尤卡坦海岸微生物群落中重金属抗性基因的丰度及其表达的空间模式

《Wetlands Ecology and Management》：Spatial patterns in the abundance and expression of heavy metal resistance genes in Yucatán coastal microbiomes

　　摘要：重金属污染对沿海生态系统构成了日益严重的威胁；然而，它对栖息在这些生态系统中的细菌群落的影响仍缺乏研究。在此，我们首次对尤卡坦半岛沿海细菌群落中的重金属抗性基因（HMRGs）进行了宏转录组分析。在四个地点（从保存完好的红树林到受人类活动影响的沿海区域），我们检测到了2,916个与23种金属抗性相关的HMRG转录本。我们的研究结果揭示了分类学和遗传丰度的空间模式，以及转录活动的差异，反映了不同地点之间基因水平的多样性差异。变形菌门（Proteobacteria）在分类学特征上占主导地位，而在科（family）水平上，较少被研究的群体如粘球菌科（Myxococcaceae）和梅里斯莫佩迪科（Merismopediaceae）被认为是新抗性机制的潜在储存库。HMRG转录本的丰度从西向东逐渐增加，其中El Palmar的丰度最低，Progreso的最高。所有分析地点都普遍存在对铜、锌、砷和镍的抗性基因，这反映了生态风险。多金属抗性基因的存在表明它们可能与抗生素抗性基因共同选择。表达模式显示出地点特异性差异：未受影响的地点表现出更广泛的基因多样性和广谱表达，而受影响的地点则表达较低。值得注意的是，Progreso虽然HMRG转录本的数量最多，但总体表达水平最低。

引言：红树林生态系统是河口和沿海湿地的重要组成部分，也是地球上生产力最高、生物多样性最丰富的栖息地之一。尽管它们仅覆盖地球陆地表面的0.1%到0.5%，但它们对地球生态系统过程的贡献却非常显著。值得注意的是，红树林贡献了10%到15%的总沿海碳封存量，其碳储存速率远快于许多陆地生态系统，包括森林（Baker等人2015年；Ma等人2021年；Yang等人2023年）。除了碳循环和丰富的生物多样性外，红树林还提供了重要的生态系统服务，如森林资源、自然海岸保护、碳汇、燃料来源和生计支持、娱乐机会以及支持当地经济的审美价值（Getzner和Islam 2020年；Owuor等人2019年；Dey等人2022年）。近年来，红树林生态系统越来越成为工业、家庭和农业来源的各种污染物的汇。这些污染物包括农药、多环芳烃（PAHs），特别是重金属（HMs），如钴（Co）、铜（Cu）、铬（Cr）、镍（Ni）、锌（Zn）、镉（Cd）、砷（As）和汞（Hg）（Bhattacharyya等人2019年；Tian等人2020年；Mu?oz-García等人2022年）。这些金属通过自然过程和火山活动以及人类活动进入红树林沉积物中。在57项关于人类来源的重金属污染研究中，31%涉及工业废水排放，31%涉及土地利用变化，20%涉及城市化和工业化的结合，9%涉及农业废水排放（Koka等人2025年；Yang等人2025年）。由于红树林土壤富含硫化物、有机物和厌氧条件，有利于形成不溶性金属硫化物和金属-有机复合物，因此能够有效固碳。结果，在过去二十年中，35%的红树林受到了重金属污染（Ma等人2021年；Xiao等人2021年）。重金属在红树林沉积物中的逐渐积累导致土壤生态系统的毒性增加，影响了其中细菌群落的组成和分子功能（Gomes等人2020年；Zhang等人2022年）。重金属对微生物的常见毒性作用包括酶抑制、蛋白质变性、氧化应激、细胞生长抑制、生物量减少以及细胞分裂和转录的干扰（Jayaram等人2022年）。多项研究记录了金属污染土壤、淡水和海洋沉积物中微生物群落的生物量、活性和结构的变化（Rajeev等人2021年）。下一代测序技术（NGS）的出现使得能够在沉积微生物群落中识别出各种重金属抗性基因（HMRGs）（Chen等人2018年；Su等人2018年；Guo等人2023年）。这些赋予特定环境中抗性的基因集合，包括内在基因和通过水平基因转移（HGT）获得的抗性基因，统称为金属抗性组（Hao等人2020年）。金属抗性组中编码的分子机制可以分为四种主要策略：依赖能量的主动金属排出、通过氧化还原反应进行酶促解毒、利用金属结合蛋白进行细胞内和细胞外隔离，以及通过降低将金属运输到细胞内的转运蛋白的表达来减少金属的吸收（Igiri等人2018年；Mathivanan等人2021年）。这些抗性基因的传播由移动遗传元件促进，包括质粒和转座子（Salam 2020年；Sanchez-Corona等人2025年）。尽管我们对环境细菌中重金属抗性基因的了解有限，但最近测序技术的进步显著提高了我们对它们在环境中的存在的认识。例如，Duarte等人（2022年）在葡萄牙本土和群岛地区进行了研究，利用宏基因组测序鉴定与重金属抗性相关的序列及其与人为污染的相关性。同样，Imchen等人（2018年）使用NGS探索了印度、巴西和沙特阿拉伯的红树林沉积物，发现了丰富的重金属抗性基因，特别是针对钴-锌-镉的抗性。在一项相关研究中，Puthusseri等人（2021年）对印度人口密集城市科钦的两片红树林进行了宏基因组研究，以辨别其中微生物群体的抗性功能。他们的研究揭示了钴-锌-镉抗性的普遍存在以及变形菌门在样本中的优势。在尤卡坦红树林的情况下，尽管它占墨西哥红树林面积的54.4%，但由于污染，目前该国红树林覆盖率正遭受最严重的损失（Cinco-Castro和Herrera-Silveira 2020年）。农业、水产养殖、旅游业和城市发展等人为因素导致这种退化。此外，该地区的石灰岩地质结构促进了污染物（包括来自渗漏化粪系统的未经处理的废水、城市径流和农业肥料）进入脆弱的河口（Murgulet等人2020年）。关于尤卡坦半岛重金属水平和分布的信息仍然很少，对微生物群落对这些污染物的反应更是知之甚少。例如，Hernández-Mendoza等人（2022年）使用ICP-MS评估了 cenote水中的铀（U）同位素、铀同位素比值和钍（Th）浓度，发现U和Th的水平低于美国环境保护署（US EPA）和世界卫生组织（WHO）设定的限值。类似地，Arcega-Cabrea等人（2015年）研究了Chelem泻湖中的重金属变化，发现Cd、Cu、Cr和Pb的含量有显著波动，而As、Cd和Sn的含量超过了SQuiRT标准的12倍。目前还没有研究调查过尤卡坦海岸细菌基因组中的重金属抗性基因。目前，关于该地区微生物群落中重金属抗性组的信息不足。因此，本研究旨在填补这一空白，提供有关尤卡坦海岸红树林生态系统中的重金属污染及其对沉积物相关细菌群落影响的信息。在这项研究中，我们对从尤卡坦海岸四个地点收集的沉积物样本中的微生物组进行了宏转录组分析。我们表征了细菌重金属抗性基因的分布、丰度和转录活性，并结合功能注释和基于表达的分析来评估金属抗性的地理分布。这种方法首次揭示了尤卡坦红树林生态系统中的功能性重金属抗性组。这些知识有助于理解微生物对金属污染的响应，并为保护这些重要沿海环境制定策略提供了支持。

材料与方法：
**地点描述和样本采集**
在尤卡坦海岸的四个地点进行了重金属抗性基因（HMRGs）的鉴定：两个受人为影响的地点和两个位于州生态保护区的地点。受人为影响的地点是Sisal镇（21°09′43.6″ N 90°02′27.2″ W）和Progreso镇（21°16′37.6″ N 89°40′35.6″ W）的沼泽地。这些地区受到有机和无机废物、化粪池沉积污泥、卫生废物和杀虫剂的污染。这些污染物来源于旅游和工业活动，包括农业和水产养殖，污染高峰通常发生在假期期间（Uc-Peraza等人2022年；Arcega-Cabrera等人2023年；Kopczynski等人2025年）。此外，沿海沉积物中的总石油烃（TPH）浓度超过了70 μg/g的允许水平（Suárez-Moo等人2020年）。本研究中的保护湿地位于El Palmar（21°08′56.4″ N 90°06′07.0″ W）和Bocas de Dzilam（21°27′22.2″ N 88°40′53.7″ W）。这些地点既是州生态保护区，也是拉姆萨尔湿地（Ramsar Convention Secretariat 2000, 2022年）的指定地点。每个地点使用方形网格采集了三个沉积物样本，采样点位于网格的中心和两端。每个样本的采集深度约为20厘米。每个点的两克沉积物与6毫升LifeGuard Soil Preservation缓冲液（Qiagen，Hilden，德国）混合后放入50毫升无菌聚丙烯管中。样本立即放入冷却器中，并运输到实验室，在-20°C下保存。RNA提取在采集后一周内进行，以尽量减少核酸降解。实验分别在2017年5月、2018年3月和2019年10月三个不同的时间点进行（表S1）。在不同时间点采集的样本是独立观察，捕捉了环境的时间变化。进行这项研究不需要伦理许可。

**RNA提取、文库构建和测序**
核酸提取、文库构建和测序由美国德克萨斯州Lubbock的研究和测试实验室完成。RNA提取使用Qiagen RNeasy PowerSoil Total RNA试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）按照制造商的协议进行。RNA文库的构建和测序使用Illumina? Stranded Total RNA Prep协议完成。测序在Illumina HiSeq 2500平台上进行，生成2×150 bp的双端读段。每份样本的平均产量为5800万个读段。

**数据处理和组装**
每个地点的三份重复样本的原始RNA-seq数据使用NGS QC Toolkit v2.3.3软件（Patel和Jain 2012）和IlluQC.pl（针对Illumina数据）过滤掉接头和低质量读段（Phred得分<30）。过滤后，85%的读段通过了质量检查，其中El Palmar地点的一个文库因读段数量太少而被移除，剩下11个文库。过滤后的读段使用Trinity软件（Grabherr等人2011）重新组装，生成宏转录组装配。分类注释使用BLASTx（Altschul 1997）针对UniProtKB/Swiss-Prot数据库（The UniProt Consortium 2025）进行。读段计数使用RSEM v1.3.3（Li和Dewey 2011）进行标准化，该软件通过将测序读段映射到组装的转录本来估计转录本丰度，并计算每个转录本的预期计数和TPM值（每百万转录本）。标注为类似BacMet的重金属抗性基因的转录本被提取出来，然后使用一个自定义的Perl脚本来保留那些TPM≥1的基因，这些基因被认为是活跃表达的。为了识别与重金属抗性相关的基因（HMRGs）并进行分类注释，我们使用了BacMet数据库（v2.0）（Pal等人，2014年），这是一个包含经过实验验证和预测的抗菌剂、杀菌剂和金属抗性基因的资源库。我们对BacMet数据库进行了局部的BLASTx搜索。如果一个转录本符合e值≤1e-20和序列同一性≥40%的标准，就被标记为类似BacMet的序列。序列比较是在氨基酸水平上进行的（BLASTx），这种方法比基于核苷酸的方法更加保守，更适合在多样化的环境数据集中检测功能同源物。选择≥40%的同一性阈值是基于蛋白质序列功能推断的既定标准，因为大约40%的同一性被认为是核心酶功能保守的关键阈值（Wilson等人，2000年；Devos和Valencia，2000年；Todd等人，2001年；Tian和Skolnick，2003年；Addou等人，2009年；Cole等人，2022年）。类似BacMet的HMRG转录本随后根据它们的抗性类型进行分类，例如对锌（Zn）、镍（Ni）或铜（Cu）的抗性。在这项研究中，重金属没有直接量化。相反，是根据BacMet的注释来推断金属关联性的，这些注释将基因与特定的金属抗性表型联系起来，这些信息基于实验和预测数据得出。之前从BLASTx对UniProtKB/Swiss-Prot数据库的注释中获得的分类信息被用来将类似BacMet的HMRGs分配到特定的细菌或古菌分类单元。TPM值被用来识别表达的类似BacMet的HMRGs（表S2–S5）。所有用于此分析的序列数据都可以在NCBI数据库中找到，BioProject访问号为PRJNA851022。

统计分析和数据可视化所有的统计分析和数据可视化都是使用R v4.2.2（R核心团队，2021年）进行的。为了评估四个采样点之间基因丰度的差异，我们应用了适合数据分布的非参数检验。首先，进行了Kruskal–Wallis检验，以确定各站点之间是否存在统计学上的显著差异。当获得显著结果时，使用Wilcoxon秩和检验进行成对比较，并使用stats v.4.3.0包中的Benjamini–Hochberg方法调整多重检验的p值。数据可视化使用ggplot2包（v3.3.6）生成，以展示各站点之间基因和金属丰度的模式。使用R中的circos包创建的circos图来展示基因与其对应的细菌门之间的关联。在circos图中，只包括了基因数量≥80的门。此外，还使用气泡图来表示基因表达水平，其中气泡的大小代表表达量（TPM值）。统计显著性定义为p<0.05。使用观察到的丰富度、Shannon指数和Simpson指数在门、科和基因水平上计算了Alpha多样性，以表征类似BacMet的抗性基因在不同站点之间的多样性变化（表S6–S8）。使用Bray–Curtis差异度量评估了Beta多样性，并使用主坐标分析（PcoA）来可视化各站点之间分类和功能组成的变化（图S1、图S2、图S3）。

尤卡坦海岸微生物群落中与金属抗性基因相关的分类组成我们识别出了10个携带潜在重金属抗性基因（HMRGs）的细菌门，这些基因以后被称为类似BacMet的HMRGs，其中变形菌门（Pseudomonadota）在所有站点中占主导地位，从Dzilam的73.3%到Sisal的88.5%不等（Palmar：76.4%；Progreso：78.9%）（图1A）。放线菌门（Actinomycetota）和厚壁菌门（Firmicutes）（Bacillota）在所有站点中都有存在，放线菌门的占比从Sisal的4.3%到Palmar的10.7%不等，厚壁菌门的占比从Sisal的3.8%到Dzilam的9.3%不等。螺旋体门（Spirocheatota）和拟杆菌门（Bacteroidota）在三个站点被检测到，螺旋体门的占比在0.71%（Palmar）到1.55%（Dzilam）之间，而拟杆菌门的占比在存在的站点中都低于0.5%。蓝细菌门（Cyanobacteriota）的分布较为有限，仅在Progreso（2.4%）和Dzilam（2.6%）中被检测到。有两个门的地理分布较为受限：奇球菌门（Deinococcota）出现在Progreso（0.04%）和Dzilam（0.67%）；硝化螺旋体门（Nitrospirota）仅在Progreso（0.1%）中被检测到。值得注意的是，还检测到了古菌的多样性。甲烷杆菌门（Methanobacteriota）（广古菌门Euryarchaeota）在所有采样点都被检测到，其相对丰度从Sisal的2.39%到Progreso的6.4%不等（Palmar：4.3%；Dzilam：3.6%），这突显了它们在微生物金属抗性中的潜在作用。相比之下，热古菌门（Thermoproteota）的分布较为受限，仅在Sisal中被检测到，且相对丰度较低（0.48%）。Alpha多样性分析显示了各站点之间门级多样性的差异（表S6），Progreso和Dzilam的多样性高于Palmar和Sisal。Beta多样性分析进一步支持了这些模式，PcoA显示了站点之间的明显分离，特别是Progreso（图S1）。在科级别，10个细菌科最为丰富（图1B），有几个科在所有站点中都一致被检测到。肠杆菌科（Enterobacteriaceae）占主导地位，其在Progreso中的占比为35.9%，在Sisal中为54.5%（Palmar：43.5%；Dzilam：37.5%）。其他丰富的科包括假单胞菌科（Pseudomonadaceae）（7.8–10.2%）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）（3.8–6.4%）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）（1.4–5.7%）和伯克霍尔德菌科（Burkholderiaceae）（2.3–5.7%），这些科在所有站点中都存在。相比之下，Merismopediaceae的分布较为受限，仅在Progreso（2.4%）和Dzilam（2.6%）中被检测到。科级别的Alpha多样性模式与门级别的观察结果一致，Progreso和Dzilam的多样性高于其他站点（表S7）。Beta多样性分析进一步支持了这些模式，PcoA显示了站点之间的明显分离，特别是Progreso（图S2），表明不同地点之间存在明显的科级组成差异。

尤卡坦海岸微生物群落中与金属抗性基因相关的分类组成我们识别出了10个携带潜在重金属抗性基因（HMRGs）的细菌门，其中变形菌门（Pseudomonadota）在所有站点中占主导地位，其比例从Dzilam的73.3%到Sisal的88.5%不等（Palmar：76.4%；Progreso：78.9%）（图1A）。放线菌门和厚壁菌门（Bacillota）在所有站点中都有存在，放线菌门的占比从Sisal的4.3%到Palmar的10.7%不等，厚壁菌门的占比从Sisal的3.8%到Dzilam的9.3%不等。螺旋体门和拟杆菌门在三个站点被检测到，螺旋体门的占比在0.71%（Palmar）到1.55%（Dzilam）之间，而拟杆菌门的占比在存在的站点中都低于0.5%。蓝细菌门的分布较为有限，仅在Progreso（2.4%）和Dzilam（2.6%）中被检测到。有两个门的地理分布较为受限：变形菌门（Deinococcota）出现在Progreso（0.04%）和Dzilam（0.67%）；硝化螺旋体门（Nitrospirota）仅在Progreso（0.1%）中被检测到。值得注意的是，也检测到了古菌的多样性。甲烷杆菌门（Methanobacteriota）（广古菌门Euryarchaeota）在所有采样点都被检测到，其相对丰度从Sisal的2.39%到Progreso的6.4%不等（Palmar：4.3%；Dzilam：3.6%），这突显了它们在微生物金属抗性中的潜在作用。相比之下，热古菌门（Thermoproteota）的分布较为受限，仅在Sisal中被检测到，且相对丰度较低（0.48%）。Alpha多样性分析表明各站点之间门级多样性存在差异（表S6），Progreso和Dzilam的多样性高于Palmar和Sisal。Beta多样性分析进一步支持了这些模式，PcoA显示了站点之间的明显分离。在科级别，10个细菌科最为丰富（图1B），有几个科在所有站点中都一致被检测到。肠杆菌科（Enterobacteriaceae）占主导地位，其在Progreso中的占比为35.9%，在Sisal中为54.5%（Palmar：43.5%；Dzilam：37.5%）。其他丰富的科包括假单胞菌科（Pseudomonadaceae）（7.8–10.2%）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）（3.8–6.4%）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）（1.4–5.7%）和伯克霍尔德菌科（Burkholderiaceae）（2.3–5.7%），这些科在所有站点中都存在。相比之下，Merismopediaceae的分布较为受限，仅在Progreso（2.4%）和Dzilam（2.6%）中被检测到。科级别的Alpha多样性模式与门级别观察到的结果一致，Progreso和Dzilam的多样性高于其他站点（表S7）。Beta多样性分析进一步支持了这些模式，PcoA显示了站点之间的明显分离，特别是Progreso（图S2），表明不同地点之间存在明显的科级组成差异。

如图1所示，尤卡坦红树林细菌群落中与金属抗性相关的分类多样性。A部分显示了含有与重金属耐受性相关的类似BacMet基因的细菌门。B部分显示了含有相对丰度≥2%的类似BacMet HMRGs的细菌科。在circos图中（图2）可视化的门-基因关联显示了类似BacMet HMRGs分布的显著差异。基因丰富度从次要门中的单个基因到变形菌门中的多达20个基因不等，显示出大约10-20倍的差异。变形菌门表现出最高的多样性，有20个不同的基因赋予了对砷、锌、镍和汞的抗性，突显了它们在金属压力环境下生长的遗传适应性。Progreso和Dzilam显示了最高的变形菌门-基因关联丰度。相比之下，放线菌门和厚壁菌门各自携带了两个抗性基因，而拟杆菌门、甲烷杆菌门和热古菌门各自只携带了一个。重要的是要强调古菌门的存在，这扩大了微生物金属抗性的范围，超出了细菌领域。这一发现强调了在研究微生物对金属压力的适应时，考虑细菌和古菌群落的重要性。

如图2所示，尤卡坦半岛各站点中基因-门关联的circos图。彩色弧线代表这些基因和门在每个站点上的丰度和连接：Palmar（棕色）、Sisal（浅蓝色）、Progreso（灰色）和Dzilam（黄色）。

我们评估了尤卡坦半岛沿岸四个站点上类似BacMet HMRGs的地理分布、组成和丰度。这些样本在不同时间点收集，也捕捉到了各站点环境条件的时间变化。共有2916个转录本被分类为类似BacMet HMRGs，其分布存在差异。在保持不变的站点中，El Palmar占总类似BacMet HMRGs的4.80%（140个），而Bocas de Dzilam占15.43%（450个）。El Palmar较低的丰度与其原始状态相符。与此同时，尽管Bocas de Dzilam处于保存状态，但它显示出较高的类似BacMet HMRGs丰度，以及如Guillén-Chable等人（2022年）先前报告的抗生素抗性基因的高丰度。相比之下，受污染的站点显示出显著更高的类似BacMet HMRGs丰度，其中Sisal贡献了7.16%（209个），而Progreso占主导地位，为72.59%（2117个）（图3A）。

统计分析（Kruskal–Wallis，p值<2.19e–7）确认了各站点之间类似BacMet HMRGs丰度的显著差异。成对Wilcoxon秩和检验（p值<0.05）识别出Palmar-Progreso、Palmar-Dzilam、Sisal-Progreso和Progreso-Dzilam之间类似BacMet HMRGs的显著差异。在所有站点中，与金属抗性最相关且分布最广的假定基因包括arsA（砷，As）、copA（铜，Cu）、corR（铜，Cu）、nikE（镍，Ni）和zraR/hydH（锌，Zn）（图3B）。Alpha多样性分析表明各站点之间基因水平的多样性存在差异，Progreso和Dzilam的多样性高于其他地点（表S8）。Beta多样性分析进一步支持了这些模式，PcoA显示了所有站点之间的明显分离，表明各地点之间存在不同的功能特征（图S3）。图3B突出了每个采样地点最普遍的类似BacMet重金属抗性基因。在所有站点中，最普遍和分布最广的基因包括arsA（砷，As）、copA（铜，Cu）、corR（铜，Cu）、nikE（镍，Ni）和zraR/hydH（锌，Zn）。总共基于类似BacMet抗性基因的注释推断出了23种不同的重金属。铜、砷、锌、钨、铁和镍是最常关联的金属，因为它们的相应抗性基因在所有站点都被检测到（图S4）。相比之下，锑、碲、硒和铅的抗性基因相对较少，这表明它们的环境浓度较低或选择压力较小。值得注意的是，赋予锌和铜抗性的基因的高代表性与其在农业和工业中的广泛应用（Tortella等人，2024年；Ravishankar等人，2025年；Morales-Cámara等人，2025年）以及它们的环境持久性和毒性（Rehman等人，2019年；Falfushynska等人，2024年）相符。

我们使用TPM值（图4）评估了四个采样站点上类似BacMet HMRGs的转录活性。总体而言，Palmar显示了最高的类似BacMet HMRGs总表达量，其次是Sisal，然后是Dzilam，最后是Progreso，后者显示了一定数量基因的中等表达水平。Palmar表现出最广泛的类似BacMet HMRGs谱系，包括对铜、钴和铁的抗性基因，以及大多数赋予多金属抗性的基因。Sisal中也表达了一系列类似的BacMet HMRGs，尽管通常水平较低。

如图4所示，不同采样站点上类似BacMet HMRGs的TPM（每百万转录本）表达水平。气泡大小代表TPM值，气泡颜色表示每个基因关联的具体金属。砷抗性基因（例如arsT、arsR、arrb和aioE）在Palmar、Sisal和Dzilam中一致表达，但在Progreso中不存在。与锌抗性相关的基因（zur/yjbK、zraS/hydG、zraR/hydH和znuC/yebM）在Palmar、Sisal和Progreso中表达，但在Dzilam中未被检测到。铅抗性基因（zraS/hydG和nmtR）仅在Palmar和Sisal中表达。值得注意的是，与铬（Cr）抗性相关的ruvB在Dzilam中表达最高，而与锑（Sb）和砷（As）抗性相关的glpF在Palmar和Sisal中都表达较高。与碲和硒抗性相关的基因仅在Palmar站点表达。此外，多抗性基因主要在Palmar中表达。总体而言，类似BacMet HMRGs的表达水平因站点和金属类型而异，Palmar和Dzilam显示出显著更多的显著表达基因，表明当地环境金属压力影响了微生物的转录响应。

我们的结果显示，尤卡坦采样点上的微生物群落中携带类似BacMet HMRGs的微生物分类组成多样化。这些模式与alpha和beta多样性分析一致，后者显示了各站点之间分类组成的变化。变形菌门（Pseudomonadota）在所有地点中占主导地位，约占所有类似BacMet HMRGs的75%（图1A）。变形菌门的代谢多样性和金属耐受机制（Nyoyoko，2022年），以及观察到的广泛抗性基因谱系，包括对砷、锌、镍和汞的耐受性，突显了其遗传适应性。先前的研究已经报道了变形菌门在受污染的沿海沉积物中的重金属转化和减弱过程中的作用（Quero等人，2015年；Petrie等人，2003年相比之下，其他细菌门类，如放线菌门（Actinomycetota）和厚壁菌门（Firmicutes，包括芽孢杆菌门Bacillota），已经在受污染的沉积物中被报道过（Imchen等人2018年；Zampieri等人2020年），它们显示出的BacMet样基因的相对丰度较低，这表明它们在尤卡坦海岸的金属抗性贡献相对有限（图2）。BacMet样基因较少的门类可能在微生物群落中扮演更加专门或支持性的角色，参与金属抗性。古菌门类，特别是甲烷杆菌门（Methanobacteriota）和热蛋白菌门（Thermoproteota）也被检测到，这突显了古菌在金属抗性中的重要作用，尽管这一作用常常被忽视。它们的存在扩展了微生物适应的范围，超出了细菌的范畴，这对于在金属压力环境下生存至关重要，特别是在红树林土壤这样多样的生态位和地球化学微生境中。例如，Christakis等人（2021年）在十个以前不知道编码这种功能的古菌门中发现了merA（汞还原酶）的同源物，证明了新型金属抗性基因在古菌中的发现和广泛存在。同样，Coombs和Barkay（2005年）报告了古菌中广泛存在的PIB型ATP酶，这类金属转运蛋白，表明这一基本的金属稳态基因在古菌界中具有高度保守性。古菌门甲烷杆菌门中存在的wtpC基因（图2）能够抵抗钨（W）和钼（Mo），进一步扩展了对抗性途径的讨论，表明古菌可能拥有尚未充分探索的解毒机制，这些机制与生物地球化学循环和生物修复有关。

在变形菌门（Proteobacteria）中，最常见的家族包括伯克霍尔德菌科（Burkholderiaceae）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、黏细菌科（Myxoccaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、根瘤菌科（Rhizobiaceae）和耶尔森菌科（Yersiniaceae），这些家族在所有采样点都有发现。其中，肠杆菌科和伯克霍尔德菌科是所有地点中携带BacMet样HMRG的主要家族。这些家族的成员，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和铜色假单胞菌（Cupriavidus pauculus），其重金属抗性机制已有充分记录，例如外排系统和结合蛋白（Bilyaminu等人2025年；Staehlin等人2016年；Yang等人2018年、2020年；Sekizuka等人2022年；Butler等人2022年）。其他家族也包含已知具有金属抗性的物种，包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和亚洲假单胞菌（P. asiatica）（Ramos等人2020年）、油分酶菌（Ensifer oleiphilus）（Ershov等人2023年）以及耶尔森肠炎菌（Yersinia enterocolitica）（Karlsson等人2021年；Long等人2021年）。有趣的是，关于黏细菌科的重金属抗性知之甚少。其最具代表性的成员黄色黏细菌（Myxococcus xanthus）被报道具有抗生素耐受性和抗性，但其重金属抗性的证据有限（Thiery和Kaimer 2020年；Kroos等人2025年），这提示这种具有复杂生命周期的捕食性细菌可能存在新的抗性机制。仅在普罗格雷索（Progreso）和迪拉姆（Dzilam）发现的Merismopediaceae家族可能反映了有利于光合或固氮蓝细菌的局部条件。这种有限的分布可能反映了微生物对当地环境条件的特定适应，包括不同地点间金属污染水平的差异。尽管蓝细菌中的金属抗性相对罕见（Foysal等人2025年），但Merismopediaceae家族的Merismopediacia tenuissima已被用于镉和铜的生物修复（Fawzy 2016年），表明其在金属污染环境中的潜在功能适应能力。这些发现共同表明，无论是已知的还是未被充分探索的细菌和古菌群体，都对尤卡坦海岸红树林微生物组在金属压力下的恢复力有所贡献。

HMRGs的空间分布模式反映了尤卡坦海岸沿线的人为影响。尤卡坦半岛微生物群落中BacMet样HMRGs的地理分布和丰度突显了沿海环境的生态复杂性以及人类活动对细菌功能的显著影响。我们的宏转录组学方法显示，四个采样点之间的BacMet样HMRG组成存在明显差异，从保存完好的红树林生态系统到受城市影响的沿海区域都有分布。需要注意的是，样本是在不同时间点采集的，这也可能导致了观察到的变异性，反映了环境条件的时间波动。作为受城市影响的普罗格雷索（Progreso）占所有检测到转录本的72%以上（图3A）。这种高丰度凸显了强烈的人为污染，与先前关于该地区新兴污染物（如抗生素抗性基因和移动遗传元件）增加的报告一致（Guillén-Chable等人2022年、2024年）。相反，西部海岸相对未受干扰的埃尔帕尔马（El Palmar）生态保护区显示的BacMet样HMRG丰度最低，表明保护完好的环境可能对维持金属抗性基因的选择压力较小。有趣的是，另一个保护区迪拉姆（Dzilam）显示出中等的BacMet样HMRG水平，支持了先前的污染信号观察结果（Guillén-Chable等人2022年、2024年）。这可能是由于区域水文连通性促进了扩散污染，正如之前关于镉的报告所述，该地区镉的浓度很高（Avila等人2012年）。尤卡坦半岛的喀斯特含水层以其储存和长距离运输污染物的能力而闻名。这种水文地质特征促进了污染物从内陆源头向生态敏感的沿海区域的转移。例如，海底地下水排放（SGD）穿过东部的畜牧业生产区（Murgulet等人2020年），将残留污染物输送到迪拉姆海岸并影响该生态保护区。这些因素导致了从西向东沿海岸线HMRG丰度的明显空间梯度：埃尔帕尔马（4.8%）、西斯尔（7.1%）、普罗格雷索（72.6%）和迪拉姆（15.4%）（图3A）。这种从西到东的模式反映了金属污染和人类影响的增加，与之前关于沿海新兴污染物增加的研究结果一致（Guillén-Chable等人2022年、2024年）。统计分析进一步确认了各站点之间的显著差异，特别是突出了普罗格雷索独特的污染特征（图3A）。这些模式与alpha和beta多样性分析结果一致，后者揭示了各站点在基因水平的多样性和组成上的明显差异。PCoA中观察到的强烈分离表明了不同的功能特征，特别是与其他站点的明显差异。

在所有地点，我们识别出23种与BacMet样基因相关的重金属，其中一组核心基因（arsA、copA、corR、nikE、zraR/hydH）在各站点都被一致检测到。这表明即使在受污染较少的区域，微生物群落也普遍暴露于砷、铜、镍和锌等金属（图3B）。各站点识别的BacMet样重金属抗性基因的多样性反映了微生物群落应对金属压力的多种分子策略。例如，copA、copR和corR与铜抗性相关，而acn与铁代谢相关，铁是微生物生长的关键元素（Zheng等人2023年）。镍抗性由nikD和nikE等基因调节，而zraR/hydH和zraS/hydG则参与锌和铅的抗性，这两种金属常见于受工业影响的环境中（Kicińska 2020年）。此外，recG与铬、碲和硒的抗性相关（Thomas等人2020年），突显了这些微生物群落中抗性机制的功能多样性。值得注意的是，铜的污染因素处于中等水平，而锌的污染程度最高，且在该地区的生态风险最大。这些金属主要来源于电子、化工、电气、医药和化妆品工业，以及城市径流和轮胎磨损，尤其是在像梅里达（Mérida）这样交通繁忙的城市中心（Ortega-Camacho等人2023年）。铜和锌的抗性基因的主导地位与它们在农业、畜牧业、水产养殖和城市活动中的广泛使用有关，最终这些金属会在沿海生态系统中积累（Rosas-Sánchez等人2024年）。相比之下，如碲、硒和锑等不太常见的金属的抗性基因在较低水平上被检测到，可能反映了它们的环境存在或生物可用性的降低，因此选择压力也较低。特别是铅的污染在尤卡坦半岛仍处于早期阶段，但如果积累持续，未来可能会带来风险（Ortega-Camacho等人2023年）。有趣的是，如arsA、recG、wtpC、zraR/hydH和zraS/hydG等基因的检测表明，这些环境中的微生物分类群可能具有广谱抗性机制，可能增强了它们在动态或受干扰环境中的生态适应性。这些发现补充了先前的研究，表明对抗生素和金属的抗性通常是共同选择的，这可能是由于抗性基因在移动遗传元件上的共享调控途径或物理邻近性（Gillieatt和Coleman 2024年；Pal等人2015年）。总之，这些结果强调了金属抗性基因在暴露于自然和人为污染源的沿海微生物群落中的生态重要性。

总之，我们的结果表明，尤卡坦海岸的微生物群落拥有多样且特定于地点的HMRG库。这些基因在受人类影响区域的增高代表显示了人类活动在塑造微生物功能特征方面的持续影响。此外，从西到东HMRG丰度的明显增加反映了更广泛的生态干扰和污染模式，支持了微生物抗性谱型作为监测沿海环境健康的敏感生物指示物的潜力。

尤卡坦海岸微生物群落中活跃的HMRGs。通过对尤卡坦半岛沿海站点重金属抗性基因的转录谱分析，揭示了空间异质性，反映了特定地点的环境金属压力和不同程度的人为影响。多个采样日期的纳入为分析增加了时间维度，使表达模式可以在环境变化的背景下进行解释。转录组数据（图4）显示，埃尔帕尔马（El Palmar）的BacMet样HMRG表达水平最高，其次是西斯尔（Sisal）和迪拉姆（Dzilam），最后是普罗格雷索（Progreso）。值得注意的是，尽管普罗格雷索在DNA水平上拥有最多的BacMet样HMRG转录本，但其表达水平最低，表明基因丰度和转录活动之间存在脱钩。这种现象在其他受污染环境中也有观察到，表明基因的存在并不一定意味着活跃表达，因为在某些环境条件下“沉默”的抗性基因可能保持不表达（Stasiak等人2021年；Deekshit和Srikumar 2022年；Matchawe等人2022年）。这种脱钩可能是由金属生物可用性、微生物休眠或调控机制等因素驱动的，潜在的基因可以作为通过水平基因转移转移的抗性特征的储备。这种调节可能反映了在动态环境压力下能量保存和适应灵活性的平衡，特别是在受人为影响的站点（Depardieu等人2007年）。

尽管埃尔帕尔马（El Palmar）的BacMet样HMRG丰度最低，并被视为一个受保护的区域，但它表现出最广泛的表达基因多样性，包括那些对抗铜、钴、铁和多种金属的抗性基因。这一发现表明，即使是生态保护区也可能维持活跃表达抗性基因的微生物群落，这可能是由于海底地下水排放（SGD）的扩散污染或自然存在的富金属地球化学条件所致。在受保护的湿地中也报告了类似的观察结果（Diaz等人2017年；Agudo和Reche 2024年）。西斯尔（Sisal）也显示出广泛的BacMet样HMRG表达多样性，尽管水平略低，其中arsR、aioE和zraR/hydH的存在表明了与记录的人类影响一致的复杂金属暴露情况（Guillén-Chable等人2022年）。与砷和锑抗性相关的glpF基因在埃尔帕尔马和西斯尔中都表现出高表达，表明持续的类金属暴露。相比之下，迪拉姆（Dzilam）在总BacMet样HMRG表达中处于中等水平，但ruvB（一种铬抗性基因）的表达水平最高，这表明可能存在与喀斯特地下水运输痕量金属相关的局部铬污染（Murgulet等人2020年；Avila等人2012年）。除迪拉姆外，所有站点都表达了锌抗性基因（zur/yjbK、zraS/hydG、zraR/hydG、znuC/yebM），这与关于沿海沉积物中锌和铜普遍存在的报告一致（Rosas-Sánchez等人2024年），以及这些金属是尤卡坦半岛上最持久和危险的金属之一，因为它们的广泛使用和工业排放（Ortega-Camacho等人2023年）。铅抗性基因（zraS/hydG、nmtR）仅在埃尔帕尔马和西斯尔中表达，表明生物可用性的部位差异。硒和碲的抗性基因仅在埃尔帕尔马表达，这可能反映了来自矿物风化或大气沉积的较少见类金属污染物的选择压力（Zampieri等人2020年）。多抗性基因在埃尔帕尔马中主要表达，表明通过共享遗传平台或共同调控途径维持了对多种金属的抗性（Pal等人2015年；Baker-Austin等人2006年；Engin等人2023年），在压力环境中具有选择优势。缺乏砷抗性基因（arsT、arsR、arrB、aioE）在普罗格雷索的表达表明微生物群落的组成可能发生了变化，采样期间的砷暴露减少，或环境条件抑制了表达。总体而言，这些结果表明，金属特定的环境压力塑造了沿海微生物群落中HMRGs的多样性和转录表达格局。基于DNA的数据能够捕捉微生物的抗性遗传潜能，而转录组谱则更直接地反映了微生物的活跃策略以及金属的生物可利用性。在帕尔马（Palmar）和兹拉姆（Dzilam）等保护区观察到的异常高表达现象，突显了水文和地球化学连通性（尤其是地下水介导的传输）在污染物扩散中的作用。基于表达谱的HMRGs（Heavy Metal Resistance Genes）分析成为一种强大的生物监测工具，可用于评估复杂喀斯特海岸环境中的历史污染情况和当前的生态压力，在这些环境中，污染物的传输过程往往非常复杂且难以察觉。

**结论**
本研究首次对尤卡坦半岛沿海和红树林微生物群落中的重金属抗性基因进行了宏转录组分析，揭示了这些基因在分类学、丰度和活性方面的空间差异。这些模式还得到了不同地点基因多样性和组成差异的支持。蛋白质细菌（Proteobacteria）在抗性基因中占主导地位，同时还有一些具有特化抗性机制的古菌（Archaea）也参与了抗性反应，这表明金属耐受性具有广泛的系统发育基础。从西部保守区的帕尔马到东部受影响更严重的普罗格雷斯（Progreso），HMRGs的丰度呈现出自西向东的梯度变化，这反映了人类活动压力的增加，如城市径流、工业排放和农业活动的影响。值得注意的是，通过喀斯特含水层和海底地下水形成的水文连接是该地区污染物传输的重要途径。虽然铜、锌、砷和镍的抗性基因普遍存在，但不同地点的表达谱存在显著差异：帕尔马的HMRGs谱系更丰富且活性更强，包括多金属抗性基因，而普罗格雷斯的谱系则较为狭窄，与当地污染压力更为契合。多金属抗性基因的存在表明，沿海微生物群落具有广泛的解毒能力，这种能力可能与抗生素抗性通过共同的调控机制或移动遗传元件共同进化而来。这些发现支持将HMRGs的表达情况作为评估沿海生态系统健康状况的敏感生物指标，并强调了喀斯特海岸对金属污染的脆弱性。将类似的转录组监测方法扩展到其他热带和亚热带沿海系统，可以提高早期预警能力，指导有针对性的修复工作，并为基于科学的保护策略提供支持。