两种具有DNA嵌入和抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的芴基分子的光化学修饰

《Journal of Biological Chemistry》：Photochemical modification of two fluorene-based molecules with DNA intercalating and anti-methicillin resistant Staphylococcus aureus activity

　　

摘要 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是全球范围内皮肤软组织感染、心内膜炎和血流感染的主要原因。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant S. aureus, MRSA）的出现，以及对万古霉素等最后手段抗生素耐药性的不断增强，迫切需要具有独特作用机制的新型抗菌药物。本研究对DB10（一种在高通量筛选中鉴定出的、可抑制MRSA生长的平面芴基化合物）进行了表征。在UVA（长波紫外线）照射下，DB10会经历从红色形态（DB10-R）到黄色形态（DB10-Y）的光转化。与DB10-R相比，DB10-Y的疏水性降低，细胞毒性减小，并且对几种革兰氏阳性菌的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentrations, MICs）略有改善。DB10-Y可嵌入DNA并在细菌细胞内诱导双链断裂，并且在长时间的连续传代后，其耐药性仅以低水平出现。为了优化该骨架，研究人员筛选了一组芴类似物，并鉴定了具有光转化能力的类似物DB33，其黄色形态（DB33-Y）无毒且保留了DNA嵌入活性。DB33-Y可有效对抗巨噬细胞和内皮细胞内的金黄色葡萄球菌，并在小鼠皮肤感染模型中显著降低了细菌载量和病灶大小。在亚抑菌浓度下，DB10-Y和DB33-Y还能抑制α-溶血素（α-hemolysin）的表达，显示出额外的抗毒力效应。这些发现共同突显了基于芴的DNA嵌入剂作为一类对抗MRSA的新型抗菌和抗毒力药物的治疗潜力。

研究背景、问题与研究动机

金黄色葡萄球菌是一种重要的机会性病原体，可引起从浅表皮肤软组织感染到肺炎、骨髓炎和脓毒症等一系列严重疾病。其中，MRSA在全球医疗保健和社区环境中均是导致高发病率和死亡率的主要原因。更严峻的是，针对最后治疗手段（如糖肽类、脂肽类药物和利奈唑胺）的耐药性也日益增多。这种持续加剧的耐药性突显了迫切需要超越传统药物靶点（如细胞壁合成、蛋白质翻译和DNA复制）的新型抗菌剂。其中，通过嵌入和链断裂靶向细菌DNA的化合物（DNA嵌入剂）是一个有前景的类别。这类化合物的平面芳香结构可插入DNA双螺旋的碱基对之间，干扰复制、转录和修复等关键过程。然而，许多DNA靶向剂对宿主细胞的基因毒性、疏水性导致的溶解性差以及可能激活细菌SOS反应（一种全局应激通路，可通过易错DNA聚合酶增强诱变，从而加速耐药表型的出现）等问题，限制了其临床应用。尽管如此，其益处仍可能超过这些局限性，许多问题可以通过在确定合适的先导化合物后，进行理性的结构修饰来解决。

研究概述与意义

本研究定义了一种从抑制MRSA的高通量筛选中鉴定出的平面、红色、含芴化合物DB10的作用机制和活性谱。研究发现，在UVA照射下，DB10会发生从红色（DB10-R）到黄色（DB10-Y）的光转化。该结构变化略微降低了其对大多数测试细菌分离株的MIC，但显著降低了其疏水性和毒性。鉴于这些改进的特性，研究人员将DB10-Y作为先导化合物进行研究。结果显示，DB10-Y可嵌入DNA，并尝试在其亚抑菌浓度下传代培养以产生耐药性，但仅在46天后才出现低水平的耐药。为了探究该类分子的关键结构特征，研究人员获得了一系列芴类似物，并发现其中只有DB33保留了较强的抗菌活性。与DB10类似，DB33可嵌入DNA，但重要的是未观察到毒性。此外，DB33可有效对抗细胞内的金黄色葡萄球菌，并在小鼠皮肤感染模型中减少了细菌载量和病灶大小。在亚抑菌浓度下，研究人员还观察到DB10-Y和DB33-Y均可抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素（由hla基因编码）的表达，这表明了抗毒力效应。这些发现共同凸显了DB10骨架的治疗潜力，并强调了平面芳香族嵌入剂作为一类抗菌剂的更广泛应用前景。本研究发表在《Journal of Biological Chemistry》期刊。

主要关键技术方法

1. 1.
   高通量筛选与候选物鉴定：对Maybridge生物活性化合物库进行高通量筛选，鉴定出抑制MRSA USA300 LAC的活性化合物。在金属离子螯合剂Chelex-100处理的化学限定培养基中进行二次筛选，以识别具有稳健、不依赖于金属离子的活性抑制剂，从中选出了DB10。
2. 2.
   光转化表征：通过紫外-可见光谱监测DB10和DB33在UVA（365 nm）和UVB（254 nm）照射下的吸光度变化，确定其光转化特性。利用¹H NMR（核磁共振氢谱）分析光转化前后的结构变化。
3. 3.
   抗菌活性评估：通过微量肉汤稀释法测定DB10/33及其类似物对不同细菌（包括金黄色葡萄球菌多种菌株、其他葡萄球菌及非葡萄球菌）的最低抑菌浓度。通过菌落形成单位计数评估其杀菌效果。通过乳酸脱氢酶释放实验评估化合物对RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性。
4. 4.
   转录组学分析：对亚抑菌浓度DB10-R或DB10-Y处理1小时后的金黄色葡萄球菌USA300 LAC进行RNA测序，分析差异表达基因，以探究细菌的应答机制。
5. 5.
   DNA相互作用与损伤机制研究：采用溴化乙锭竞争性结合实验评估化合物对DNA的嵌入能力。通过中性/碱性琼脂糖凝胶电泳检测经化合物处理的细菌基因组DNA片段化情况，以评估DNA双链/单链断裂。通过质粒DNA体外切割实验和硝基蓝四唑实验评估其是否引起直接DNA断裂或活性氧生成。
6. 6.
   耐药性筛选与突变分析：在亚抑菌浓度的DB10-Y存在下，对USA300 LAC进行连续传代，筛选获得低水平耐药菌株。对耐药菌株进行全基因组测序，鉴定与耐药相关的突变位点。
7. 7.
   细胞与动物模型感染实验：在RAW264.7巨噬细胞、骨髓源性巨噬细胞和HMEC-1内皮细胞感染模型中，通过庆大霉素保护实验评估DB33-Y清除细胞内金黄色葡萄球菌的能力。建立小鼠皮下皮肤感染模型，将USA300 LAC与DB33-Y或载体对照共同注射，评估DB33-Y对病灶大小和皮肤组织内细菌载量的影响。

研究结果

高通量筛选鉴定出一种可光转化的MRSA抑制剂

在先前进行的高通量筛选中，研究人员重新分析了活性化合物，注意到其中约11%的化合物具有可能与DNA嵌入相关的平面芳香结构。其中，在化学限定培养基中仍保留活性的三种化合物包含吲哚、菲咯啉和芴核心。基于芴基化合物在该亚组中的相对普遍性及其在金属耗尽条件下的稳健活性，研究人员选择了DB10（一种含芴化合物）进行进一步研究。有趣的是，DB10在溶解并暴露于滤光日光下3-5天后，颜色会从红色逐渐变为黄色，表明其可能发生光转化，从而可能改变其生物活性。杀菌实验显示，在较低浓度下，黄色形式（DB10-Y）的抗菌效果优于红色形式（DB10-R）。光谱分析证实，UVA（而非UVB）照射可驱动DB10-R向DB10-Y的完全转化。NMR分析表明，光转化涉及共轭烯烃系统的氧化裂解，可能生成醛和水合醛产物。

光转化增强了DB10对革兰氏阳性菌的活性

研究人员测定了DB10-R和DB10-Y对多种菌株的MIC。两者在浓度≤ 50 μM时能抑制大多数测试的葡萄球菌分离株和其他一些革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌在测试浓度下无活性。与菌落计数结果一致，DB10-Y的MIC值持续略低于DB10-R，表明光转化后效力略有增加。

金黄色葡萄球菌在暴露于DB10-R和DB10-Y后改变其转录组

RNA测序分析显示，暴露于亚抑菌浓度DB10-R或DB10-Y 1小时后，金黄色葡萄球菌USA300 LAC分别有59和71个差异表达基因。两种处理均诱导了与应激和DNA损伤反应相关的基因表达。DB10-R处理导致编码Clp家族蛋白酶的clpB和clpC、SOS反应相关聚合酶umuC以及与热休克和Clp依赖性蛋白稳态相关的ctsR、mcsA、mcsB显著上调。DB10-Y则上调了霍利迪连接体解离酶rusA和单链DNA结合蛋白ssb。两种处理还显著上调了编码脲酶及其辅助蛋白的ureABCDEF操纵子。值得注意的是，两种形式的DB10都显著下调了包括spl丝氨酸蛋白酶样操纵子、编码α-溶血素的hla和编码白细胞毒素组分的lukD在内的多种毒力因子。这些数据表明DB10-Y引发了与DB10-R相似的转录变化。基于DB10-Y改善的溶解性和略有增强的效力，研究人员选择DB10-Y进行后续研究。

DB10-Y可嵌入DNA并导致细胞内双链DNA断裂

竞争性溴化乙锭嵌入实验表明，DB10-Y能以剂量依赖的方式竞争性置换DNA中的溴化乙锭，表明其可嵌入DNA。中性琼脂糖凝胶电泳显示，经DB10-Y处理的细菌基因组DNA中出现了更短的DNA片段积累，表明存在双链断裂，而碱性条件下未见单链断裂增加。然而，当在相同条件下处理纯化的质粒DNA或基因组DNA时，DB10-Y并未诱导链断裂，表明DNA链断裂是DB10-Y暴露引发的细胞过程（而非直接化学切割）的间接结果。硝基蓝四唑实验未检测到DB10-Y诱导的显著活性氧产生。此外，转录组分析未显示关键DNA损伤或应激反应基因（如recA和rexAB）上调，且这些基因的转座子突变体对DB10-Y的敏感性也未改变。这些结果共同表明，DB10-Y的主要作用机制涉及DNA嵌入，但可能还有其他机制共同作用导致其抗菌效应。

clpX基因的突变赋予了对DB10-Y的低水平耐药

通过在亚抑菌浓度DB10-Y存在下连续传代培养USA300 LAC约46天，研究人员获得了对DB10-Y稳定但低水平的耐药菌株。耐药培养物包含两个不同的亚群（YR-1和YR-2）。全基因组测序发现，两个亚群均在编码ATP依赖性伴侣蛋白的clpX基因内存在独特的单核苷酸多态性。YR-1在clpX转录起始位点上游有一个缺失，可能影响启动子功能。YR-2在密码子400附近有一个导致移码的缺失，导致提前出现终止密码子。有趣的是，在耐药菌株中过表达这些突变型clpX等位基因，并未进一步增加耐药性，反而使其敏感性恢复至接近野生型水平。对clp相关基因转座子突变体的筛选显示，clpB和clpC的突变体对DB10-Y的耐药性增加，而clpP和clpL的突变则未改变敏感性。这些结果表明，扰乱Clp介导的蛋白稳态可影响对DB10-Y的敏感性，但观察到的低水平耐药和耐药性出现所需的漫长时间表明，这些突变可能代表了次要的、脱靶的适应性变化，而非主要的耐药机制。

DB10-Y类似物的筛选鉴定出DB33-Y

为了确定DB10的关键结构特征，研究人员测试了七个保留了芴核心但侧链修饰不同的DB10结构类似物。其中只有一个类似物DB33对USA300 LAC表现出与DB10相当的强效活性。与DB10类似，DB33在UVA（而非UVB）照射下也会发生光转化，颜色从红变黄。溴化乙锭竞争性置换实验证实DB33-Y也能嵌入DNA。此外，先前对DB10-Y具有耐药性的clpX突变菌株YR-1和YR-2对DB33-Y也表现出耐药性，支持DB33-Y与DB10-Y具有共同的作用模式。有趣的是，一些没有明显抗葡萄球菌活性的DB10类似物也表现出一定程度的DNA嵌入活性，这表明嵌入本身并不足以产生抗菌效果，可能还需要细胞摄取或细胞内稳定性等其他特性。

DB33-R的分解产物具有生物活性

¹H NMR分析表明，DB33-R的光转化产生了多种降解产物，包括醛类和链缩短、氧化产物。通过高效液相色谱分离DB33-Y混合物，得到了四个主要峰。其中，峰“a”（DB33-Y-a）保留了与DB33-Y母体混合物相当的抗菌活性，并能置换DNA中的溴化乙锭，而其他峰则活性微弱或无活性，表明研究人员从多种分解产物中分离出了主要的活性成分。质谱分析和稳定性测试表明，DB33-Y-a是一个不稳定、动态混合的分解产物，而非单一稳定化合物。对DB10-Y的类似分析也分离出一个具有抗菌和DNA嵌入活性的主要峰（DB10-Y-a）。

DB33-Y可有效清除细胞内细菌储库

细胞毒性实验显示，与DB10的两种形式相比，DB33-Y对RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性显著降低。庆大霉素保护实验表明，在100 μM浓度下，DB33-Y可显著降低RAW264.7巨噬细胞、骨髓源性巨噬细胞和HMEC-1内皮细胞内金黄色葡萄球菌的水平，表明DB33-Y在无毒宿主细胞的浓度下可有效清除细胞内细菌。

DB33-Y可减少小鼠皮肤感染模型中的病灶大小和细菌载量

在小鼠皮肤感染模型中，与DB33-Y共同注射金黄色葡萄球菌并进行后续注射治疗的小鼠，在感染后72小时，其病灶大小显著小于对照处理组动物，皮肤组织中的细菌载量也显著降低，但降幅相对于病灶大小的减小较为温和。这提示DB33-Y可能部分通过减弱毒力（而非完全清除细菌）发挥作用。对分泌蛋白的分析证实，经DB10-Y或DB33-Y处理的细菌，其α-溶血素水平降低，这与RNA测序中hla基因表达下调的结果一致。

讨论与结论总结

讨论部分总结

本研究鉴定并表征了DB10和DB33这两种具有光转化特性的新型芴基化合物，它们对MRSA表现出抗菌和抗毒力活性。关键发现包括：

1. 1.
   光转化与性质改善：DB10在UVA照射下发生不可逆的光转化，从疏水性更强的红色形式（DB10-R）转变为水溶性更好、细胞毒性更低、抗菌效力略有提高的黄色形式（DB10-Y）。
2. 2.
   作用机制：DB10-Y和DB33-Y均可嵌入细菌DNA，并在细胞内诱导双链断裂。这种DNA损伤并非由化合物直接切割或活性氧介导，而可能是通过干扰DNA复制或转录等细胞过程间接引发。转录组学分析显示，化合物处理激活了涉及基因组维护和修复的细胞通路，但并未典型地上调RecA依赖的SOS反应核心基因，表明其可能激活了非传统的DNA损伤应答途径。
3. 3.
   低耐药性倾向：在DB10-Y亚抑菌浓度下长时间连续传代，仅能诱导出低水平的耐药性，且与编码伴侣蛋白的clpX基因突变相关，而非典型的DNA修复或外排泵基因突变，这提示高水平的耐药可能难以产生。
4. 4.
   结构活性关系：在测试的DB10类似物中，仅DB33保留了强效抗菌活性。DB33与DB10的区别仅在于侧链末端多了一个苯基。结构分析表明，有效的抗菌活性需要平面芳香核心与适当的侧链共轭体系，以确保DNA嵌入能力和细胞膜穿透性的平衡。
5. 5.
   活性成分的不稳定性：DB10-Y和DB33-Y的活性成分是光氧化产生的动态混合物，而非单一稳定化合物，这给其结构精确表征带来了挑战，但也可能贡献了其多靶点作用的特性。
6. 6.
   体内外有效性：DB33-Y在多种细胞内感染模型中能有效清除金黄色葡萄球菌，且细胞毒性低。在小鼠皮肤感染模型中，DB33-Y治疗能显著缩小病灶并减少细菌载量，其效果可能部分归因于其在亚抑菌浓度下抑制α-溶血素等毒力因子的表达，显示出抗毒力活性。

研究结论（翻译自原文“Together, these findings...”等部分）

总之，这些发现突显了基于芴的DNA嵌入剂作为一类对抗MRSA的新型抗菌和抗毒力药物的治疗潜力。DB10和DB33代表了有前景的、可进一步进行抗生素开发的骨架。适度的结构变化足以调节细胞毒性并保留DNA嵌入活性，使得DB33成为更具吸引力的后续研究分子。这些分子兼具杀菌和抗毒力的特性，可能使其能够根据感染的具体情况采取针对性的治疗策略。综合来看，其对MRSA的体外强效活性、在皮肤感染模型中的体内有效性以及有限的耐药性发展，都支持将该骨架作为治疗MRSA的有效选择进行进一步探索。