脂质代谢在口蹄疫病毒（FMDV）复制中的机制性作用

《Veterinary Research》：Mechanistic role of lipid metabolism in foot-and-mouth disease virus (FMDV) replication

　　摘要：口蹄疫（FMD）是一种由口蹄疫病毒（FMDV）引起的高度传染性的动物疾病，主要影响猪、牛和羊等有蹄类动物。作为维持细胞稳态的核心代谢途径，脂质代谢经常被病毒通过代谢重编程机制劫持，以支持其感染周期。研究表明，正链单链RNA病毒可以重塑宿主细胞膜系统并调节脂质代谢网络，从而为其入侵和复制构建有利的微环境。然而，FMDV（也是一种正链单链RNA病毒）通过调节脂质代谢来促进病毒复制的分子机制尚未完全阐明。在本研究中，我们发现抑制参与脂质代谢途径的关键酶可以显著抑制FMDV的增殖。外源性补充这些关键酶催化的下游产物显著恢复了FMDV的复制，表明FMDV的复制依赖于脂质。此外，我们观察到FMDV感染后宿主细胞中肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）的蛋白表达显著上调。抑制这种酶导致FMDV复制显著减少，表明FMDV可能通过增强脂肪酸β-氧化途径为其复制提供能量。总之，本研究通过涉及针对脂质代谢途径中关键酶的抑制剂的多维实验，全面验证了脂质代谢在FMDV复制中的关键作用。这些发现为抗病毒药物的开发以及FMD的预防和控制提供了新的理论见解。

引言：口蹄疫（FMD）是一种由口蹄疫病毒（FMDV）引起的急性且高度传染性的动物疾病，主要感染猪、牛和羊等有蹄类动物[1]。尽管该病毒通常对成年动物无害，但对幼体动物具有高致死率。一旦爆发，将导致巨大的经济损失[2]；因此，世界动物卫生组织（WOAH）将FMDV列为A类动物疾病。FMDV是一种属于小RNA病毒科（Picornaviridae）Aphthovirus属的正链单链RNA病毒[3, 4]。由于实施控制措施的成本高昂以及由此对动物产品出口的限制，FMDV的爆发可能对农业和畜牧业经济造成毁灭性影响。目前，疫苗接种仍然是FMDV预防和控制的主要措施。虽然疫苗在FMD预防和控制中起着关键作用，但它们存在局限性，包括不同血清型之间缺乏交叉保护、免疫保护持续时间有限以及生产成本高。因此，迫切需要突破传统的预防和控制方法，探索新的抗FMDV药物或替代的预防和控制策略。最近的研究表明，多种RNA病毒感染宿主细胞会诱导宿主细胞脂质代谢的改变，包括脂肪酸从头合成的增强、脂滴（LDs）的显著积累或耗竭以及脂肪酸转运的加速[5]。正链单链RNA病毒如西尼罗河病毒（WNV）[6]、丙型肝炎病毒（HCV）[7]和人类免疫缺陷病毒（HIV）[8]会劫持宿主脂质代谢途径，从而重塑宿主细胞膜系统，为病毒入侵和复制建立有利的环境。众所周知，脂肪酸是细胞膜的基本结构成分。脂肪酸从头合成途径涉及一组关键酶，包括乙酰辅酶A（acetyl-CoA）羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FASN）、二酰甘油酰基转移酶1（DGAT-1）和CPT1A。在这些关键酶的催化下，脂肪酸从头合成途径产生长链脂肪酸棕榈酸、甘油三酯和脂滴（LDs）。其中，甘油三酯储存在脂滴中，在磷脂合成、能量产生、细胞膜生物发生和信号转导中发挥关键作用[9]。针对肠道病毒A71（EV-A71）[10]、经典猪瘟病毒（CSFV）[11]和登革热病毒（DENV）[12]的研究表明，抑制ACC和FASN（从头脂肪酸合成的关键酶）会显著减少病毒复制，表明脂质代谢与这些病毒的复制密切相关。脂滴作为细胞内能量储存和脂质代谢的中心枢纽。一些病毒可以诱导脂滴分解以释放丰富的游离脂肪酸（FFAs），然后将其运输到线粒体进行β-氧化并生成ATP。这一过程称为脂质吞噬[13]。例如，DENV感染通过促进脂质吞噬来加速脂肪酸β-氧化，从而产生ATP以支持病毒复制[14]。在寨卡病毒（ZIKV）感染期间，病毒劫持脂滴以获取病毒复制所需的能量和脂质来源[15]。EV-A71上调肉碱CPT1A的表达，以提高脂肪酸进入线粒体的运输效率，从而为病毒复制提供ATP[10]。此外，新兴证据表明，FMDV 2C蛋白的过表达会导致其定位到脂滴表面，并诱导脂滴在核周围区域的聚集[16]，这表明脂滴可能参与FMDV的复制周期。FMDV侵入宿主细胞后，与宿主细胞表面的受体结合，随后通过受体介导的内吞作用进入细胞，这一过程需要clathrin和脂质的支持。在FMDV感染的细胞中，内质网膜发生重塑，细胞质中出现许多新的囊泡结构。这些囊泡含有FMDV的非结构蛋白和宿主细胞因子，对FMDV复制的基本生物过程至关重要[17, 18]。这些囊泡的生物发生需要大量的脂肪酸，这表明宿主细胞脂质代谢途径与FMDV复制密切相关。基于这些观察结果，已经确定FMDV感染依赖于脂质，但FMDV操纵宿主脂质代谢的精确机制仍不清楚。在本研究中，我们深入探讨了脂质代谢途径在FMDV复制中的作用及其潜在机制。我们的结果表明，抑制从头脂肪酸合成途径中的关键酶（ACC和FASN），限制从头脂肪酸的产生，显著抑制了FMDV的复制。外源性补充这些关键酶催化的下游产物（马来酰-CoA和棕榈酸）显著恢复了FMDV的复制。我们还发现，抑制参与脂滴生成的DGAT-1同样显著抑制了FMDV的复制。添加诱导脂滴形成的油酸（OA）恢复了FMDV的复制，证实了脂滴生成对FMDV复制的重要性。此外，我们观察到抑制脂肪酸β-氧化的关键酶CPT1A显著抑制了FMDV的复制，表明脂肪酸β-氧化途径对FMDV复制的重要性。总之，从头脂肪酸合成中的关键酶（ACC和FASN）以及其他脂质代谢中的关键酶（DGAT-1和CPT1A）是FMDV复制的重要宿主因素，脂质代谢在FMDV复制中起着关键作用。

材料与方法：
细胞、病毒和试剂：
本研究中使用的FMDV O型株来自内蒙古呼和浩特的Bureau Veritas Biotechnology Co., Ltd.，所有涉及FMDV的实验均在生物安全等级III实验室进行。实验中使用的仓鼠肾成纤维细胞（BHK-21）由武汉Punosai生命科学技术有限公司提供。乙酰辅酶A羧化酶抑制剂TOFA（HY-100568）由MedChemExpress（MCE）提供；脂肪酸合成酶抑制剂C75（HY-12364）由MCE提供；马来酰-CoA（HY-115899）由MCE提供；棕榈酸（HY-N0830）由MCE提供；DGAT-1抑制剂A922500（HY-10038）由MCE提供；油酸（HY-N1446）由MCE提供；CPT1A抑制剂Etomoxir（HY-50202）和CP640186（HY-15259）由MCE提供；针对FMDV VP1蛋白（O型）的兔多克隆抗体（bs-41049R）由北京生物合成生物技术有限公司提供。

FMDV感染和扩增：
将BHK-21细胞接种在T75烧瓶中培养至70-80%的汇合度，然后用1毫升FMDV储备液接种。病毒吸附1-2小时后，丢弃接种物，加入15毫升病毒维持培养基（低血清MEM）继续培养。当70-80%的细胞在显微镜下显示明显的细胞病变效应（CPE）时，封闭烧瓶开口，并在-80℃下快速冷冻30分钟，然后在37℃的水浴中解冻。此冻融循环重复三次以裂解细胞。将细胞悬液离心，所得上清液分装到1.5毫升无菌离心管中，并在-80℃下长期保存。

病毒斑块测定：
将BHK-21细胞接种在6孔板中培养至60-70%的汇合度。然后向每个孔中加入500微升稀释的病毒溶液，在37℃下孵育1-2小时进行病毒吸附，之后丢弃接种物。将56℃融化的1.6%琼脂糖溶液与预先加热的2×Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）以1:1的比例混合（最终浓度为0.8%）。将混合物冷却至40℃后，向每个孔中加入2毫升混合物覆盖细胞单层。将板子在层流罩中放置15分钟使琼脂糖固化，然后转移到37℃的细胞培养箱中继续培养。当肉眼观察到可见斑块时，向每个孔中加入1毫升4%的甲醛固定4小时或过夜。移除琼脂糖覆盖层，然后用结晶紫染料对细胞单层进行染色20分钟。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗后，计数斑块数量以计算病毒滴度。

CCK-8细胞活力测定：
将BHK-21细胞接种在96孔板中培养至60-70%的汇合度。更换培养基后，将细胞分为三组：处理组（给予药物）、对照组（不给予药物）和空白对照组（不含细胞，只含细胞培养基），每组八个重复孔。处理12小时后，用PBS洗涤细胞。随后向每个孔中加入100微升最小必需培养基（MEM）和10微升CCK-8溶液，在37℃下黑暗中孵育1-2小时。在孵育期间，使用微孔板读取器在0.5小时、1小时和2小时间隔测量450nm处的光密度（OD）值。选择OD值在0.8到1.2之间的时间点进行最终数据记录。

引物设计：
使用国家生物技术信息中心（NCBI）的Primer-BLAST工具设计了针对目标基因保守区域的特异性引物，设计完成后，由Kingsley Bioscience and Technology Co.进行引物合成。引物序列和退火温度如下表所示。表1 引物序列和退火温度
表全尺寸

细胞RNA提取和逆转录
当T25培养瓶中的FMDV感染细胞显示出50%的细胞病变效应（CPE）时，丢弃培养基，并用PBS清洗细胞两次。随后加入1毫升Trizol试剂，混合物在室温下孵育5分钟，然后转移到离心管中。接着加入200微升氯仿，剧烈振荡30秒，再在室温下孵育5分钟。样品在4°C下以12,000 rpm的速度离心15分钟。小心收集上层水相，与等体积的异丙醇混合，在室温下孵育10分钟。再次在4°C下以12,000 rpm的速度离心10分钟后，弃去上清液。所得RNA沉淀物用1毫升预冷的75%乙醇洗涤，然后在4°C下以12,000 rpm的速度离心5分钟。弃去乙醇，并进行短暂离心以收集残留的乙醇，随后完全吸去。RNA沉淀物在室温下空气干燥5-10分钟，然后溶解在20微升无RNase的水中。使用NanoDrop分光光度计测定RNA的纯度（A260/A280比值=1.8-2.0），并将RNA样品储存在-80°C。根据Takara RR036A试剂盒的说明准备20微升逆转录（RT）反应体系，热循环程序为：37°C孵育15分钟→85°C孵育5秒→在4°C下保持。生成的互补DNA（cDNA）储存在-20°C以备后续使用。

基于荧光的定量聚合酶链反应（PCR）
以cDNA为模板，使用Takara定量实时PCR（qRT-PCR）试剂盒（RR430A）准备反应体系。充分混合后，用Roche LightCycler 480 II仪器进行qRT-PCR。

Western blot
当细胞达到70-80%的细胞密度时，加入250微升放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解缓冲液（含1% PMSF）进行细胞裂解。裂解产物在4°C下以12,000 rpm的速度离心20分钟，收集上清液。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度后，将样品储存在-80°C。准备8%的分离凝胶和5%的 stacking凝胶。蛋白质样品与5×loading buffer按4:1的比例混合，然后在95°C下变性5分钟。每个孔中加载20微克蛋白质。电泳在80 V下进行1小时，随后调整电压至120 V，直至溴酚蓝到达凝胶底部。切下目标蛋白质条带。PVDF膜用甲醇活化1分钟，按照“滤纸→凝胶→膜→滤纸”的顺序进行半干转移（参数根据目标蛋白质的分子量设置）。转移后的膜在室温下封闭10分钟，然后用含Tween 20的Tris缓冲液洗涤三次。加入一抗，膜在4°C下孵育过夜。在室温下与二抗孵育2小时后，用TBST洗涤三次（每次10分钟），并用增强化学发光（ECL）检测方法观察蛋白质条带。

Nile red分析
FMDV感染或药物处理的BHK-21细胞在室温下用4%甲醛固定15分钟。随后加入Nile red染色液（Beyotime，C2053S），在室温下暗处孵育20分钟。然后加入DAPI染色液（absin，abs47047616）染色细胞核10分钟。在485 nm的激发光下使用共聚焦显微镜观察绿色荧光。

数据统计
本实验使用GraphPad Prism 9.5.1软件重复至少三次，并进行t检验和单因素方差分析（ANOVA）。p值<0.05被认为具有统计学显著性（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001）。使用ImageJ软件进行平均荧光强度分析和Western blot灰度值分析。

结果
**脂肪酸从头合成途径对FMDV复制的影响**
ACC抑制剂TOFA抑制病毒复制
乙酰辅酶A羧化酶（ACC）是脂肪酸从头合成中的第一个关键酶，它催化乙酰辅酶A的羧基化生成丙二酰辅酶A（图1A）。TOFA是一种别构抑制剂，能有效抑制脂质生物合成[10, 19]。为了验证脂肪酸从头合成途径是否影响FMDV复制，BHK-21细胞先用TOFA预处理12小时，然后再与病毒共孵育12小时，并观察结果。Nile red荧光染色液是一种特异性脂质染料，可检测中性脂质并发出绿色荧光[20]，中性脂质主要储存在脂滴（LDs）中。染色结果显示，TOFA处理后绿色荧光显著减少，表明TOFA显著抑制了脂质生成（图1B）。此外，在5至45 μM的浓度范围内，TOFA对BHK-21细胞无细胞毒性（图1C）。显微镜观察发现，FMDV感染前用TOFA预处理可显著减轻CPE，且效果与剂量相关。在15 μM及以上浓度时，TOFA表现出明显的抗病毒活性，在30–45 μM浓度时CPE几乎消失（图1D）。RT-qPCR和Western blot结果显示TOFA处理显著减少了FMDV复制（图1E,F）。TOFA抑制FMDV复制50%的半有效浓度（EC50）为21.33 μM（图1G）。另一种ACC抑制剂CP640186也表现出显著的抗病毒活性，其EC50值为0.2021 μM，远低于TOFA，表明其抗FMDV效力更强（图1H）。斑块实验进一步证实，随着TOFA浓度的增加，斑块数量显著减少，在45 μM时几乎不形成斑块（图1I）。

**ACC对FMDV复制的影响**
A. 脂肪酸从头合成途径的研究路径图。
B. BHK-21细胞分别用30 μM TOFA、60 μM丙二酰辅酶A或30 μM TOFA加60 μM丙二酰辅酶A处理。固定后，细胞用Nile red染色，细胞核用DAPI标记（蓝色）。比例尺，20 μm。
C. BHK-21细胞用5–45 μM TOFA处理24小时，细胞存活率未见显著影响。
D. 在不同浓度的TOFA存在下，FMDV感染后的细胞病变效应（CPE）。
E. RT-qPCR证实TOFA处理抑制FMDV复制。
F. Western blot分析证实TOFA处理抑制FMDV复制。
G. TOFA在21.33 μM浓度时抑制FMDV复制50%（EC50）。
H. CP640186在0.2021 μM浓度时抑制FMDV复制50%（EC50）。
I. 病毒斑块实验表明TOFA处理显著减少FMDV复制。
J. BHK-21细胞用5–120 μM丙二酰辅酶A处理24小时，细胞存活率未见显著影响。
K. RT-qPCR显示，在15 μM TOFA存在下，添加0–45 μM丙二酰辅酶A可部分恢复FMDV复制。
L. Western blot分析证实，在45 μM TOFA存在下，添加60 μM丙二酰辅酶A可部分恢复FMDV VP1蛋白的表达。

为进一步确认TOFA对FMDV复制的抑制作用是由于ACC抑制导致下游脂质水平降低所致，补充了ACC催化反应的产物——丙二酰辅酶A。Nile red染色结果显示，补充丙二酰辅酶A显著增加了脂质积累（图1B）。使用CCK-8试剂盒检测不同浓度丙二酰辅酶A对BHK-21细胞存活率的影响，结果表明，5至120 μM范围内的丙二酰辅酶A对BHK-21细胞存活率无显著影响（图1J）。RT-qPCR和Western blot结果显示，添加丙二酰辅酶A显著恢复了FMDV复制（图1K,L）。

综上所述，ACC抑制剂TOFA能有效抑制BHK-21细胞中的FMDV复制，这种抑制作用与宿主脂肪酸从头合成的抑制有关。这一发现表明，针对宿主脂肪酸合成途径可能是抑制FMDV复制的潜在策略。

**FASN抑制剂C75对FMDV复制的影响**
FASN是脂肪酸从头合成途径中的第二个关键酶，它催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的逐步脱水和缩合生成16碳的棕榈酸（图1A）。C75是FASN的抑制剂，能显著抑制FASN的活性[21]。为了进一步验证脂肪酸从头合成途径是否影响FMDV复制，BHK-21细胞先用C75预处理12小时，然后再与病毒共孵育12小时，并观察结果。Nile red染色结果显示C75显著抑制了脂质生成（图2A）。此外，在5至45 μM的浓度范围内，C75对BHK-21细胞存活率无显著影响（图2B）。显微镜观察发现，C75在5 μM浓度时就开始发挥抗病毒活性，在30 μM时抗病毒效果明显，在45 μM时几乎无CPE，表明C75对FMDV具有很强的抗病毒作用（图2C）。RT-qPCR和Western blot进一步从基因和蛋白质水平验证了C75的抗病毒效果。结果证明，添加C75显著减少了FMDV复制（图2D,E）。此外，本研究还比较了TOFA和C75的抗病毒效力。如图2F所示，当C75和TOFA单独使用相同浓度时，TOFA的抑制效果更强，两者联合使用达到最佳抑制效果（图2F）。斑块实验进一步证实，随着C75浓度的增加，斑块数量显著减少，在45 μM时几乎不形成斑块（图2G）。

**结论**
综上所述，ACC抑制剂TOFA能有效抑制BHK-21细胞中的FMDV复制，这种抑制作用与宿主脂肪酸从头合成的抑制有关。这意味着针对宿主脂肪酸合成途径可能是抑制FMDV复制的有效策略。
**FASN抑制剂C75对FMDV复制的影响**
FASN是脂肪酸从头合成途径中的第二个关键酶，它催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的逐步脱水和缩合生成16碳的棕榈酸（图1A）。C75是FASN的抑制剂，能显著抑制FASN的活性[21]。为了进一步验证脂肪酸从头合成途径是否影响FMDV复制，BHK-21细胞先用C75预处理12小时，然后再与病毒共孵育12小时，并观察结果。Nile red染色结果显示C75显著抑制了脂质生成（图2A）。此外，在5至45 μM的浓度范围内，C75对BHK-21细胞存活率无显著影响（图2B）。显微镜观察发现，C75在5 μM浓度时开始发挥抗病毒活性，在30 μM时效果明显，在45 μM时几乎无CPE，表明C75对FMDV具有很强的抗病毒作用（图2C）。RT-qPCR和Western blot进一步验证了C75的抗病毒效果。结果表明，添加C75显著减少了FMDV复制（图2D,E）。此外，研究还比较了TOFA和C75的抗病毒效力。如图2F所示，当C75和TOFA以相同浓度单独使用时，TOFA的抑制效果更强，两者联合使用达到最佳抑制效果（图2F）。斑块实验进一步证实，随着C75浓度的增加，斑块数量显著减少，在45 μM时几乎不形成斑块（图2G）。这种方法常用于研究脂质滴（LDs）与病毒复制之间的关系[23, 24]。为了验证脂质滴是否是口蹄疫病毒（FMDV）复制的关键宿主因子，研究人员用DGAT-1抑制剂A922500处理BHK-21细胞。在病毒感染前，细胞先与A922500预孵育12小时，随后再次加入A922500，并与病毒共同孵育12小时，然后观察结果。尼罗红染色显示，经过A922500处理后，绿色荧光显著减少，表明A922500显著抑制了脂质的生成（图3A）。此外，在5至60 μM的浓度范围内，A922500对BHK-21细胞的存活率没有显著影响（图3B）。对BHK-21细胞中A922500抗病毒效果的显微观察显示，当浓度为5 μM时，A922500开始发挥抗病毒作用；在10–15 μM时，抗病毒效果进一步增强；当浓度增加到30 μM时，几乎观察不到明显的细胞病变效应（CPE）（图3C）。使用CCK-8试剂盒测定了A922500的EC50值，结果为11.86 μM，这意味着在该浓度下，A922500可以抑制50%的FMDV复制（图3D）。进一步通过RT–qPCR和Western blot实验在基因和蛋白质水平上验证了A922500的抗病毒效果。实验结果表明，与对照组相比，A922500处理以剂量依赖的方式减少了FMDV的复制（图3E,F）。斑块实验也得到了一致的结果，A922500处理组FMDV复制显著减少（图3G）。综上所述，DGAT-1抑制剂A922500能有效抑制BHK-21细胞中的FMDV复制，脂质滴是FMDV复制的关键宿主因子。

图3
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脂质滴对FMDV复制的影响。A．BHK-21细胞分别用30 μM A922500、60 μM油酸或30 μM A922500加60 μM油酸处理。固定后，用尼罗红染色。刻度尺，20 μm。B．BHK-21细胞用5–60 μM A922500处理24小时，细胞存活率没有显著变化。C．在不同浓度的A922500存在下，FMDV感染后的细胞病变效应（CPE）。D．A922500在11.86 μM浓度时抑制了50%的FMDV复制（EC50）。E．RT–qPCR证实A922500处理抑制了FMDV复制。F．Western blot分析验证A922500处理抑制了FMDV VP1蛋白的表达。G．病毒斑块实验表明A922500处理显著抑制了FMDV复制。H．BHK-21细胞用5–120 μM油酸处理24小时，细胞存活率没有明显变化。I．RT–qPCR显示，在15 μM A922500存在下，添加0–75 μM油酸部分恢复了FMDV复制。J．Western blot分析证实，在45 μM A922500存在下，添加60 μM油酸部分恢复了FMDV VP1蛋白的表达。
油酸（OA）是一种单不饱和长链脂肪酸，在自然界中广泛分布，是最常见的不饱和脂肪酸之一。当细胞吸收过量脂肪酸时，这些脂肪酸会被转化为中性脂质并储存在脂质滴中，从而避免游离脂肪酸（FFAs）的潜在毒性。为了进一步验证脂质滴形成与FMDV复制之间的关系，在含有A922500的培养基中添加油酸以诱导脂质滴的生成。尼罗红染色结果显示，油酸的添加显著增加了细胞内脂质积累（图3A）。为了排除油酸引起的细胞活力下降对实验结果的干扰，将BHK-21细胞与5至120 μM的油酸共同孵育24小时，然后检测细胞活力。结果表明，在5至120 μM的浓度范围内，油酸对BHK-21细胞的存活率没有显著影响（图3H）。通过RT–qPCR和Western blot实验在基因和蛋白质水平上验证了这一效果。结果显示，与对照组相比，A922500的抑制作用随着油酸浓度的增加而逐渐减弱（图3I,J）。

CPT1A对FMDV复制的影响
肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）是一种线粒体酶，它催化长链脂肪酸与肉碱结合形成酰基肉碱，使它们能够穿过线粒体内膜进入线粒体基质进行β-氧化。作为脂肪酸氧化的限速步骤，CPT1A在脂质代谢中起着关键作用[25]。在本研究中，我们发现FMDV感染细胞的CPT1A信使RNA（mRNA）和蛋白质表达水平显著升高，这表明CPT1A可能作为FMDV复制的宿主因子[图4A,G]。为了进一步探究CPT1A与FMDV复制之间的关系，我们使用了Etomoxir，这是一种不可逆的CPT1A抑制剂，可阻止长链脂肪酸进入线粒体进行β-氧化[25, 26]。尼罗红染色结果显示，Etomoxir处理显著增加了细胞内脂质积累，表明Etomoxir成功阻断了脂肪酸进入线粒体进行β-氧化（图4B,C）。使用CCK-8试剂盒评估了Etomoxir的细胞毒性，结果表明，在5至120 μM的浓度范围内，Etomoxir对BHK-21细胞的存活率没有显著影响（图4D）。对Etmoxir抗病毒效果的显微观察显示，在120 μM浓度下几乎观察不到明显的细胞病变效应（CPE），表明Etmoxir对FMDV具有强烈的抗病毒作用（图4E）。通过RT–qPCR和Western blot实验在mRNA和蛋白质水平上进一步验证了Etmoxir的抗病毒效果。结果显示，Etmoxir处理显著抑制了FMDV复制，且抑制效果随着Etmoxir浓度的增加而增强（图4F,G）。斑块实验也得到了一致的结果，进一步支持了CPT1A在FMDV复制中的关键作用（图4H）。综上所述，CPT1A抑制剂Etmoxir能有效抑制BHK-21细胞中的FMDV复制。

图4
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CPT1A对FMDV复制的影响。A．FMDV感染后CPT1A的表达显著升高。B、C．BHK-21细胞用60 μM Etomoxir处理。固定后，用尼罗红染色，并用DAPI（蓝色）标记细胞核。刻度尺，20 μm。D．BHK-21细胞用5–120 μM Etomoxir处理24小时，细胞存活率没有显著变化。E．在不同浓度的Etomoxir存在下，FMDV感染后的细胞病变效应（CPE）。F．RT–qPCR证实Etmoxir处理抑制了FMDV复制。G．Western blot分析验证Etmoxir处理抑制了FMDV复制。H．病毒斑块实验表明Etmoxir处理显著抑制了FMDV复制。

讨论
FMDV复制与脂质代谢密切相关，从头脂肪酸合成途径是脂质代谢途径的关键组成部分。其两种关键酶ACC和FASN的活性对细胞膜和各种脂质底物的合成至关重要。目前，这些酶已被广泛用作RNA病毒研究中的治疗靶点[11, 12, 27, 28]。在本研究中，我们使用了TOFA、C75和2-BP——分别抑制ACC、FASN和脂肪酸棕榈酰化的抑制剂——来验证从头脂肪酸合成途径在FMDV复制中的作用。结果表明，这三种抑制剂显著抑制了FMDV复制，这一发现与之前关于经典CSFV的研究一致，后者也具有单链正链RNA基因组[11]。值得注意的是，在含有TOFA或C75的培养基中补充各自的酶产物（TOFA的丙二酰辅酶A和C75的棕榈酸）可以消除病毒的抑制作用。这与早期研究结果一致，即丙二酰辅酶A和棕榈酸可以恢复被这些抑制剂抑制的CSFV复制[11]。总体而言，这些初步结果表明，与其他RNA病毒类似，FMDV复制依赖于宿主细胞的从头脂肪酸合成途径。
脂质滴是细胞中中性脂质储存的关键细胞器，也是脂质代谢的中心枢纽。它们不仅参与多种细胞过程，如脂质稳态、膜转运和信号转导[9]，还在病毒复制中起着重要作用[29]，例如作为病毒复制的能量来源。DENV感染后，会诱导自噬体的形成以促进脂质滴分解并释放游离脂肪酸（FFAs），这些FFAs随后进入线粒体生成ATP，为DENV复制提供能量[30]。关于严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的研究表明，使用DGAT-1（脂质滴生成的关键酶）抑制剂A922500处理可显著降低SARS-CoV-2的复制[24]，表明脂质滴是SARS-CoV-2复制的关键宿主因子。在本研究中，我们同样用A922500处理FMDV感染细胞，以研究脂质滴在FMDV复制中的作用。结果显示，A922500以剂量依赖的方式显著抑制了FMDV复制，这与SARS-CoV-2的研究结果一致。油酸（OA）是一种常见的单不饱和脂肪酸，可以诱导脂质滴的生成。在含有A922500的培养基中补充油酸会增加脂质滴的积累并恢复FMDV复制，这一结果也在ZIKV的研究中得到证实[31]。此外，有报道表明FMDV的2C蛋白与FMDV复制复合体中的脂质滴共定位，2C蛋白的过表达会导致脂质滴在细胞核周围积累[16]，这表明脂质滴可能受2C蛋白调控以参与FMDV复制。总体而言，这些结果表明，作为脂质代谢的中心枢纽，脂质滴参与了FMDV复制。
病毒基因组复制、蛋白质合成和病毒颗粒组装需要大量能量，而脂肪酸β-氧化途径可以为病毒复制提供能量。研究表明，DENV[30]、EVA-71[10]和BoHV-1[32]——这些RNA病毒——通过脂肪酸β-氧化途径进行复制。其中，EVA-71上调CPT1A蛋白表达，加速脂肪酸进入线粒体的速率，从而为其复制提供能量[10]。在本研究中，我们也观察到了类似现象：FMDV感染后CPT1A的mRNA和蛋白质表达水平显著升高，表明CPT1A可能作为FMDV复制的关键宿主因子。为了进一步确认CPT1A在FMDV复制中的作用，我们用Etmoxir（一种CPT1A抑制剂）处理细胞，观察其对FMDV复制的影响。结果显示，Etmoxir以剂量依赖的方式抑制了FMDV复制，这与之前的研究一致，即Etmoxir抑制了EVA-71[10]和BoHV-1[32]的复制[10]。综上所述，这些发现表明CPT1A是FMDV复制的关键宿主因子。
总之，本研究的数据表明，从头脂肪酸合成途径中的ACC和FASN、脂质滴生成中的关键酶DGAT-1以及脂肪酸β-氧化中的关键酶肉碱CPT1A都是FMDV复制的关键宿主因子。这些发现总结在一个工作模型中（图5）。抑制脂肪酸合成途径中的这两种关键酶会损害FMDV复制，表明FMDV复制依赖于从头脂肪酸合成途径。脂肪酸合成途径生成多种长链脂肪酸；其中，棕榈酸被酯化为棕榈酰辅酶A，作为棕榈酰化的底物，并可能参与FMDV蛋白的棕榈酰化修饰。其他脂肪酸由DGAT-1和其他酶催化生成甘油三酯，储存在脂质滴中。FMDV感染会上调CPT1A表达，促进脂肪酸进入线粒体，可能为FMDV复制提供能量。