红花中羟基红花黄A吸附行为的研究及其规模化制备技术：以一个案例为例

《Journal of Chromatography A》：Investigation of adsorption behavior and scale up for hydroxysafflor yellow A purification from Safflower: a case study

　　阿明·塔贝什（Amin Tabesh）、哈桑·雷扎杜斯特（Hassan Rezadoost）、马苏德·拉希米（Masoud Rahimi）、哈米德·雷扎·诺鲁齐（Hamid Reza Norouzi）、西蒙娜·费莱蒂（Simona Felletti）、阿尔贝托·卡瓦齐尼（Alberto Cavazzini）
伊朗德黑兰埃文（Evin）沙希德·贝赫什提大学（Shahid Beheshti University）药用植物与药物研究所植物化学系，邮编1983963113

**摘要**
鉴于天然提取物的复杂性，通常需要多个纯化步骤来满足对分离产物的严格纯度要求。在这种情况下，数学建模可以作为一种有用的工具，用于评估大规模纯化的可行性，并在不依赖传统试错方法的情况下找到最佳洗脱条件。在这项工作中，我们模拟了红花植物中主要生物活性色素羟基红花黄A（Hydroxysafflor yellow A，简称HSYA）的热力学行为，并在分析尺度下进行了梯度洗脱条件下的研究，以确定其在制备尺度下的最佳分离参数。通过所谓的反演方法在分析尺度上确定了吸附等温线参数，并在制备尺度上进行了进一步验证。该通用速率模型准确预测了洗脱曲线，同时考虑了固定相和流动相之间的所有质量传递阻力，模拟数据与实验数据之间具有极好的一致性。结果表明，通过优化工艺操作变量，HSYA的纯度从20%（粗提物）提高到了80%（富集后的纯度），并通过反相制备色谱法进一步提高到了95%。所提出的工作流程为使用富集和后续纯化技术纯化天然化合物提供了一种可扩展且可持续的策略。

1. **引言**
红花（Carthamus tinctorius L.）属于菊科（Compositae）植物[1]，是天然色素和生物活性化合物的宝贵来源[2]。这种植物中已鉴定出两类色素，即黄色和红色色素。黄色色素被用作食品和化妆品工业中的天然着色剂[3]。黄色色素的主要成分是羟基红花黄A（HSYA），这是一种醌查尔酮C-糖苷，它在心血管疾病、脑缺血、神经保护和抗氧化活性方面表现出显著的治疗潜力[3][4][5][6][7]。此外，HSYA还可作为评估红花相关产品质量的关键参考标志物[8][9][10][11][12]。然而，粗提物中类似成分的存在阻碍了HSYA的纯化。已经采用了多种传统方法从红花提取物中分离HSYA，包括大孔吸附树脂[9,10]、高速逆流色谱（HSCC）[13]、闪蒸色谱和制备反相色谱[14]。这些方法的纯度通常较低（通常<90%），回收率低，溶剂使用量高，且可扩展性有限。大多数情况下，最佳工艺条件是通过试错方法获得的。在这种情况下，数学建模可以在方法开发阶段预测洗脱曲线并确定适用于大规模色谱的最佳操作条件，从而节省时间和样品材料[15][19][20][21]。尽管具有这些优势，但关于数学模型在制备色谱中应用的报道仍然很少。Hooshyari等人[22]使用数学模型从大麻素L（Cannabis sativa L.）提取物中纯化了大麻二酚（cannabidiol），最终纯度达到了94%，纯度提高了150%以上；Benedini等人[23]利用数学模型优化了复杂混合物中蛋白质的纯化，纯度提高了34%；Hossainzadeh等人[24]应用数学模型纯化了口蹄疫疫苗，最终纯度达到了85%；Cavazzini等人[25]研究了肽在分析尺度下的保留行为和梯度洗脱条件等。本文旨在扩展和证明色谱建模在其他复杂天然基质中的适用性，进一步提高最终工艺性能。

从实际角度来看，为了实现更精确的模型以预测和优化洗脱曲线，估计目标化合物的等温线参数是一个关键步骤。已经使用了不同的技术来确定吸附等温线参数，包括：前线分析（FA）[26]、扰动法（PM）[27]、特征点前线分析（FACP）[28]和保留时间法（RTM）[29]。尽管这些方法应用广泛，但它们存在一些缺点，如需要相对大量的样品、溶剂和时间。另一种方法是所谓的反演法（IM），该方法可用于更准确和更快地确定单组分和竞争性等温线[29][30][31][32][33]。在这项工作中，首先使用大孔树脂对红花中的HSYA进行了两步纯化（富集步骤），最后使用十八烷基硅胶（octadecyl silica）达到所需的最终纯度95%。详细而言，在梯度洗脱条件下研究了HSYA的保留行为、相平衡和加载条件。然后，在保持固定相类型、线速度和等温线参数一致的情况下，将分析尺度下计算出的参数应用于制备尺度柱子中，以预测洗脱曲线。

2. **理论**
数学建模在色谱过程的放大和优化中起着至关重要的作用，特别是在天然化合物的制备规模分离中[22]。一个稳健的模型可以帮助优化操作条件并预测制备规模下的洗脱曲线[34]。在这项研究中，采用了通用速率模型（GRM）来描述HSYA在分析和制备大孔树脂柱中的传输和吸附行为。与其他简化模型（如理想模型、平衡分散模型（EDM）、传输模型和传输分散模型）相比，GRM提供了更详细的机制描述，特别适用于大颗粒固定相（如大孔树脂）[35,36]。模型中纳入了以下假设[37]：色谱过程是等温的，流动相的速度是恒定的（其可压缩性可以忽略不计），床层由球形且大小均匀的多孔吸附剂颗粒组成，床层径向的浓度梯度可以忽略不计。所需组分在孔表面和固定相流体之间达到局部平衡。分散系数是恒定的，径向分散可以忽略不计。基于上述假设，组分i在流动相和固定相中的质量平衡方程如下[28,36]：
(1) ?ci/?t + v ?ci/?z + 1/ε ε?kfirp [ci ? cpi(r = rp)] = Dai ?2ci/?z2
(2) εp ?cpi/?t + (1 ? εp) ?c*pi/?t ? Dpi εp 1/r2 ?2cpi/?r = 0
其中ci是流动相中组分i的浓度，cpi是孔内组分i的浓度，c*pi是固定相中吸附的组分i的浓度，ε和εp分别表示床层空隙率和颗粒孔隙率。Dpi表示颗粒内扩散，可通过方程(3)计算。Dmi是分子扩散，使用Stokes-Einstein方程(4)确定[29]。
(3) Dpi = εp(2 ? εp)2/Dmi
(4) Dmi = 2.74 × 10?? (Mw)?13
其中Mw是目标化合物的分子量。Dai表示轴向扩散，可根据Rastegar和Gu提出的方程计算[38]：
(5) Dai = 0.7Dmi + 2rpv ε 0.18 + 0.008(Re)?.??
其中rp、v和Re分别表示颗粒半径、线速度和雷诺数。组分i的膜质量传递系数（kfi）基于Wilson–Geankoplis相关性估计[39]：
(6) kfi = 1.09εDmi/dp (εdpv/Dmi)?.3

3. **材料与方法**
3.1. **柱子和材料**
HPLC级乙腈（ACN）购自DAEJUNG Chemicals and Metals Co.（韩国诗兴）。HPLC级水通过Millipore Milli-Q纯化系统（法国莫尔塞姆）获得。乙醇（99%）来自Kimia Alcohol Zanjan Co.（伊朗赞詹），三氟乙酸（TFA）购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）。尿嘧啶和BLUE dextran 2000（分子量：2000 kDa）也来自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）。
对于富集步骤，使用了Sun-resin New Materials Co.（中国陕西西安）生产的大孔CM2100树脂（聚苯乙烯-二乙烯基苯，PSDVB），粒径为100 μm，作为固定相。将其填充在不锈钢柱中：分析规模为250 × 4.6 mm，制备规模为250 × 20 mm。对于纯化步骤，使用了KNAUER（德国柏林）生产的商用C18柱：分析优化用的是5 μm粒径柱（250 × 4.6 mm），制备规模用的是10 μm粒径柱（250 × 16 mm）。
干燥的红花（Carthamus tinctorius L.）植物材料来自伊朗德黑兰SBU药用植物与药物研究所的许可标本馆。为了获得红花提取物，将50克粉末状植物材料与500毫升蒸馏水混合。将混合物在室温下超声处理30分钟。重复此提取过程三次以获得最大产量。超声处理后，过滤溶液以去除固体残留物，并使用旋转蒸发器蒸发溶剂以浓缩水提取物。

3.2. **仪器和方法**
所有分析和制备富集及纯化过程均使用KNAUER HPLC系统（德国柏林）进行，该系统配备了光电二极管阵列PDA检测器（Smartline 2800型号）和双泵（Smartline pump S1000）。泵具有两种可互换的头部，分析规模的流量为10 mL/min，制备规模的流量为500 mL/min。
对于从红花提取物中富集HSYA，流动相A由含有0.02% TFA的水组成，流动相B为99%乙醇。柱子先用10%的流动相B平衡5分钟，然后进行30分钟的线性梯度洗脱至50% B，再增加梯度至100% B并继续平衡5分钟。对于纯化，流动相A为含有0.02% TFA的水，流动相B为ACN。柱子先用10%的流动相B平衡5分钟，然后进行30分钟的线性梯度洗脱至45% B。然后将梯度增加到100% B，持续5分钟，然后用100% B对色谱柱进行再生，同样持续5分钟。所有的梯度操作都在适合色谱柱规模的恒定流速下进行（分析级为1 mL/min，制备级则根据色谱柱的尺寸进行比例调整）。在富集和纯化过程中收集的 fractions 使用HPLC在C18色谱柱（颗粒大小为5 μm，柱长250 × 4.6 mm）上进行脱机分析。流动相的梯度与纯化步骤相同。检测采用PDA检测器，在与HSYA相关的波长403 nm处进行。3.2.1 估算等温线参数的方法为了获得吸附等温线参数，通过注入浓度为8 g/L的HSYA溶液来记录过载洗脱曲线。使用逆向方法[25,44]计算等速洗脱条件下选定的点的吸附等温线参数。通过解质量平衡方程，生成模拟洗脱曲线，并与实验曲线进行比较。然后，通过最小化误差平方和的技术迭代调整等温线参数，以最小化实际数据与预测数据之间的差异。3.2.2 确定色谱柱的孔隙率、孔隙分数和固相孔隙率确定色谱柱的孔隙率、孔隙分数和固相孔隙率对于模拟峰形和位置非常重要[28,34]。为了计算总孔隙率（εt），注入尿嘧啶作为示踪剂来确定色谱柱的死体积（V0），包括固相孔体积（Vp）和间隙体积（Vint）。然后根据方程（14）通过将V0除以色谱柱体积（Vc）来获得εt。然而，为了使用方程（15）得到孔隙分数（ε），则使用蓝色右旋糖酐来专门确定间隙体积。最终，使用方程（16）计算固相孔隙率（εp）。(14) εt = V0 / Vc (15) ε = Vint / Vc (16) εp = εt ? ε1 ? ε

4. 结果与讨论
4.1 HSYA的提取、富集和纯化
在本研究中，采用三步过程——提取、富集和纯化——以达到所需的纯度。在提取过程中，使用超声波辅助方法从红花（Carthamus tinctorius）中提取黄色色素，溶剂为水[45]。通过比较HSYA的峰面积与总峰面积（图1A），确定该阶段的纯度为20%。提取步骤之后，进行了富集过程以去除主要杂质。在分析级和制备级，均使用大孔树脂色谱法分离残留杂质。在本研究中使用的大孔树脂（如基于聚苯乙烯-二乙烯基苯（PSDVB）的CM2100树脂）由于其独特的结构特性，在此分离过程中起着关键作用，这些特性包括较大的孔径（通常为50–1000 nm）、高比表面积以及疏水性的聚苯乙烯-二乙烯基苯基质[46]。这些特性有助于高效吸附极性但中等疏水性的分子，如HSYA。即使在过载条件下，它也能提供高载能力，并且结合梯度洗脱时具有优异的选择性。

开发了一个数学模型，使用GRM来评估关键的操作参数，包括负载浓度、注射液体积和色谱柱尺寸，以及优化分析级中的吸附等温线参数。优化后的参数随后被放大到制备级，并根据实验数据进行验证。在富集过程的建模第一步中，估算吸附等温线参数对于准确预测洗脱曲线至关重要。在这方面，估算梯度洗脱条件下的等温线参数是一个关键目标。为了确定HSYA在梯度条件下最合适的洗脱范围，进行了指定浓度的过载测试。图2显示了在分析级梯度洗脱条件下注入一定量HSYA溶液（50 μL）（过载浓度为8 g/L）获得的实验色谱图。如图2所示，主峰在大约22分钟的保留时间内被洗脱出来。考虑到系统的停留体积，这个保留时间对应于约32.5%的乙醇（作为有机改性剂）的流动相组成。因此，在接近HSYA在梯度运行过程中洗脱的关键组成的28–34%乙醇狭窄范围内选择了等速数据。

对于选定的等速点对HSYA的保留行为敏感性进行了研究，在HSYA无限稀释的情况下（0.2 g/L，50 μL），如图S1所示。随着乙醇百分比从28%增加到34%，HSYA的保留因子从1.63变为0.64。为了更好地了解HSYA的保留行为，采用了化学计量置换模型（SDM）[43,47]。根据该模型，保留行为受到溶剂分子在疏水性固定相上置换吸附分子的影响。它有助于估算替换单个吸附分析物分子所需的溶剂分子数量，从而预测溶剂强度函数的保留趋势[48]。

然后应用逆向方法来确定HSYA的等温线参数。在大孔树脂上，评估了几种吸附模型，包括Langmuir、Freundlich和Freundlich-Langmuir模型。在这些模型中，Langmuir模型对实验洗脱曲线提供了可接受的拟合。如图3所示，对于选定的三个等速点28%、30%和34%（其他等速点见图S3），使用GRM得到的实验和模拟洗脱曲线之间有很好的一致性，能够在质量传递受限的大孔树脂中进行精确预测。从图3可以看出，模拟的洗脱曲线显示的峰高略高于实验数据，这可能是由于实验装置中观察到的检测器饱和效应所致[51]。

为了进一步验证等温线模型的有效性，在等速条件下对HSYA浓度为8、16和24 g/L进行了额外的过载实验，其中有机改性剂的浓度为28%。所有实验均使用恒定的50 μL注射液体积。如图S4所示，GRM得到的模拟洗脱曲线与实验数据非常匹配，证实了Langmuir等温线模型能够充分描述HSYA在CM2100树脂上的吸附行为。值得注意的是，高精度的预测可以归因于GRM模拟轴向分散的能力，这可能会影响与大孔树脂相关的大颗粒尺寸分布所导致的带宽扩展[28]。此外，作为有机改性剂的乙醇的相对低强度洗脱和表面流动性限制了流动相与固定相之间的质量传递速率，从而影响目标分子的带宽扩展[52]。尽管存在上述限制，但平衡等温线比其他与准确预测洗脱曲线相关的现象更为重要[29]。

表2展示了不同有机改性剂百分比下获得的最佳等温线参数。如前所述，根据方程（11），通过拟合实验数据（图4），分别得到了梯度洗脱模式下的S和b0的量为34和2062 L/g。此外，在梯度模式下，通过平均等速条件下获得的值来确定饱和容量（qs），因为在等速条件下获得的饱和容量没有显著差异。平均值为18 g/L，用于模拟梯度洗脱。这些值被代入方程（12）中使用GRM和边界条件来模拟洗脱梯度条件。

基于图4中拟合的数据和使用GRM获得的参数，模拟了梯度条件下的洗脱曲线。图5显示了HSYA溶液在浓度为8、16和24 g/L时的梯度洗脱曲线。模拟洗脱曲线与实验结果吻合度良好，证实了所选狭窄等速范围（28–34%乙醇）对于准确估算等温线参数的有效性。从图5可以看出，实验和预测的洗脱曲线在带宽和保留时间方面有很好的一致性，而16和24 g/L浓度下的峰强度略高于实验记录的值（保留时间的均方根误差（RMSE）< 4%，带宽的RMSE < 8%）。这种差异主要归因于实际运行中遇到的检测器饱和或过载效应，这可能导致色谱图中信号压缩和峰强度的欠表现[51]。总体而言，这些结果展示了GRM在捕捉大孔树脂梯度洗脱过程中非线性吸附等温线和质量传递现象方面的优势，特别是对于像HSYA这样的极性天然化合物。成功预测过载行为进一步强调了结合严格机制建模的大孔树脂色谱法在高效富集过程中的适用性。成功地将分析确定的等温线和传质参数直接应用于制备规模，而无需进行任何调整，这凸显了机理建模在优化操作条件以及可靠预测HSYA富集过程放大过程中的洗脱曲线方面的强大作用。此外，粗提物中存在的杂质并未影响模拟结果中产品峰的位置。

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图6. 制备规模下实验与模拟洗脱曲线的比较。粗提物浓度：100 g/L；进样体积：1000 μL；流速：18 mL/min；波长：403 nm。

从优化后的富集步骤中获得的主要组分通过离线高效液相色谱（HPLC）进一步分析（图1B）。观察到纯度从粗提物中的20%提高到了富集后的80%（提高了300%）。需要注意的是，此阶段的总产率（进料样品中收集的组分质量与产品质量之比）接近产品的74%。

在最后的纯化步骤中，使用了C18色谱柱。首先，在分析规模上系统地优化了洗脱方法，以实现HSYA与其他杂质之间的显著分离，然后将该洗脱方法转移到制备色谱柱（250 × 16 mm，10 μm）上，同时保持线速度和固定相类型不变。根据公式17计算，制备规模下的流速为6 mL/min。相应地，将1 mL浓度为20 g/L的富集提取物溶液加载到制备色谱柱中。包含HSYA的主要峰被收集并通过离线分析HPLC进行进一步分析（图1C），纯度进一步提高到95%（提高了375%）。

（17）FPrepFana=LPrepLana(rPreprana)2DanaDPrep

其中，L、r和D分别代表分析色谱柱和制备色谱柱的流速、长度、半径和粒径。

4. 结论

在这项工作中，首先使用逆向方法在分析规模上对红花提取物中的HSYA进行了富集和纯化过程建模，研究了保留行为、相平衡和装载条件。然后直接利用模拟结果将方法放大到制备规模，同时保持固定相类型、线速度和等温线参数不变，从而实现了最终产品纯度从20%提高到95%，提高了375%。

这项概念验证研究表明，色谱建模可以作为一种有用的策略，将纯化和分离过程从分析规模转移到制备规模，无需进行耗时且资源密集的试错实验，有助于工艺开发的绿色转型。

需要注意的是，这种方法可以应用于其他相关情况，通过根据目标分子、色谱系统和实验条件评估和更新等温线参数来实现。

作者贡献：
CRediTAmin Tabesh：方法学、实验、可视化、软件、验证、初稿撰写。
Hassan Rezadoost：项目管理、监督、概念化、数据管理、审稿与编辑。
Masoud Rahimi：监督、数据管理及验证、审稿与编辑。
Hamid Reza Norouzi：监督、数据管理及验证、审稿与编辑。
Simona Felletti：监督和审稿与编辑。
Alberto Cavazzini：最终稿撰写及审稿与编辑。

CRediT作者贡献声明：
Amin Tabesh：初稿撰写、可视化、验证、软件开发、方法学研究、数据分析。
Hassan Rezadoost：审稿与编辑、项目监督、数据管理、概念化。
Masoud Rahimi：审稿与编辑、验证、监督、数据管理。
Hamid Reza Norouzi：审稿与编辑、验证、监督、数据管理。
Simona Felletti：审稿与编辑、监督。
Alberto Cavazzini：审稿与编辑。