异丙硫醇烷通过抑制Wnt信号通路，损害斑马鱼胚胎的心脏和血管发育

《Journal of Environmental Sciences》：Isoprothiolane impairs heart and vascular development in zebrafish embryos through inhibition of Wnt signaling pathway

　　尹楠|黄丽荣|孟云龙|查雯雯|李海宁|刘康宇|谢远海|钟泽琳|陈建军
同济大学医学院普陀人民医院神经外科，上海200060

**摘要**
异丙硫醚是一种广泛使用的有机硫杀菌剂，在全球地表水中其浓度范围从纳克到微克每升不等。然而，它对脊椎动物的毒性作用仍知之甚少。在这项研究中，我们使用斑马鱼来评估异丙硫醚的发育毒性。转基因斑马鱼系Tg(myl7:GFP)和Tg(fli1:GFP)在受精后6至72小时（hpf）被暴露于异丙硫醚中。通过H&E染色、免疫荧光染色和Western blot技术评估早期心血管发育和损伤情况，同时通过行为分析评估运动活性。我们观察到剂量依赖性的心血管毒性，包括心包水肿、心脏线性化、心率异常、心肌细胞数量减少以及血管分支受损，伴有细胞增殖抑制和凋亡增加。转录组分析确定Wnt通路抑制是这些缺陷的关键机制。此外，使用Wnt通路激动剂BML-284处理后，斑马鱼的心血管缺陷和发育异常部分得到缓解。因此，这些发现表明异丙硫醚通过抑制Wnt信号通路来干扰心血管发育，为杀菌剂引起的发育毒性提供了新的见解，并有助于有机硫农药的生态风险评估。

**引言**
随着农药在农业中的广泛使用，环境健康问题日益严重。农药残留通过地表径流进入水体，对水生生态系统和人类健康构成潜在威胁（Stehle和Schulz, 2015; Tudi等, 2021; Li等, 2025）。流行病学研究将孕期接触农药与新生儿出生缺陷和心血管异常的风险增加联系在一起，强调了了解常用农业化学品的发育毒性机制的必要性（Swartz等, 2015; Pagliaccio等, 2020）。在各种农药残留物中，有机硫杀菌剂在水环境中的检出频率较高（Campanale等, 2023）。在欧洲的地表水中，有机硫杀菌剂是最常见的污染物之一，其浓度超过除草剂和杀虫剂，对水生生物具有高度毒性（Zubrod等, 2019; Campanale等, 2023）。异丙硫醚（IPT）是一种高效的有机硫杀菌剂，用于控制稻瘟病等真菌疾病（Bi等, 2023; Zhu等, 2024），它主要通过抑制真菌中的磷脂酰胆碱合成来破坏细胞膜完整性并阻止病原体生长（Wang等, 2018）。环境监测研究表明，农业水环境中存在IPT，不同监测场景下的浓度差异很大。在农业地表水中，异丙硫醚的浓度通常在μg/L水平（Berg, 2001; Minh等, 2007）。例如，一项针对越南湄公河三角洲地区多个饮用水源的研究报告的最大异丙硫醚浓度为8.49 μg/L（Chau等, 2015）。而在稻田环境中，应用后峰值浓度可能更高。在稻田养殖区，稻田表面水中的残留物浓度可达9.37 mg/L，表明这些环境中的生物可能经历间歇性高浓度暴露（Abd Rahman等, 2019）。此外，异丙硫醚也在稻田土壤中被检测到，其浓度高达34.81 ng/g，表明该化合物不仅存在于水生系统中，还能在土壤环境中积累（Inao等, 2018; Zaidon等, 2019）。IPT具有中等持久性，可能在环境中长期存在，增加持续暴露的可能性（Tsuda等, 1997; Lewis等, 2016; Inao等, 2018）。鉴于其广泛的环境存在和暴露风险，研究其发育毒性对于保护水质和指导农业生产实践非常重要（Mahler等, 2021; Kar等, 2024; Zhang等, 2024）。由于IPT直接存在于地表水中并直接与水生生物（尤其是鱼类）接触，其毒性作用值得关注（Lewis等, 2016）。先前的研究表明，IPT会导致肝脏和胰腺毒性、肠道微生物群失调、甲壳类的免疫应激反应、鱼类的血液学改变、氧化应激和免疫功能障碍（Saravanan等, 2015）。然而，它对早期胚胎发育（尤其是心血管发育）的影响及其潜在的分子机制仍很大程度上尚未探索，严重限制了全面的环境健康风险评估（Liess等, 2013）。心血管系统是脊椎动物胚胎发育过程中最早形成的器官系统，其正常发育对生存和后续生长至关重要（Xie等, 2016; Yang等, 2024）。心脏发育涉及复杂的、严格调控的过程，包括细胞增殖、分化、迁移和形态发生，需要离子通道、生长因子和转录因子之间的精确协调（Peralta等, 2013; Bournele和Beis, 2016; Rasouli和Stainier, 2017; Wu等, 2020）。全面筛查方法表明，许多农业化学品在环境相关浓度下会影响心血管发育（Moschet等, 2014）。与传统哺乳动物模型相比，斑马鱼在评估药物毒性和安全性方面具有独特优势，适用于高通量药物筛选和毒性评估（Rombough, 2002; Alday等, 2014; Truong等, 2014; Vornanen和Hassinen, 2016）。它们已成为研究心血管发育和评估环境化学毒性的优秀模型（Gut等, 2017; Carles等, 2018）。包括Wnt、Notch、FGF、VEGF和视黄酸在内的多种信号通路对斑马鱼的心血管发育至关重要，调控心脏祖细胞分化、心管形成、环状形态发生和心室分化等过程（Bakkers, 2011; Noseda等, 2011; Paige等, 2015）。这些通路以精确协调的时空方式相互作用，以确保正确的心血管模式。环境污染物已被证明会破坏这些保守的信号网络，导致斑马鱼胚胎的心脏畸形（Incardona等, 2004）。然而，IPT是否通过调节这些发育信号通路来影响心血管发育尚不清楚。

**研究目的**
本研究旨在从多个角度调查斑马鱼暴露于异丙硫醚的潜在毒性，包括形态变化、细胞增殖和凋亡、运动行为以及转录组变化。通过阐明异丙硫醚诱导毒性的潜在机制，并确定能够缓解这些毒性作用的潜在药物，本研究有助于更好地理解与IPT暴露相关的环境危害，并为减轻其心血管毒性提供策略。考虑到环境相关性和对机制毒理学评估的需求，选择了1.5 mg/L作为环境相关浓度，因为它位于东南亚集约化水稻种植区水体的峰值浓度范围内；同时包括3.0 mg/L和4.5 mg/L作为更高暴露浓度，以确定剂量依赖性效应并进一步探索毒性机制。

**部分内容**
**斑马鱼饲养和胚胎收集**
本研究使用的所有斑马鱼均来自中国斑马鱼资源中心（武汉）。斑马鱼生活在循环水系统中，水质参数符合标准要求，温度为28 ± 0.5 °C，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。斑马鱼每天喂食三次完全孵化的卤虫。本研究中使用了野生型AB系和两个转基因斑马鱼系：Tg(myl7:GFP）（特异性表达绿色荧光蛋白）。

**异丙硫醚暴露导致斑马鱼胚胎的心血管发育缺陷**
为了评估IPT的发育毒性，斑马鱼胚胎被暴露于不同浓度下，并监测存活情况。结果发现，24 hpf时的半数致死浓度（LC50）为13.99 mg/L，48 hpf时为9.412 mg/L，72 hpf时为6.18 mg/L，96 hpf时为5.17 mg/L（图1a）。此外，与对照组相比，48 hpf至96 hpf期间的孵化率呈剂量依赖性下降（图1b）。这些结果表明，IPT具有显著的发育毒性。

**讨论**
异丙硫醚作为一种自20世纪70年代以来在亚洲水稻种植区广泛使用的杀菌剂（Wang等, 2018），在促进粮食生产和保障食品安全方面发挥了重要作用。然而，关于其对非目标水生生物的潜在风险的研究仍然有限。为了填补这一空白，我们利用斑马鱼（Danio rerio）作为模型，阐明了IPT引起的急性心血管毒性并确定了背后的分子机制。

**结论**
总之，我们发现IPT暴露会导致斑马鱼早期发育过程中出现显著的心血管缺陷，包括心包水肿、心脏线性化、心率异常和血管分支受损。转录组和qPCR分析表明，这些效应是通过抑制Wnt信号通路介导的，而BML-284通过激活该通路来减弱IPT引起的毒性。这些发现为评估IPT的毒性提供了科学依据。

**作者贡献声明**
尹楠：撰写原始草稿、调查、正式分析、概念化、数据管理、验证。
黄丽荣：撰写原始草稿、正式分析、概念化、方法学、数据管理、验证。
孟云龙：软件、方法学、调查、数据管理、验证。
查雯雯：方法学、调查、数据管理、验证。
李海宁：方法学、数据管理、验证。
刘康宇：数据管理、验证。
谢远海：数据管理。

**数据可用性**
本研究使用和分析的数据集可应要求从相应作者处获取。

**伦理批准和参与同意**
所有斑马鱼的实验程序均按照实验室动物护理和使用指南进行，并获得了同济大学医学院（上海）机构伦理委员会的批准。