在肉鸡日粮中可持续利用毕赤酵母（Pichia pastoris）副产物：对其生产性能及球虫病控制效果的影响

《Journal of Agriculture and Food Research》：Sustainable valorization of Pichia pastoris by-products in broiler diets: effects on performance and coccidiosis control

　　阿里雷扎·埃伊瓦克普尔（Alireza Eivakpour）| 穆罕默德·阿米尔·卡里米·托尔希齐（Mohammad Amir Karimi Torshizi）| 希玛·莫拉迪·卡尔博兰迪（Shima Moradi Kalbolandi）| 埃莱娜·瓦利贾尼安（Elena Valijanian）| 阿米尔·卡拉姆扎德·德哈加尼（Amir Karamzadeh Dehaghani）| 玛里亚姆·萨达特·萨法维（Maryam Sadat Safavi）
伊朗德黑兰塔尔比亚特莫达雷斯大学（Tarbiat Modares University）农业学院禽类科学系

**摘要**
本研究评估了在21日龄时，通过日粮补充低β-葡聚糖（LBG）和高β-葡聚糖（HBG）的毕赤酵母（Pichia pastoris）副产物对感染艾美球虫（Eimeria spp.）的肉鸡的生长性能和健康相关参数的影响。共有480只1日龄的阿里安（Arian）肉鸡被随机分配到五个日粮组：对照组（基础日粮）、0.5克/千克HBG组、0.5克/千克LBG组、1克/千克HBG组和1克/千克LBG组，每组72只鸡。与对照组相比，1克/千克LBG组显著提高了饲料转化率（FCR）（P < 0.05）。0.5克/千克和1克/千克HBG的日粮补充以及1克/千克LBG显著提高了欧洲生产效率（P < 0.05）。0.5克/千克和1克/千克HBG还显著增加了盲肠乳酸菌数量（P < 0.05）。此外，所有含有LBG和HBG的处理组与对照组相比，大肠杆菌数量显著减少（P < 0.05）。1克/千克LBG组的大肠损伤评分显著低于0.5克/千克HBG组和对照组（P < 0.05），而1克/千克HBG组空肠损伤评分也显著低于对照组（P < 0.05）。总体而言，本研究表明毕赤酵母副产物是一种可持续的益生元策略，有助于缓解球虫病。

**1. 引言**
毕赤酵母是一种广泛采用且高效的真核表达系统[1]。基因工程使得在这种酵母中生产多种重组蛋白成为可能，包括TNF-α、HBsAg和HSA[2]。其受欢迎的原因在于易于进行基因操作、能够进行真核生物翻译后修饰以及具有高水平的异源蛋白表达[3]。使用毕赤酵母及其类似微生物系统大规模生产蛋白质和其他有价值的产品会产生大量的细胞生物质副产物，通常达到数千吨，这些副产物常被视为废物[4]。可持续农业对于满足不断增长的全球食品需求同时最小化环境影响至关重要。循环经济框架强调通过副产物增值和资源再利用来减少废物，提供了一种有前景的方法。在这方面，从酵母残渣中提取功能性化合物（如来自毕赤酵母生产的化合物）体现了这一原则，有助于环境保护和更高效的废物管理[5]。这些化合物在食品、饲料、制药和化妆品行业有多种应用[6]。
由艾美球虫引起的球虫病是全球家禽产业面临的主要经济挑战，是影响家禽生产最具成本性的寄生虫疾病，估计每年造成的损失达数十亿美元[7],[8],[9],[10],[11]。艾美球虫属（Eimeria）中的E. necatrix、E. acervulina和E. maxima是最具经济意义的物种，导致严重的生产损失[12]。全球对艾美球虫感染影响的担忧日益增加，突显了它们在畜牧业和家禽生产系统中的重要性[13],[14]。
已经证明了酵母副产物的抗球虫作用机制，包括调节免疫反应、增强疫苗效果和促进肠道愈合[15]。重要的是，酵母副产物可能含有具有抗球虫活性的生物活性化合物，有助于减少卵囊的排出[15]。总体而言，这些机制表明，酵母衍生物产品是一种有前景的策略，可以改善感染球虫的肉鸡的肠道健康和生长性能，尽管需要进一步研究以完全阐明其作用机制。
鉴于关于毕赤酵母副产物在家禽中抗球虫特性的研究有限，本研究调查了日粮补充毕赤酵母副产物对感染艾美球虫的肉鸡生长性能和免疫功能的影响。

**2. 材料与方法**
所有实验程序，包括动物处理和管理，均得到了塔尔比亚特莫达雷斯大学研究伦理委员会（Animal Ethics Committee of the Research Ethics Unit of Tarbiat Modares University）的批准。
毕赤酵母废弃物生物质是酶生产过程中的副产物，来自Bioluence公司（伊朗德黑兰）。

**2.1. 成品的HPLC分析**
使用HPLC Kromasil NH2柱（250 × 4.6 mm, 5 μm）对高β-葡聚糖（HBG）和低β-葡聚糖（LBG）进行了高效液相色谱（HPLC）分析。样品用移动相（75%乙腈和25%蒸馏水）洗脱，流速恒定为1-5 mL/min。用于蒸发光散射检测（ELSD）的载气为氮气（压力：30-50 psi）。漂移管温度设定为40°C。使用葡萄糖和甘露糖溶液（1 M）作为标准品。通过将峰面积拟合到标准曲线方程来确定β-葡聚糖和甘露聚糖的含量。表1显示了高β-葡聚糖和低β-葡聚糖酵母副产物的化学组成。

**表1. 高β-葡聚糖和低β-葡聚糖含量酵母产品的化学组成**
| 化学成分 (%) | HBG | LBG |
|------------|------|------|
| 干物质 | 97.69 | 98.06 |
| 粗蛋白 | 33.60 | 46.80 |
| 灰分 | 14.22 | 13.35 |
| β-葡聚糖 | 28.01 | 14.80 |
| 甘露聚糖寡糖 | 5.32 | 5.12 |
| 核酸含量 | 9.15 | 11.57 |

**2.2. 养殖环境和日粮**
共480只1日龄的阿里安肉鸡雏鸡在到达时分别称重，并随机分配到五个实验组。每个处理组包括八个重复的地板栏舍，每个栏舍12只鸡（1 m × 1 m），共计40个栏舍。实验组包括：（1）不含添加剂的对照组基础日粮；（2）补充0.5克/千克HBG的基础日粮；（3）补充0.5克/千克LBG的基础日粮；（4）补充1克/千克HBG的基础日粮；（5）补充1克/千克LBG的基础日粮。所有日粮均不含抗生素或抗球虫剂，按照阿里安菌株的建议配制[16]。鸡在标准管理条件下饲养，在42天的实验期间记录了体重（BW）、饲料摄入量（FI）、体重增重（BWG）、饲料转化率（FCR）和欧洲生产效率因子等性能参数。栏舍被视为所有性能相关参数的实验单位。基础日粮的组成见表2。

**表2. 实验日粮和饲料成分**
| 组别 | 第1-14天 | 第15-24天 | 第25-35天 | 第36-42天 |
|------------|---------|---------|---------|---------|
| 玉米 | 50.96 | 62.67 | 66.64 | 68.61 |
| 大豆粉（44% CP） | 34.83 | 31.69 | 27.78 | 26.16 |
| 小麦麸 | 6.00 | | | |
| 玉米蛋白粉（68% CP） | 1.00 | | | |
| 大豆油 | 2.42 | 1.00 | 1.30 | 1.00 |
| 碳酸钙 | 1.21 | 1.07 | 1.00 | 1.01 |
| 二钙磷酸盐 | 1.82 | 1.71 | 1.47 | 1.48 |
| 维生素预混剂 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| 矿物质预混剂 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| DL-甲硫氨酸 | 0.33 | 0.31 | 0.27 | 0.26 |
| L-赖氨酸 | 0.30 | 0.26 | 0.26 | 0.23 |
| L-苏氨酸 | 0.14 | 0.13 | 0.13 | 0.10 |
| 食盐 | 0.26 | 0.21 | 0.21 | 0.21 |
| 碳酸氢钠 | 0.13 | 0.24 | 0.34 | 0.34 |
| 多酶 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
| 洗净沙子 | 0.11 | | | |
| 可代谢能量（kcal/kg） | 2870 | 2950 | 3025 | 3025 |
| 粗蛋白 (%) | 21.50 | 19.50 | 18.06 | 17.44 |
| 赖氨酸 (%) | 1.33 | 1.20 | 1.10 | 1.04 |
| 甲硫氨酸 (%) | 0.68 | 0.63 | 0.57 | 0.55 |
| 甲硫氨酸 + 半胱氨酸 (%) | 1.00 | 0.92 | 0.85 | 0.82 |
| 苏氨酸 (%) | 0.89 | 0.82 | 0.76 | 0.72 |
| 钙 (%) | 0.96 | 0.87 | 0.78 | 0.78 |
| 磷 (%) | 0.48 | 0.44 | 0.39 | 0.39 |
| 钠 (%) | 0.17 | 0.17 | 0.20 | 0.20 |
| 阳离子-阴离子平衡（meq/kg） | 240 | 230 | 225 | 220 |

***每千克日粮提供：12,000 IU维生素A，4,800 IU维生素D3，60 mg维生素E，3.24 mg维生素K3，3.24 mg维生素B1，7.8 mg维生素B2，3.6 mg维生素B6，2.4 mg维生素B9，0.02 mg维生素B12，54 mg烟酸，18 mg泛酸，0.2 mg生物素。**
****每千克日粮提供：144 mg锰，48 mg铁，120 mg锌，19.2 mg铜，1.5 mg碘，0.36 mg硒，1560 mg氯化胆碱。**

**2.3. 艾美球虫感染**
第21天，所有雏鸡口服给予含有7.5×103 E. acervulina、7.5×103 E. maxima和7.5×103 E. necatrix孢子的混合物。

**2.4. 血液采样和宰杀准备**
第42天，从每个处理组随机选择8只鸡，通过肝素化注射器从颈静脉采集血液样本。然后，将血液样本在900 ×g下离心10分钟以分离血浆。随后，对选定的鸡进行称重、安乐死，并使用精确到小数点的秤测量 carcass 组件和内脏的重量。
通过分光光度法（Agilent BioTek Epoch, USA）使用市售试剂盒（Pars Azmun, 德黑兰, Iran）测定血浆样本中的总蛋白、葡萄糖、尿酸、钙、胆固醇、磷、白蛋白、甘油三酯、球蛋白和白蛋白/球蛋白比率。

**2.5. 体液和细胞免疫反应**
第14天，每个栏舍注射2只鸡，每只注射0.5 mL 5%羊红细胞（SRBC）和0.2 mL 新城疫疫苗（Vaxxinova, 意大利）。第29天注射SRBC加强剂，并在第39天使用肝素涂层注射器采集血液样本。检测血清样本中的禽流感和新城疫病毒以及针对SRBC的总体特异性抗体反应。IgM和IgG抗体分别根据2-mercaptoethanol敏感性（2MES）和抗性（2MER）进行测定[17],[18]。
第40天，在右腿注射植物血凝素（PHA- Gibco, USA）0.1 mL，并在右腿上涂抹3滴10 mg/mL 2,4-二硝基氯苯（DNCB- Merck, 德国- 溶解在橄榄油和丙酮中，比例为1:4）。

**2.6. 盲肠微生物菌群**
宰杀后无菌收集1克匀浆的盲肠内容物样本，并在无菌生理盐水中按1:10进行系列稀释。取出每个稀释度的0.1 mL样本接种在平板计数琼脂、MacConkey琼脂和MRS琼脂上。所有培养皿在37°C下培养24小时，根据细菌种类生长特性决定是否计数。所有数据经过样本重量、稀释因子和转移到琼脂培养基的体积校正后，以log10 cfu/g表示。

**2.7. 胫骨相关参数**
收集孵化后42天安乐死的鸡的左腿，以测定胫骨参数。评估了以下骨骼特征：胫跗指数、髓管直径、坚固性指数、重量与胫跗长度比、骨强度、胫骨直径和胫骨重量，具体方法参见Mutus等人的描述[19]。

**2.8. 肉鸡小肠的组织形态学测量**
从每只鸡的十二指肠中部（胆管和梅克尔憩室之间）和空肠中部（梅克尔憩室和回盲部之间）获取1厘米长的肠道组织样本。这些样本用10%缓冲福尔马林固定，通过逐渐增加的酒精浓度（70%至100%）脱水，然后用二甲苯透明处理，并包埋在石蜡中[20]。使用切片机（Erma, 日本）切割5 μm厚的切片，放置于载玻片上，并用alcian blue - hematoxylin和eosin染色[20]。使用带有成像软件（Dino-Capture 2.0, 台湾）的卡尔蔡司标准显微镜（Carl Zeiss Standard 20）测量绒毛表面积、高度、隐窝深度、绒毛高度与隐窝深度比值和杯状细胞密度。

**2.9. 肠黏膜损伤严重程度评估**
根据Johnson和Reid的方法[22]，采用标准化量表评估小肠三个部分的球虫损伤程度，范围从0（无可见损伤）到4（严重损伤）。

**3.10. 统计分析**
所有数据最初使用Microsoft Excel（Microsoft Corp., Redmond, WA, USA）组织，随后使用SAS软件（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）进行分析。在统计分析之前，使用UNIVARIATE程序评估数据分布的正态性，并使用Levene检验评估方差齐性。数据采用完全随机设计的单因素方差分析（ANOVA）进行分析，每个处理组有八个重复。使用SAS的GLM程序（PROC GLM）进行统计分析。栏舍被视为所有性能相关参数的实验单位。当检测到显著的处理效应（P < 0.05）时，使用Tukey多重范围检验比较均值。

**3. 结果**
表3展示了毕赤酵母副产物日粮补充对肉鸡性能的影响。接受0.5克/千克和1克/千克LBG的肉鸡表现出最高的体重增重（BWG），显著高于接受0.5克/千克HBG的肉鸡（P < 0.05）。不同处理组之间的饲料摄入量无显著差异。1克/千克LBG组的FCR最好，显著优于对照组（P < 0.05）。0.5克/千克和1克/千克HBG的日粮补充以及1克/千克LBG也显著提高了欧洲生产效率（P < 0.05）。

**表3. 毕赤酵母副产物日粮补充对肉鸡性能的影响**
| 处理组 | 剂量（g/kg） | 饲料摄入量（g） | 体重增重（g） |**肉体特征**
表4展示了使用毕赤酵母（Pichia pastoris）副产品进行饮食补充对肉鸡肉体特征的影响。1克/千克LBG组的可烹饪肉体比例最高，显著高于其他处理组（P < 0.05）。添加1克/千克HBG和LBG的饮食补充显著增加了前胃的比例（P < 0.05）。1克/千克HBG组的砂囊比例最高，与其他所有处理组（除1克/千克LBG组外）有显著差异（P < 0.05）。此外，0.5克/千克LBG组的砂囊比例也高于0.5克/千克HBG组和对照组（P < 0.05）。0.5克/千克HBG处理组增加了整个肠道的比例，仅与1克/千克LBG组之间存在显著差异（P < 0.05）。添加1克/千克HBG和LBG的饮食补充显著减少了肝脏的大小（P < 0.05）。0.5克/千克HBG组增加了囊状物的大小，而0.5克/千克LBG组的囊状物比例较低（P < 0.05）。在不同处理组之间未观察到腹部脂肪或脾脏大小的显著差异。

**表4. 使用毕赤酵母副产品进行饮食补充对肉鸡肉体特征（克/100克体重）的影响**
| 处理 | 副产品剂量（克/千克） | 肉体 | 脾脏 | 前胃 | 小肠 | 腹部脂肪 | 心脏 | 囊状物 | 肝脏 | 砂囊 |
|-------|------------|-------|-------|-------|---------|---------|--------|--------|---------|-------|根据表8的数据，在HBG组中，每天补充1克/公斤的β-葡聚糖对艾美耳球虫（Eimeria necatrix）具有最明显的效果，而每天补充1克/公斤的LBG对感染十二指肠的艾美耳球虫种类则表现出更强的效果。这些差异可能反映了肠道免疫和微生物生态系统的区域特异性调节。较高的β-葡聚糖添加量可以增强中段肠道的黏膜免疫活性和上皮细胞再生，因为艾美耳球虫主要在中段肠道繁殖，从而限制其发展[44]。相比之下，LBG可能在近端小肠中发挥更强的益生元作用，促进有益微生物的增殖，并创造不利于艾美耳球虫定植的环境[46]。此外，酵母来源补充剂中的核苷酸丰富成分可能进一步支持上皮细胞的更新和免疫调节，从而发挥这些局部效应。

**5. 结论**
总的来说，啤酒酵母（Pichia pastoris）的副产物为肉鸡生产提供了一种可行且可持续的益生元策略，具有抗球虫特性。LBG和HBG对不同肠道段的差异性效应表明了它们具有针对性的作用机制。虽然LBG和HBG的副产物都能降低感染艾美耳球虫的肉鸡中的大肠杆菌水平及肠道损伤程度，但由于LBG在促进生长性能和乳酸菌数量方面表现更优，因此选择每天补充1克/公斤的LBG作为最佳添加剂量。

**作者贡献声明**
Maryam Sadat Safavi：写作、审稿与编辑、监督、资源管理、项目规划、概念构建。
Elena Valijanian：写作（初稿）、研究、数据管理、概念构建。
Amir Karamzadeh Dehaghani：写作、审稿与编辑、验证、资源管理、项目规划、资金筹集、数据管理。
Alireza Eivakpour：写作（初稿）、数据可视化、软件开发、研究、数据分析。
Mohammad Amir Karimi Torshizi：写作、审稿与编辑、监督、资源管理、方法论设计、资金筹集、概念构建。
Shima Moradi Kalbolandi：软件开发、方法论设计、研究、数据分析。

**利益冲突声明**
作者确认他们没有可能影响本研究结果的经济或个人关系。

**数据可用性声明**
本研究未使用任何新的数据。

**资金说明**
本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织提供的任何特定资助。