起关键作用。因此，STING棕榈酰化已成为STING依赖性疾病治疗的潜在靶点。在本研究中，我们发现HMGB1/TLR4途径导致STING在C64位点的棕榈酰化，激活STING并驱动炎症反应和肝纤维化。我们的发现为STING棕榈酰化作为HMGB1/TLR4轴在肝纤维化中的下游机制提供了新的证据。CRISPL2具有两个具有LPS结合亲和力的LCCL结构域，这些结构域已被证明可以防止内毒素休克。此外，CRISPL2在多种炎症相关疾病中具有抗炎能力，而不依赖于LPS结合，例如肝纤维化、哮喘和肺纤维化。值得注意的是，CRISPL2可以在肝纤维化期间减轻HMGB1引发的炎症。我们的结果与先前的研究一致，并进一步发现CRISPL2通过抑制HMGB1/TLR4途径来抑制STING棕榈酰化，从而抑制肝细胞炎症反应和纤维化。因此，我们的发现首次证明了CRISPL2通过抑制HMGB1/TLR4/STING轴来发挥抗炎作用。尽管我们的观察到CRISPL2抑制了HMGB1/TLR4/STING介导的肝炎症反应，但这一过程的潜在机制尚不清楚。GRP78是一种内质网应激相关因子，在细胞表面表达并在激活后释放到细胞外空间。先前的研究记录了GRP78可以促进TLR4向溶酶体的转移以进行降解。自噬被认为是溶酶体降解的调节机制。Wu等人报告称，分泌的GRP78通过髓系细胞中的选择性自噬促进TLR4的降解。在这项工作中，CRISPL2招募并促进了GRP78的细胞膜转运，并诱导选择性自噬来降解原代肝细胞中的TLR4，从而抑制STING棕榈酰化，保护肝细胞免受炎症反应和纤维化的影响。已有报道指出，CRISPL2可以通过多种途径发挥其抗纤维化作用。例如，CRISPL2给药通过miR-155抑制肝纤维发生期间的HMGB1诱导的炎症。另一项工作记录了CRISPL2通过44/42MAPK途径影响胎儿肺泡细胞的扩张和迁移。到目前为止，其他细胞外相互作用是否参与CRISPL2介导的肝炎症和纤维化抑制尚不清楚。在未来的研究中，我们将关注这一问题。总之，我们的数据表明，CRISPL2通过自噬介导的TLR4降解和随后的STING棕榈酰化抑制来缓解肝纤维化。我们的观察确定了CRISPLD2/TLR4/ST轴在肝细胞炎症反应和纤维化中的关键调节作用，并为肝纤维化新疗法的开发提供了理论基础。然而，我们的发现需要在未来的临床样本中进行评估和验证。