通过一种简便的生物矿化策略制备胰蛋白酶固定的金属有机框架-聚合物整体旋柱，以实现高效蛋白质组消化

《Journal of Chromatography A》：Fabrication of trypsin-immobilized metal-organic framework-polymer monolithic spin column through a facile biomineralization strategy for efficient proteome digestion

　　张胜满|徐凯|李冰洁|李兆前|周文秀|王鑫
上海交通大学药学院药物靶点识别与递送前沿科学中心，国家创新免疫治疗重点实验室，细胞与治疗性抗体工程研究中心，上海200240，中国

摘要
在这项工作中，通过一种简便的生物矿物化策略制备了一种新型胰蛋白酶固定的金属有机框架（MOF）-聚合物整体旋柱。该方法巧妙地利用整体结构提供多孔支撑，并通过MOF对胰蛋白酶起到保护作用。所制备的固定化胰蛋白酶反应器表现出比传统共价固定胰蛋白酶更高的酶-底物亲和力、更好的重复使用性和更长的储存稳定性。与自由胰蛋白酶消化相比，生物矿物化法固定的胰蛋白酶在pH值和热稳定性方面有所提高，消化时间显著缩短，同时由于可重复使用性而具有更好的经济性能，且消化活性未受损失。最后，通过小鼠肝脏蛋白质组学分析（重点关注溶液中的胰蛋白酶消化），发现使用该固定化胰蛋白酶旋柱消化后，能够鉴定出数量几乎是自由胰蛋白酶消化两倍的肽和蛋白质混合物，这些肽和蛋白质具有不同的分子量和等电点，并且水解时间也大大缩短（从14小时缩短至仅1小时）。因此，本研究开发的生物矿物化胰蛋白酶-MOF整体旋柱成为蛋白质组学样品制备中的先进工具，结合了高效性、快速性和耐用性，非常适合研究和临床应用。

引言
蛋白质组学是对体内参与各种生物过程的全球蛋白质进行的大规模分析。因此，蛋白质组学在许多生物医学领域发挥着重要作用，如疾病诊断、病理学研究和药物发现[[1], [2], [3], [4], [5]]。在蛋白质组学研究中，主要有两种研究策略：“自上而下”和“自下而上”策略，其中“自下而上”策略由于其更高的灵敏度和更广的覆盖范围而更为适用。在这种策略中，首先使用蛋白酶将生物样本中的蛋白质酶解为肽，然后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析[[6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]]。因此，蛋白质消化是“自下而上”蛋白质组学策略中的关键步骤，最常用的蛋白酶是胰蛋白酶，它选择性地切割蛋白质中的精氨酸和赖氨酸残基之间的肽键。然而，传统的溶液中的胰蛋白酶消化方法存在一些局限性，包括需要过夜孵育的时间较长、由于不可重复使用而成本较高，以及由于胰蛋白酶自溶导致的灵敏度较低[[12], [13], [14], [15]]。为了解决这些限制，开发了用于蛋白质组学样品制备的固定化酶反应器（IMER）[[12],[15],[16],[17],[18]]。已有多种材料被报道作为酶固定的固体支撑基质，如整体材料、金属有机框架（MOF）、纳米材料和膜。其中，整体材料因制备和功能化简单、表面积大、背压低、生物相容性好和稳定性高等优点而被广泛用于酶固定[[14],[17],[18],[19],[20],[21],[22],[23],[24]]。此外，整体材料可以以多种形式使用，例如整体柱、整体尖端、整体芯片，以适应不同的样品制备和分析需求。在这些整体格式中，旋柱特别适用于大规模蛋白质组学消化，因为它操作简便、通量高且成本低。对于整体材料上的酶固定，共价结合是一种传统且广泛使用的策略，其中在整体材料和酶的功能基团（如氨基、羧基和硫醇基团）之间形成共价键。在这种模式下，基于二环己基碳二亚胺介导的偶联[[18,19]]、戊二醛偶联[[20,21]]和硫醇-烯点击反应[[17,22]]的固定方法已经发展成熟。酶与整体材料的稳定且不可逆的共价连接可以防止酶从整体支撑中泄漏，并避免酶的自溶。然而，由于酶和整体材料之间的化学反应，酶的空间构象可能会受损，酶的活性位点也可能失活，从而导致催化活性降低[[17,22]]。

近年来，MOF作为一种高效的酶固定支撑材料逐渐受到关注，因为它具有可调的孔径大小、高孔隙率、大表面积和良好的稳定性[[25],[26],[27],[28],[29],[30],[31],[32],[33],[34],[35],[36],[37],[38],[39],[40],[41]]。迄今为止，有四种主要的将酶固定在MOF支撑上的策略：表面吸附、共价结合、孔渗透和生物矿物化[[25],[26],[27], [34]]。表面吸附涉及通过非共价相互作用将酶物理吸附到MOF表面，这种方法相对简单，通常能保持酶的天然结构和活性；然而，固定化酶的稳定性可能较低，且在操作过程中存在酶泄漏的风险。共价结合提供了强而稳定的结合，但同时酶的构象和基团完整性的不利变化可能会影响酶的活性。对于孔渗透固定，酶被引入制备好的MOF的孔中，因此需要严格控制MOF的孔径大小，这限制了其应用范围。与上述固定策略相比，通过生物矿物化进行原位包封酶的方法在酶-MOF设计中受到了越来越多的关注[[31],[32],[33],[34]]。这种策略在MOF结晶过程中将酶包封在其中，从而保持酶的三维结构和活性位点，确保生物催化活性得到保留甚至增强。同时，围绕酶形成的MOF外壳可以为酶提供保护作用，大大提高了酶的稳定性和耐受极端环境的能力，使酶可重复使用且经济可行。此外，无需考虑MOF的孔径大小与酶的大小之间的互补性，显著简化了酶固定过程[[31],[32],[33],[34]]。然而，一般认为生物矿物化是由带有负表面电荷的大分子与金属阳离子聚集诱导包封过程[[29]]；因此，通过生物矿物化制备的IMER通常适用于等电点较低的酶，如葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和脂肪酶[[27,28,32,36]]。最近，有一种动态缺陷生成机制被报道用于酶-MOF复合材料，其中酶作为“宏观配体”被包封在MOF内[[30]]。这样，更多的酶可以被固定在MOF中，而不受表面电荷的限制。

应当注意的是，粉末形式的酶固定MOF在高通量微反应器系统中存在挑战，如流动性不足、处理时间延长和操作稳定性差。此外，离心分离往往会导致粉末损失和潜在的交叉污染。将MOF与整体支撑结合使用可以有效克服这些缺点。因此， beberapa研究报道了使用改性聚合物整体材料的IMER[[23,35]]。然而，它们使用的传统分层自组装和共价结合制备方法操作复杂且耗时较长；更重要的是，酶活性位点失活的问题尚未完全解决[[23,35]]。在这里，我们开发了一种新型简便的生物矿物化方法来制备胰蛋白酶固定的MOF整体旋柱，该方法简单易用，同时表现出令人满意的酶活性、良好的储存稳定性和重复使用性。本工作中制备的固定化胰蛋白酶旋柱进一步用于小鼠肝脏蛋白质的消化，显示出优于自由胰蛋白酶的能力，工作流程简化且效率更高。

部分摘要
本工作中使用的所有化学品和试剂均从商业渠道购买，无需进一步处理，详细信息见补充材料。

母体整体旋柱的制备
母体整体通过热引发聚合制备。首先，混合4%（w/w 总量）的4-乙烯基苯甲酸（VA，功能单体）、16%（w/w 总量）的乙烯二甲基丙烯酸酯（EDMA，交联剂）、45%（w/w 总量）的1-丙醇和35%（w/w 总量）的丁烷-1,4-二醇（孔形成剂）；然后加入偶氮异丁氰酸酯（AIBN，引发剂）。

IMER制备条件的优化
为了获得具有最佳机械强度和渗透性的整体支撑，研究了单体、交联剂和孔形成剂的比例。孔形成剂比例的优化表明，80 wt%的临界阈值对于保持整体结构的完整性至关重要：低于80 wt%时，渗透性不足以实现离心流过；超过该比例则会导致结构坍塌。因此，在预聚物溶液中采用了80 wt%的孔形成剂。

结论
总之，我们成功设计并制备了一种新型IRMER，即Zn-BTC-trypsin@poly(VA-co-EDMA)旋柱，通过简便的生物矿物化策略将胰蛋白酶固定在MOF整体复合体上。这种IRMER显示出与自由胰蛋白酶相当的酶动力学性能，并显著优于共价固定的同类产品。此外，与自由胰蛋白酶相比，这种Zn-BTC-trypsin@poly(VA-co-EDMA)旋柱的水解时间大大缩短，稳定性更高。

数据可用性
数据将根据请求提供。

作者贡献声明
张胜满：概念构思、方法论、实验设计、验证、数据分析、撰写-原始草稿。
徐凯：可视化、撰写-审阅与编辑。
李冰洁：撰写-审阅与编辑。
李兆前：撰写-审阅与编辑。
周文秀：撰写-审阅与编辑。
王鑫：概念构思、方法论、撰写-审阅与编辑、可视化、监督、项目管理、资金获取。

利益声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。