《Genome Medicine》：Patient induced pluripotent stem cells identify specificities of a reticular pseudodrusen phenotype in age-related macular degeneration
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背景：年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致视力丧失的主要原因。网状假性玻璃膜疣（RPD）是沉积在视网膜色素上皮（RPE）顶端的一种独特且关键的AMD表型，但其分子基础及其与AMD中常规玻璃膜疣的关系仍不清楚。
方法：研究人员从仅包含常规玻璃膜疣患者（AMD/RP
背景：年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致视力丧失的主要原因。网状假性玻璃膜疣（RPD）是沉积在视网膜色素上皮（RPE）顶端的一种独特且关键的AMD表型，但其分子基础及其与AMD中常规玻璃膜疣的关系仍不清楚。
方法：研究人员从仅包含常规玻璃膜疣患者（AMD/RPD-）或同时存在玻璃膜疣和RPD的患者（AMD/RPD+）的临床表型队列中，生成了诱导多能干细胞（iPSC）来源的RPE细胞。为了识别两个队列间的差异，研究人员进行了单细胞转录组学、蛋白质组学、数量性状位点（QTL）和转录组全关联（TWAS）分析，并结合功能实验。
结果：与AMD/RPD-细胞相比，AMD/RPD+ RPE细胞表现出细胞外基质（ECM）和缺氧反应通路的富集，而线粒体和氧化磷酸化过程相对不足。遗传分析支持线粒体通路在整个AMD中的共同调控，并发现与RPD风险相关的额外调控信号。在功能上，所有RPE群体均在体外形成类玻璃膜疣沉积。AMD/RPD-细胞系产生更多的基底沉积，而AMD/RPD+细胞则表现出对单层破坏的易感性增加。
结论：这些发现表明，伴有和不伴有RPD的AMD代表了机制上不同的实体，并为AMD疾病异质性的分子机制提供了新见解。
一、研究背景、问题与研究意义
年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致视力丧失的主要疾病。其特征之一是玻璃膜疣的积累。然而，部分AMD患者会在视网膜色素上皮（RPE）顶端出现网状假性玻璃膜疣（RPD），这是一种与常规玻璃膜疣位置和性质不同的沉积。RPD的存在是AMD进展为晚期（包括地图样萎缩和脉络膜新生血管）的重要风险因素，并与显著的视功能损伤相关。现有证据表明，RPD的分子成分与常规玻璃膜疣虽有相似，但在脂质含量等方面存在显著差异，提示其形成可能涉及不同的分子通路。然而，RPD的分子基础及其与常规玻璃膜疣的确切关系尚不清楚，这阻碍了针对该表型的精准治疗。为了阐明AMD不同表型（特别是RPD）的分子机制，本研究利用患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）模型，结合多组学分析，旨在揭示AMD/RPD+与AMD/RPD-之间的内在差异，以期为理解AMD的疾病异质性提供新见解。本研究发表在《Genome Medicine》期刊。
二、主要关键技术方法
本研究的关键方法包括：1. 构建临床表型明确的患者来源iPSC-RPE模型：研究对象为来自澳大利亚眼研究中心、经多模态成像严格分型的AMD患者队列，包括仅具常规玻璃膜疣的个体（AMD/RPD-， n=56）和同时具有常规玻璃膜疣及广泛RPD的个体（AMD/RPD+， n=57）。获取皮肤成纤维细胞后，通过非整合型游离质粒重编程获得iPSC，并分化为功能性的RPE细胞。2. 多组学与遗传分析：对分化的RPE细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和基于串联质谱标签的蛋白质组学分析。利用患者基因分型数据进行表达数量性状位点（eQTL）、蛋白质数量性状位点（pQTL）和转录组全关联研究（TWAS）分析，探索遗传变异与分子表型的关联。3. 体外功能学验证：对RPE细胞进行跨上皮电阻测量、对光感受器外节（POS）的吞噬功能测定、A2E（一种脂褐素荧光团）处理以及类玻璃膜疣沉积的自动化定量分析，评估其生理和病理功能差异。
三、研究结果
生成iPSC、分化为RPE细胞及基因组分析
研究人员从AMD/RPD-和AMD/RPD+供体成功建立了iPSC系，并将其高效分化为RPE细胞。单细胞转录组分析鉴定出16个细胞亚群，包括神经元祖细胞、RPE祖细胞和不同成熟度的RPE细胞，两组间亚群分布频率相似。所有亚群均表达已知的AMD相关基因，但CFH和C3的表达在两组间无显著差异。
AMD/RPD+与AMD/RPD- RPE之间的差异基因表达
与AMD/RPD-细胞相比，AMD/RPD+ RPE细胞中有728个基因表达存在显著差异。其中458个基因上调，主要富集于细胞外基质（ECM）组织、细胞-底物粘附、缺氧反应、整合素与胶原结合等通路，如COL1A1、COL1A2、FN1、POSTN、HTRA1等基因表达增加。270个基因下调，主要涉及线粒体能量代谢过程，包括氧化磷酸化、电子传递链、细胞呼吸等，多个线粒体编码基因（如MT-ATP8、MT-ND家族基因）和核编码的复合物I亚基表达相对减少。通路富集分析进一步支持了AMD/RPD+中ECM/缺氧通路激活和AMD/RPD-中线粒体代谢通路相对活跃的两种截然不同的转录状态。
RPE中细胞亚群特异性的调控特征
研究人员在不同RPE亚群中进行了eQTL定位，共鉴定出436个显著的eQTL。其中一部分eQTL（如影响AP3S1、AIPL1、MSX2等基因的位点）的调控效应在AMD/RPD-和AMD/RPD+之间存在显著差异，表明遗传变异对基因表达的调控具有疾病表型特异性。然而，已报道的与RPD风险相关的SNP（如ARMS2/HTRA1位点的rs11200638等）在本研究的eQTL分析中未显示显著关联，提示观察到的HTRA1表达升高可能并非由这些已知风险等位基因直接驱动。
AMD/RPD+与AMD/RPD- RPE之间的差异蛋白质表达
蛋白质组学分析在AMD/RPD+和AMD/RPD-之间鉴定出715个差异表达蛋白。其中502个蛋白在AMD/RPD+中上调，主要涉及ECM组织、细胞骨架调节和膜信号传导，如COL1A1、COL1A2、FN1、HTRA1、ANXA2等。213个蛋白在AMD/RPD+中下调，主要富集于RNA剪接/mRNA加工通路（如SNRNP70、RBM8A等）和线粒体代谢/氧化磷酸化通路（如多个ATP合成酶和NADH脱氢酶复合物亚基）。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析进一步证实了这些功能模块的聚集。值得注意的是，HTRA1蛋白水平在AMD/RPD+中也显著升高，与转录组数据一致。
TWAS和pQTL分析揭示了RPD风险的共享和特异性调控机制
研究人员利用已发表的RPD特异性GWAS汇总统计数据进行了TWAS分析。结果显示，在RPE细胞中，与RPD风险显著相关的基因主要富集于细胞粘附和ECM组织通路，如FN1、POSTN、HTRA1等，这些基因在AMD/RPD+细胞中也呈现高表达。pQTL分析发现了89个显著的pQTL，其中4个（如影响SEPTIN2和POLDIP2的位点）与RPD GWAS信号共定位，提示这些位点可能通过调控蛋白丰度来影响RPD风险。这些分析支持了线粒体通路调控是AMD的共享机制，而ECM/粘附相关通路的额外调控则与RPD风险特异相关。
AMD/RPD+ RPE细胞表现出单层完整性的功能缺陷
功能实验表明，所有组的iPSC-RPE细胞在体外培养中均能形成被载脂蛋白E（APOE）阳性的类玻璃膜疣沉积。定量分析显示，AMD/RPD-细胞产生的基底沉积体积更大。然而，在长期培养或经脂褐素成分A2E处理后，AMD/RPD+细胞表现出更高的单层脱落或破坏发生率，提示其细胞-基质粘附存在固有脆弱性。跨上皮电阻测量和光感受器外节吞噬功能在两组间无显著差异。
四、讨论与结论总结
本研究的讨论部分强调了利用患者来源iPSC模型结合多组学方法在剖析AMD疾病异质性方面的价值。结果证实，伴有RPD的AMD代表了一种在分子和功能上均有别于仅具常规玻璃膜疣的AMD的独特实体。AMD/RPD+ RPE的核心特征在于ECM重塑和缺氧反应通路的异常激活，以及潜在的细胞粘附缺陷，这可能是其临床进展风险更高的基础。相反，AMD/RPD-则更侧重于线粒体代谢功能的改变。遗传分析进一步将ECM相关基因的调控与RPD风险联系起来。这些发现不仅深化了对AMD发病机制的理解，也为未来开发针对不同AMD表型的个性化治疗策略提供了潜在的分子靶点。
研究结论（翻译自原文Conclusions）
这些发现表明，伴有和不伴有RPD的AMD代表了机制上不同的实体，并为AMD疾病异质性的分子机制提供了新见解。
