响应抗性高粱的Melanaphis sorghi中组织蛋白酶B样蛋白的转录组分析及特性研究

《Molecular Breeding》：Transcriptome analysis and characterization of cathepsin B-like protein in Melanaphis sorghi in response to resistant sorghum

　　**摘要**
高粱蚜虫（Melanaphis sorghi）是一种以韧皮部为食的昆虫，是严重影响高粱生产的主要害虫。尽管人们对植物抗性机制的理解有所进展，但蚜虫对抗性宿主植物的分子反应仍知之甚少。本研究旨在阐明高粱蚜虫在取食抗性高粱品种HN16时的转录变化，并识别参与宿主适应的关键调控基因。通过RNA-seq分析，我们发现蚜虫在取食HN16时有1,388个差异表达基因（DEGs）。表达谱分析显示，与细胞凋亡和解毒相关的基因受到协调调控。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），确定了10个候选响应基因。值得注意的是，敲低编码组织蛋白酶B样蛋白的DEG MsCathB1显著降低了蚜虫在抗性植物上的适应性。功能研究表明，MsCathB1还能抑制隐菌素诱导的植物细胞死亡和过氧化氢积累。这些发现表明，高粱蚜虫对宿主抗性的反应与细胞凋亡相关通路紧密相关，且MsCathB1可能作为毒力效应因子调控蚜虫的表现和植物免疫力。这项工作为蚜虫-宿主相互作用提供了新的见解，并支持基于RNAi的蚜虫控制策略的发展。

**引言**
在大约4亿年的共同进化过程中，食草昆虫及其宿主植物发展出了多种防御和反防御策略（War等人，2012年；Shih等人，2023年）。与咀嚼式昆虫不同，像蚜虫这样的刺吸式昆虫通过插入细长的口针来获取韧皮部汁液，对组织的损伤很小。在取食过程中，它们会分泌唾液成分，能够操纵宿主植物的防御机制（Powell和Hardie，2000年；Tjallingii，2006年）。在植物中，已知的抗性机制包括植物激素信号传导、有毒次生代谢产物的产生以及韧皮部阻塞（Züst和Agrawal，2016年）。识别食草昆虫相关的分子模式（HAMPs）或分泌的效应因子可以触发植物的免疫信号级联反应，导致钙离子流入、有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的激活，以及随后的防御反应，如活性氧（ROS）积累、半纤维素产生和防御相关基因的上调（Rossi等人，1998年；Ngou等人，2021年；Shih等人，2023年）。虽然植物反应已被广泛研究，但对于韧皮部取食昆虫如何应对抗性宿主的知识却较少。
高粱蚜虫（Melanaphis sorghi）曾在2013至2020年间被命名为Melanaphis sacchari（Nibouche等人，2014年、2018年、2021年），现在被认为是危害高粱最严重的害虫之一。蚜虫在所有生长阶段通过吸取韧皮部汁液直接损害高粱（Souza和Davis，2021年）。虫害密度可达每株10,000只蚜虫，其分泌的蜜露会抑制光合作用和养分吸收，最终导致产量大幅下降或作物完全失败（Singh等人，2004年；Bowling等人，2016年）。此外，蚜虫还传播多种植物病毒，进一步加剧了其经济损失（Rassaby等人，2003年）。目前的防控措施主要依赖合成杀虫剂，但这导致了抗性蚜虫种群的出现（Bass和Nauen，2023年）。为了应对这一挑战，人们采用了基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学方法来揭示抗性基因位点并解析植物-昆虫相互作用（Almeida-Silva和Venancio，2023年；Wang等人，2023年；VanGessel等人，2024年）。一个重大突破是从颗粒高粱品种Henong 16（HN16）中鉴定出了RMES1抗性基因，该基因能促进植物在蚜虫攻击时产生过氧化氢（Wang等人，2013年；Shao等人，2019年）。
通过RNA测序（RNA-seq）进行的转录组分析是解读蚜虫对宿主防御分子反应的强大工具。例如，Sitobion avenae的唾液腺转录组学研究发现了参与消化、水解和解毒的钙结合蛋白和酶，表明它们在植物相互作用中起作用（Zhang等人，2017年）。在Macrosiphum euphorbiae中，宿主植物的防御机制调控了蚜虫中参与碳水化合物和脂质代谢、外源物质处理、氧化应激、免疫及激素生物合成相关基因的表达（Planelló等人，2022年）。重要的是，转录组筛查发现了许多潜在的效应基因，其中一些已经进行了功能研究。例如，来自Aphis citricidus的AcE4蛋白可以抑制INF1和BAX诱导的植物细胞死亡，表明其在免疫逃避中的作用（Shangguan等人，2024年）。同样，结合转录组学和蛋白质组学分析鉴定了来自Schizaphis graminum的Sg2204效应基因，该基因通过抑制植物细胞死亡和促进韧皮部取食来增强蚜虫的适应性（Zhang等人，2022a）。另一种来自Sitobion miscanthi的唾液蛋白Sm9723在抑制宿主免疫和促进蚜虫毒力方面发挥关键作用（Zhang等人，2022b）。然而，关于M. sorghi在抗性植物上特异性HAMPs或效应因子的信息仍然有限。
为填补这一空白，我们在携带RMES1基因的抗性高粱品种HN16上进行了蚜虫取食实验，通过转录组分析鉴定了蚜虫适应宿主抗性的关键基因和通路。在DEGs中，我们通过WGCNA鉴定出了编码组织蛋白酶B样蛋白的MsCathB1。功能分析表明，MsCathB1能够促进蚜虫在抗性植物上的存活和繁殖能力，同时抑制植物的免疫反应。这些发现揭示了一种新的蚜虫效应因子候选物，为基于RNAi的蚜虫控制策略提供了潜在靶点，以提高高粱产量。

**材料与方法**
**植物和昆虫**
高粱基因型HN16和BTx623在温室条件下培养（28°C，光照16小时/黑暗8小时，相对湿度60%）。HN16携带抗高粱蚜虫的RMES1基因，而BTx623是广泛用于高粱基因组研究的易感品系（Paterson等人，2009年；Chang等人，2012年；Wang等人，2013年）。N. benthamiana植物在相同条件下（25°C）培养。
**高粱蚜虫（M. sorghi）的实验条件**
蚜虫在BTx623幼苗上维持相同的生长环境参数（28°C，光照16小时/黑暗8小时，相对湿度60%），以确保一致的饲养条件。
**蚜虫在高粱基因型上的表现**
HN16和BTx623种子在上述条件下发芽并生长。在两叶期，每种基因型选取15株健壮的幼苗（每盆5株）。通过测量存活率、宿主偏好和蜜露分泌情况评估蚜虫的表现。在存活实验中，每株植物放置10只无翅成年蚜虫，并将其限制在透明网罩内。分别在侵染后3小时、6小时、24小时和48小时统计蚜虫数量。在宿主选择实验中，将每种基因型的种子混种在盆中，保持相等间距（每种基因型3株，共6株），每株植物释放5只成年蚜虫。分别在释放后3小时、6小时、12小时和48小时记录每株植物上的蚜虫数量（Guo等人，2018年）。蜜露的产生按照之前的方法进行评估（Shangguan等人，2018年，稍作修改）。将两根新鲜切割的高粱茎放在直径2.5厘米、高度1厘米的滤纸上。让饥饿8小时的3只蚜虫在茎上取食36小时，然后用0.1%（w/v） ninhydrin的丙酮溶液染色滤纸以观察分泌的蜜露。使用ImageJ软件量化紫色染色区域的面积。
**样本收集和RNA分离**
在HN16上取食的蚜虫分别在0小时、3小时、6小时、12小时、24小时和48小时进行采样。每个时间点重复三次（每个重复100只个体），并立即用液氮速冻。按照制造商说明使用Trijol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA，并储存在-80°C。使用NanoDrop 2000光谱仪（Thermo Scientific，美国）、Agilent 2100 Bioanalyzer（美国）和琼脂糖凝胶电泳（Lonza，瑞士）检测RNA浓度和完整性。选择OD260/280在1.8到2.2之间且RNA完整性数（RIN）> 8的样本进行测序。

**Illumina文库构建和RNA测序**
使用TruSeq? RNA Sample Preparation Kit（Illumina，美国）按照制造商的协议构建cDNA文库。使用寡(dT)连接的磁性珠子和二价阳离子将Poly-A mRNA分离并片段化（约300 bp）。首先使用随机引物和逆转录酶合成第一链cDNA，然后使用dUTP混合物合成第二链cDNA。将黏性末端转化为平末端，并在3′末端添加一个“A”碱基以便接头连接。使用Agencourt AMPure XP珠子纯化接头连接的片段，并通过PCR扩增生成最终文库。文库在cBot系统上进行测序，使用DNBSEQ-T7平台（Wefindbio Biotechnology Co., Ltd.，武汉，中国）。
**数据分析和处理**
利用RNA测序获得的原始读长通过Fastp（Chen等人，2018年）过滤，去除接头、不确定碱基和低质量读长。将清洁后的读长与M. sorghi参考基因组（NCBI RefSeq: GCF_002803265.2）对齐，使用HISAT2进行转录本组装和定量，然后使用StringTie（Pertea等人，2015年；Kim等人，2019年）进行分析。表达水平以TPM（每百万映射读长的外显子转录本数）进行标准化。使用R进行PCA分析，以评估不同时间点的变化。RNA-seq数据已提交至NCBI SRA，BioProject访问号为PRJNA1306752。

**差异表达和功能富集分析**
使用DESeq2识别差异表达基因（DEGs），标准为假发现率（FDR）调整后的P < 0.05且|-fold change| > 2。动态表达模式基于TPM值使用Mfuzz包进行聚类。使用GOATOOLS（https://github.com/tanghaibao/GOatools）进行GO富集分析，并使用ClusterProfiler可视化显著GO术语（Yu等人，2012年）。使用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）进行KEGG通路富集分析（Xie等人，2011年），Fisher精确检验后的P ≤ 0.05和Benjamini–Hochberg校正被认为是显著的。
**WGCNA构建调控网络**
我们使用WGCNA包（v1.69）探索基因调控网络（Langfelder和Horvath，2008年）。导入的数据为所有13,690个基因的TPM值，根据Zeng等人（2022年）去除所有低表达基因（每个处理的TPM < 1），并根据中位绝对偏差（MAD）值筛选前5000个基因。基因根据拓扑重叠相似性进行聚类。使用Dynamic Tree Cut算法（Zhan等人，2015年）定义模块，参数设置为：软阈值功率=14，TOM类型=unsigned，最小模块大小=50，合并切割高度=0.25。通过模块特征基因的皮尔逊相关性确定模块-性状关系。模块成员度（KME）> 0.8的基因被定义为枢纽基因（Yuan等人，2024年）。使用Cytoscape（Shannon等人，2003年）可视化共表达网络。

**qRT-PCR验证**
为了验证RNA-seq结果，选择了六个与组织蛋白酶B基因家族高度相关的DEGs进行qRT-PCR。在HN16上取食的蚜虫分别在0小时、3小时、6小时、12小时和48小时进行采样。总RNA使用RNAiso Plus（TaKaRa，日本）提取，并使用Superscript II逆转录酶（Invitrogen，美国）按制造商说明反转录为cDNA。使用特异基因引物（表S4）和SYBR? Premix Ex Taq? II（TaKaRa，日本）在Roche LightCycler 480系统上进行qRT-PCR。以M. sorghi Actin基因（NCBI访问号：XM_025350371）作为内参。所有实验均重复三次。相对表达水平使用2?△△CT（Livak和Schmittgen，2001）计算。

**dsRNA人工饮食实验**
为了合成针对MsCathB1的双链RNA（dsRNA），首先进行生物信息学分析，检查M. sorghi基因组中MsCathB1的同源物，未发现高度相似的序列，排除了潜在的脱靶沉默。使用基因特异性引物dsMsCathB1-F和dsMsCathB1-R扩增DNA模板，其中包含T7启动子序列。按照之前描述的方法（Jacques等人，2020年；Dong等人，2022年；Cui等人，2023年）使用MEGAscript RNAi Kit合成MsCathB1-dsRNA（559 bp）。一种源自GFP（绿色荧光蛋白）的双链RNA（dsRNA，长度为500 bp）被用作阴性对照。通过琼脂糖凝胶电泳确认了dsRNA的纯度、大小和完整性，并通过260 nm处的吸光度对其浓度进行了量化。用于dsRNA合成的引物序列列在表S4中。dsRNA人工饲料实验的方法是根据先前建立的协议进行了修改（Whyard等人，2009年；Zhang等人，2013年）。简而言之，将20 μl的人工饲料（含20% w/v蔗糖和125 ng/μL的dsRNA）放置在聚膜片之间，使蚜虫能够用其口针刺穿膜并摄取提供的饲料。从高粱中收集三龄若虫，并禁食8小时，以确保每只蚜虫都能随后消耗人工食物（Hao等人，2021年）。然后使用细画笔将这些蚜虫转移，并将其放置在一个密封且透气的笼子中以防止它们逃跑（Jacques等人，2020年）。进食72小时后，收集10只存活的蚜虫进行RNA提取，并通过RT-qPCR定量MsCathB1的转录水平，以评估RNAi的效果（重复三次）。为了评估MsCathB1敲低后的生理效应，将每个处理组（对照组、GFP-dsRNA组、MsCathB1-dsRNA组）的蚜虫转移到抗性（HN16）和易感（BTx623）的高粱基因型上。通过计数存活的成年蚜虫和新产生的若虫来评估蚜虫的表现，每24小时一次。如前所述，还测量了蜜露的分泌量。整个实验独立重复了三次。

**细胞死亡实验**
为了研究MsCathB1诱导细胞死亡的潜力，将其编码序列克隆到一个改良的pCAMBIA1300载体中，生成了一个带有MYC标签的构建体（MsCathB1-MYC）。该构建体被引入到Agrobacterium tumefaciens菌株GV3101中。使用带有GFP标签的构建体作为阴性对照，而带有FLAG标签的cryptogein构建体作为诱导程序性细胞死亡的阳性对照（Amelot等人，2011年；Ptá?ková等人，2015年）。在含有50 mg/mL利福平和25 mg/mL卡那霉素的LB培养基中（28°C）培养Agrobacteria菌株过夜。通过离心收集细菌细胞，重新悬浮在渗透缓冲液中（10 mM MgCl?、10 mM MES、pH 5.6、150 μM acetosyringone），调整OD??? = 0.8，然后在室温下孵育2小时。将细菌悬浮液渗透到四周大的N. benthamiana植物的叶片中。从渗透后2天到7天每天观察症状。在渗透后3天拍摄细胞死亡的图像。使用抗-MYC、抗-FLAG和抗-GFP抗体通过免疫印迹验证重组蛋白的表达。所有实验都进行了三次生物重复，结果一致。

**免疫印迹分析**
为了检测N. benthamiana中的MsCathB1蛋白表达，将重组质粒（pCAMBIA1300-MsCathB1-MYC、pCAMBIA1300-Cryptogein-FLAG和pCAMBIA1300-GFP）转化到A. tumefaciens GV3101中并渗透到烟草叶片中。渗透后48小时，收集400 mg的叶片组织并在液氮中研磨。使用含有100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、200 mM KCl、20 mM MgCl?、2 mM EDTA、1% Triton X-100、5 mM DTT和1 mM PMSF的缓冲液提取总蛋白。将提取物在100°C煮沸，以12,000 × g离心10分钟，上清液进行12% SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上。使用小鼠单克隆抗体（anti-MYC、anti-FLAG和anti-GFP）进行免疫检测。所有实验都进行了三次生物重复，得到一致的结果。

**DAB染色和H2O2定量**
为了评估过氧化氢（H?O?）的积累，表达MsCathB1或cryptogein的N. benthamiana叶片在渗透后48小时进行DAB（3,3′-二氨基苯胺）染色。叶片在DAB-HCl溶液（1 mg/mL，pH 3.8）中孵育10–12小时，然后在渗透后36小时用沸腾的95%乙醇脱色（如Daudi和O’Brien 2012年所述）。按照制造商的协议使用商用试剂盒（Invitrogen，A22188）进行H?O?的定量测量。

**统计分析**
所有实验都进行了三次独立的生物重复，每次包含三个技术重复。数据使用Student’s t检验或Tukey的诚实显著差异（HSD）检验进行统计分析，显著性设定为P ≤ 0.05。蚜虫的存活分析使用Kaplan-Meier对数秩检验进行。

**蚜虫在抗性高粱基因型上的表现**
为了评估高粱基因型的抗性，将HN16（抗性）和BTx623（易感）的幼苗各接种十只成年蚜虫。接种后14天（dpi），BTx623的植物全部死亡，而HN16的植物仍然健康并表现出很强的抗性（图1A）。两种基因型之间的蚜虫数量动态有显著差异。24小时后，HN16上的蚜虫数量已经低于BTx623，48小时时差异显著（图1B），表明在抗性宿主体上繁殖力降低。在双选择实验中，接种后3至48小时内，落在HN16上的蚜虫数量逐渐减少，表明蚜虫主动避开抗性基因型（图1C）。作为取食活动的指标，还测量了蜜露的分泌量。在HN16上取食48小时的蚜虫产生的蜜露显著少于BTx623上的蚜虫，表明在抗性宿主体上筛管元素的吸收受损（图1D）。总体而言，这些结果表明，高粱蚜虫在HN16上取食时面临较大的抗性压力。

**M. sorghi在抗性和易感高粱基因型上的表现**
(A) 幼苗阶段HN16和BTx623之间蚜虫抗性的表型比较。
(B) 感染后不同时间点在HN16和BTx623上取食的蚜虫数量。
(C) 双选择实验测量蚜虫随时间的偏好。每株植物释放五只成年蚜虫（在不同基因型之间距离相等），并记录它们在指定时间点的重新分布。
(D) 蚜虫在每个基因型上取食48小时后产生的蜜露。染色面积和强度反映了蚜虫的取食活动。B-D中的数据表示三次生物重复的平均值±标准误差。*P < 0.05；**P < 0.01（Student’s t检验）。

**转录组分析揭示差异表达基因**
为了揭示高粱蚜虫对宿主植物抗性的转录反应，在感染后0、3、6、12、24和48小时的HN16上喂养的蚜虫进行了RNA-seq分析，每个时间点三次生物重复。经过质量过滤和去除低质量读段后，每个文库平均产生6960万个清晰读段，其中6517万个（93.68%）唯一映射到M. sorghi参考基因组（表S1）。相关分析、主成分分析（PCA）和基因表达分布确认了生物重复之间的一致性（图S1）。使用变化倍数（FC）≥ 2和P < 0.05的阈值，在每个时间点识别差异表达基因（DEGs）（图2）。在五次比较（3小时、6小时、12小时、24小时和48小时与0小时）中检测到总共1,388个DEGs（图2A，表S2）。在所有比较中，上调基因的数量显著超过下调基因的数量（图2B）。DEGs的热图显示了蚜虫在抗性宿主体上取食时随时间变化的表达模式（图2C），反映了代谢和调控过程的动态变化。

**转录组分析**
在N. sorghi在抗性HN16上取食时的不同时间点的转录组分析。
(A) 显示各时间点DEGs重叠情况的示意图。
(B) 每个时间点上调和下调DEGs的数量。
(C) 显示3、6、12、24和48小时DEGs表达动态的热图。表达值相对于0小时对照组进行了归一化。DEGs的相对表达水平由条形图的颜色表示。

**蚜虫在抗性宿主取食期间的时间动态**
在1,388个DEGs中，1,372个基因被聚类为四个主要表达模式（排除16个未知新基因）。Cluster A包含在所有时间点都一致上调的316个基因。Cluster B包含在24小时主要下调的271个基因。Cluster C包含在24和48小时强烈上调的359个基因，而Cluster D包含在12小时表达达到峰值的426个基因（图3）。使用基因本体论（GO）分析推断这些簇的生物学功能。Cluster A富含与膜转运、信号转导和分子结合相关的基因。Cluster B富含与细胞外过程、蛋白水解和蛋白分解相关的基因。Cluster C主要与微管相关运动相关，而Cluster D包含参与转录调控和组织发育的基因（图3）。

**DEGs的表达聚类和GO富集**
值得注意的是，Cluster B包含多个参与细胞死亡和氧化还原稳态调控的基因（图3，S2A，表S3）。KEGG通路分析显示Cluster B在与细胞凋亡、异生物质代谢（包括细胞色素P450酶）和谷胱甘肽代谢相关的通路中显著富集（图S2B）。使用ClusterGVis根据所有时间点的表达谱将1,372个DEGs（排除16个新基因）分为四个簇。显示每个簇的代表性GO术语。红色和蓝色分别表示高表达和低表达。

**基因共表达网络识别候选效应因子**
为了识别参与蚜虫对植物抗性响应的调控基因，使用转录组数据进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。基于所有样本的基因表达构建了共表达网络。在材料和方法中过滤原始数据后，选择了前5,000个基因构建共表达网络。根据拓扑重叠矩阵（TOM）识别出八个主要的共表达模块，并用不同颜色标记（图4A，B）。

**WGCNA识别响应植物抗性压力的候选基因**
(A) 显示八个主要共表达模块的基因树状图，不同颜色的基因未分配到任何模块的基因归类为灰色。
(B) 层次聚类和模块特征基因邻接热图。
(C) 模块特征基因与蚜虫取食时间点之间的相关性热图。相关性系数较高的用更深色调显示。
(D) 识别与Cluster B相连的120个核心基因。
(F) 来自turquoise模块和Cluster B交集的核心基因的共表达网络。Turquoise三角形代表十个高度连接的候选基因。
(F) 显示十个候选基因在取食阶段表达谱的热图。数据基于TPM值以log2倍数变化显示。

**模块特异性时间表达特征**
为了表征模块特异性时间表达，将模块特征基因与六个取食时间点（0、3、6、12、24和48小时）相关联。Turquoise模块表现出与早期时间序列分析中的Cluster B相似的表达模式（图4C）。如前所述，Cluster B中的基因富含与应激响应相关的功能，包括细胞凋亡和解毒。这使我们进一步关注turquoise模块。使用基于特征基因的连通性（KME ≥ 0.8），从turquoise模块的1,584个基因中识别出966个枢纽基因，表明它们的潜在调控重要性（图4D）。为了精炼网络，将这些枢纽基因与Cluster B的基因相交，得到120个核心基因。这个网络中连接度最高的十个基因被指定为候选的应激响应调节因子（图4E）。热图显示了这十个候选基因在所有时间点的表达情况（图4F）。S4B）。随后，我们研究了在取食抗性高粱的蚜虫中观察到的行为改变是否由MsCathB1介导，因为这一信息对于理解蚜虫对抗性植物的反应至关重要。我们使用双链RNA（dsRNA）介导的RNA干扰技术来特异性沉默MsCathB1基因，以确定其在M. sorghi中的作用。qRT-PCR结果显示，与GFP-dsRNA对照组相比，经过MsCathB1-dsRNA处理的蚜虫中MsCathB1的表达显著降低（图5A）。沉默的蚜虫在形态上没有明显差异（图5A），但它们在抗性HN16上的存活率显著降低（图5B）。MsCathB1-dsRNA蚜虫产生的若虫数量也显著少于对照组蚜虫（图5C）。此外，我们采用了 ninhydrin显色方法来测量昆虫的蜜露分泌量，这反映了吸汁昆虫的食物摄入量。结果表明，MsCathB1-dsRNA蚜虫在抗性植物上分泌的蜜露量少于Mock处理或GFP-dsRNA昆虫在相同基因型上的蜜露量（图5D）。在易感的高粱BTx623上，也观察到了MsCathB1-dsRNA蚜虫的取食减少（图S5）。总体而言，这些结果表明MsCathB1对M. sorghi在高粱叶片上的取食适应性有正面影响。

图5
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
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RNAi介导的MsCathB1沉默会损害蚜虫在抗性高粱（HN16）上的取食和存活。
(A) 双链RNA（dsRNA）处理后，RNA干扰（RNAi）有效抑制了M. sorghi中的MsCathB1表达。未观察到明显的形态变化。蚜虫分别接受了MsCathB1-dsRNA（针对MsCathB1）或GFP-dsRNA（对照）处理。未处理的dsRNA组作为 mock对照。表达水平以β-actin作为参考基因进行标准化。
(B) 在MsCathB1被沉默的组中，成年蚜虫在HN16上的存活率显著下降，而对照组（GFP-dsRNA和mock）的存活率则未受影响。数据通过Kaplan-Meyer对数秩检验进行分析。
(C) 在HN16上取食的MsCathB1沉默蚜虫随时间的若虫总数也显著减少，而对照组没有这种现象。
(D) 在抗性品种HN16上取食的MsCathB1沉默蚜虫分泌的蜜露量减少。与其他处理的昆虫相比，这表明它们的食物摄入量较低。
图6
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MsCathB1抑制植物的防御机制
Papain样的半胱氨酸蛋白酶已被发现可以抑制多种病原体触发的植物模式免疫（PTI）（López-Solanilla等，2004；Zhu等，2004）。为了评估MsCathB1的潜在免疫抑制作用，我们在N. benthamiana叶片上进行了农杆菌介导的瞬时表达实验。使用由Phytophthora cryptogea分泌的10-kDa蛋白cryptogein作为阳性对照，以诱导防御相关基因的表达和细胞死亡（Lecourieux等，2002）。GFP作为阴性对照。MsCathB1-MYC、GFP和cryptogein-FLAG的表达构建体由CaMV 35S启动子驱动，并在烟草叶片中浸染48小时。单独的cryptogein诱导了明显的坏死和黄化。相比之下，MsCathB1与cryptogein的共表达抑制了坏死，表明MsCathB1干扰了cryptogein引发的细胞死亡（图6A）。免疫印迹分析确认了所有转基因的成功表达，并通过Ponceau染色验证了均等的蛋白质加载量（图6B）。
图6
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MsCathB1抑制植物的PTI
(A) 在N. benthamiana叶片中过度表达MsCathB1会抑制cryptogein诱导的细胞死亡。浸染后3天拍摄叶子。GFP作为阴性对照。
(B) 使用抗-MYC、抗-FLAG和抗-GFP抗体检测MsCathB1、cryptogein和GFP的表达。Ponceau染色显示蛋白质加载量相等。
(C) 渗染后36小时的DAB染色显示，MsCathB1的共表达抑制了N. benthamiana中的H?O?爆发。
(D) 定量测量H?O?含量证实，MsCathB1显著减少了cryptogein诱导的ROS产生。条形图上不同的字母表示基于Tukey’s HSD检验的统计显著差异（P < 0.05）。
鉴于ROS积累是植物免疫的一个标志（Lee等，2020；Weralupitiya等，2024；Gahlowt等，2025），我们研究了MsCathB1是否也抑制ROS的产生。DAB（3,3'-二氨基苄啶）染色显示，在表达cryptogein的区域有棕色沉积物，表明过氧化氢（H?O?）的积累。当MsCathB1与cryptogein共表达时，这种反应被消除（图6C）。定量分析进一步证实，与GFP对照组相比，MsCathB1显著减少了cryptogein诱导的H?O?积累（图6D）。值得注意的是，单独表达MsCathB1并未引起ROS积累或细胞死亡，表明它主要抑制免疫反应而不是触发它们（图6）。这些结果支持MsCathB1在抑制宿主PTI中的作用。

讨论
食草昆虫每年导致全球作物产量损失约20%（Van der Meijden等，2014）。其中，M. sorghi是高粱的主要害虫，威胁食品安全和作物产量。为应对这一挑战，我们研究了高粱抵御蚜虫侵染的分子机制以及蚜虫如何适应抗性基因型。通过将RNA-seq与RNA干扰（RNAi）相结合，我们发现了一种新的来自蚜虫的cathepsin类蛋白酶在调节植物防御反应中的作用，这为开发针对刺吸式昆虫的针对性害虫控制策略提供了见解。
在长期的进化互动中，高粱进化出了多种防御机制，这些机制的强度各不相同，包括物理屏障、防御相关的植物激素和代谢酶（Wang等，2013，2023；Thudi等，2024）。其中，RMES1位点包含两个串联的抗性基因RMES1A和RMES1B，它们编码调节免疫信号和关键防御反应的非典型抗性蛋白。先前的研究表明，蚜虫侵染会在携带RMES1的植物中引发ROS爆发和胼胝质沉积（Lei等，2024）。与此一致，我们的研究再次证实，取食抗性RMES1植物的蚜虫的存活率和取食活动显著低于取食易感野生型植物的蚜虫。此外，抗性和易感高粱植物的转录组比较显示，抗性品系中的几种NBS-LRR和疾病抗性蛋白可能为M. sorghi提供抗敌性和抗菌性，而与细胞壁修饰、光合作用和植物激素生物合成相关的基因也可能影响蚜虫的取食行为（Tetreault等，2019）。
植物通过产生有毒化合物来抵御食草昆虫，从而限制伤害（War等，2012；Hu等，2024）。在取食抗性高粱的蚜虫中，我们检测到了与凋亡信号通路相关的转录变化，凋亡在应激诱导的组织重塑和稳态中起着关键作用（Wu等，2013；Ren等，2021）。先前有研究表明，cathepsins在多种昆虫中参与了凋亡（Stoka等，2007），可能在其中起核心作用。在我们的研究中，取食抗性植物的蚜虫中有六个cathepsin B家族基因显著下调。值得注意的是，沉默MsCathB1（一种cathepsin B基因）显著降低了蚜虫的存活率和繁殖力，表明在宿主抗性反应中凋亡相关基因被抑制。这些发现支持了蚜虫对抗性高粱的反应涉及凋亡调节的模型。
此外，取食RMES1高粱的蚜虫在代谢和发育相关的基因中也表现出转录变化。DEGs在异生物质和谷胱甘肽代谢途径中富集——这些是关键的解毒过程，被认为可以对抗植物的化学防御（Vontas等，2002；Li等，2007；Koirala等，2022；Zhang等，2025）。能量代谢途径——包括戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、淀粉和蔗糖代谢以及花生四烯酸代谢——在Cluster B中显著富集。这些发现与先前的报告一致，即碳水化合物、糖胺聚糖和脂肪酸代谢为昆虫在抗性宿主上的维持和生长提供能量（Arrese和Soulages，2010；Dolezal等，2019）。这些发现表明，蚜虫对高粱抗性的反应部分通过调节细胞存活和解毒的应激响应基因网络来介导。然而，这些代谢基因的确切功能需要进一步探索。
Cathepsin B基因在蚜虫中大量扩增，有些基因在肠道中表达丰富。作为具有重要消化和水解功能的蛋白酶，cathepsin B蛋白在蚜虫从植物韧皮部汁液中提取营养的过程中起着重要作用（Cristofoletti等，2003；Liang等，2025）。此外，cathepsin B蛋白也在蚜虫的唾液腺中表达，并在取食过程中分泌到宿主细胞中（Ramsey等，2007；Cui等，2012）。本研究证明，MsCathB1蛋白含有信号肽作为分泌序列，表明MsCathB1可能在取食过程中分泌到植物组织中。
蚜虫还会向宿主植物细胞分泌效应蛋白来操纵免疫并促进取食。例如，Myzus persicae的唾液蛋白Mp1、Mp2、Mp55和MpMIF通过减少胼胝质沉积、过氧化氢积累或过度敏感的细胞死亡来抑制宿主防御（Pitino和Hogenhout，2013；Elzinga等，2014；Naessens等，2015；Rodriguez等，2017）。同样，S. miscanthi的效应蛋白Sm10和SmC002通过调节防御信号增强小麦的易感性（Fu等，2023）。在M. persicae中，cathepsin B家族蛋白已被确定为注入植物组织的主要毒液成分，它们被认为会影响宿主-病原体相互作用（Mathers等，2017；Guo等，2020）。可以推测MsCathB1蛋白可能具有相同的生物功能。在本研究中，MsCathB1促进了高粱蚜虫的取食并调节了植物防御，提供了证据表明MsCathB1可能是一种保守的效应蛋白，能够调节宿主免疫以利于蚜虫的表现。
所有食草半翅目昆虫都使用它们特化的口针刺穿植物组织并到达韧皮部以获取富含营养的汁液（Jiang等，2019）。一旦受到昆虫或病原体的攻击，ROS作为防御信号分子会在植物中迅速产生并大量积累，从而诱导程序性细胞死亡（Besson-Bard等，2008；Mignolet-Spruyt等，2016；Tetreault等，2019）。多项研究表明，在不同植物物种的维管束中检测到ROS，无论是在生物还是非生物压力下（Tanou等，2009；Gaupels等，2017）。RbohD沉默的烟草植物的功能丧失实验表明，ROS的积累会妨碍Myzus persicae的韧皮部取食（Guo等，2019）。维管组织的细胞质H2O2产生在触发细胞外木质素形成和细胞壁代谢中起作用，这是限制蚜虫侵染的有效方式之一（Laitinen等，2017；Rasool等，2017）。因此，M. sorghi似乎能够分泌MsCathB1来抑制植物中的ROS产生，从而促进其在韧皮部中的取食。
总之，比较转录组分析显示，蚜虫对抗性（HN16）与易感（BTx623）高粱基因型的反应与凋亡相关信号有关。加权基因共表达网络分析确定了十个候选DEGs，包括MsCathB1，它显著影响M. sorghi的取食行为并抑制植物中的cryptogein引发的免疫反应。这些发现不仅揭示了M. sorghi中的凋亡相关转录反应，还为基于RNAi的害虫控制策略提供了一个新的候选效应蛋白。未来的研究应集中在识别MsCathB1在高粱中的具体靶标，并阐明其抑制ROS产生和其他植物防御的机制。