从灰色关联网络药理学筛选到机制阐释：来自瞿麦精油（Pimpinella diversifolia）中的4-甲氧基-2-(3-甲基乙氧基乙烷)-苯基异丁酸通过靶向GSK-3β/NF-κB轴缓解D-GalN/LPS诱导的急性肺损伤（ALI）

《Journal of Ethnopharmacology》：From Grey Relational-Network Pharmacology Screening to Mechanism Elucidation: 4-methoxy-2- (3-methylethoxyethane) -phenylisobutyrate from Pimpinella diversifolia Essential Oil Alleviates D-GalN/LPS-Induced ALI by Targeting the GSK-3β/NF-κB Axis

　　阮楠唐|彭素瑜|王佳雯|刘宇|秦润泽|黄泽鑫|曹若宁|张春春|李美雅|蒋福生
浙江中医药大学生命科学学院，中国浙江省杭州市310053

摘要
民族药理学意义
Pimpinella diversifolia DC.是一种在畲族和苗族医药中使用的传统草药。其根油（PDREO）已被证明具有肝保护作用，但其活性成分及其对抗急性肝损伤（ALI）的作用机制仍不明确。

研究目的
本研究旨在系统地鉴定PDREO中的关键抗炎和抗氧化成分，并阐明它们对抗ALI的分子作用机制。

材料与方法
在D-半乳糖胺/脂多糖（D-GalN/LPS）诱导的急性肝损伤小鼠模型中评估了PDREO的保护作用。通过硅胶色谱法对PDREO进行分离，并在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中评估了各分馏物的抗炎和抗氧化活性。采用气相色谱-质谱（GC-MS）指纹图谱结合灰色关联分析技术筛选生物活性成分。通过网络药理学和分子对接技术预测靶点，随后通过细胞热位移测定（CETSA）和生物层干涉测量（BLI）进行验证。进一步在体外和体内探究了主要化合物的作用机制。

结果
PDREO显著改善了D-GalN/LPS引发的小鼠肝损伤、炎症和氧化应激。鉴定出6种生物活性化合物，其中4-甲氧基-2-(3-甲基氧杂环丁基)苯基异丁酸酯（化合物P59）表现出最强的活性。网络药理学和分子对接分析预测糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是关键靶点。CETSA和BLI证实P59直接与GSK-3β结合。机制研究表明，P59通过抑制GSK-3β的磷酸化发挥作用，进而抑制NF-κB p65的核转位，并下调促炎细胞因子。这些效应在LPS刺激的巨噬细胞和D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤小鼠模型中均得到一致观察。此外，p65过表达会削弱P59对促炎细胞因子分泌的抑制作用，验证了NF-κB是GSK-3β/NF-κB轴的关键下游效应器。

结论
本研究揭示PDREO通过抗炎和抗氧化作用缓解急性肝损伤。化合物P59被确定为关键活性成分，它通过直接靶向GSK-3β并抑制GSK-3β/NF-κB信号通路发挥肝保护作用。我们的发现为P. diversifolia的传统用途提供了药理学依据，并表明P59是开发急性肝损伤药物的有希望的候选分子。

引言
肝脏是人体最大的实质器官，负责多种生理功能，如代谢、外源性化合物的分解、血容量调节和免疫调节（Trefts等人，2017年）。尽管近年来生活条件逐渐改善，但肝病的发病率仍在上升；根据2023年的统计报告，每年有超过200万人死于肝病，占全球死亡人数的4%（Devarbhavi等人，2023年）。急性肝损伤（ALI）是导致肝病相关死亡的因素之一，其特征是突然发作、快速进展和高死亡率。它通常表现为大规模且突然的肝细胞损伤，导致肝功能异常；临床上表现为天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和胆红素水平升高（Koch等人，2017年）。ALI的病因复杂，酒精、药物和病毒都可能引发其发生。若不及时有效干预，严重的或长期的肝细胞损伤可能导致肝衰竭，最终导致死亡。目前，肝移植是治疗ALI的最佳方法（Terrault等人，2023年）。然而，肝源稀缺、术后免疫排斥和高成本等因素严重限制了其临床应用。因此，寻找新的治疗靶点和有效药物至关重要。

巨噬细胞作为抵御外来病原体的第一道防线，具有吞噬病原体、清除凋亡细胞、促进组织修复和维持内部环境稳态等功能，在ALI的发生和发展中起重要作用（Dixon等人，2013年）。研究表明，肠道微生物群释放的脂多糖（LPS）可通过Toll样受体4信号通路激活肝巨噬细胞，释放白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子。这些因子会加剧炎症反应，促进肝细胞凋亡和坏死，从而引发ALI（Chen等人，2024年）。动物实验表明，使用氯磷脂脂质体清除巨噬细胞（Dong等人，2020年）或抑制巨噬细胞炎症反应（Seo等人，2018年）可减轻肝炎症，从而缓解ALI，这表明巨噬细胞的炎症反应是ALI的重要原因之一。此外，当肝脏暴露于有害刺激时，驻留巨噬细胞（库普弗细胞）和浸润巨噬细胞会激活NADPH氧化酶2产生活性氧（ROS），刺激库普弗细胞分泌促炎细胞因子，进一步加重损伤（Banerjee等人，2023年）。研究表明，抑制氧化应激可缓解ALI（Zheng等人，2023年），植物来源的天然抗氧化剂具有潜在的预防和治疗效果（Abdel-Daim等人，2018年）。

糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，已被证明在调节细胞凋亡、炎症反应和氧化应激等核心病理生理过程以及经典糖原代谢中起关键作用（Jope等人，2007年）。值得注意的是，这些过程正是ALI的核心发病机制，提示GSK-3β可能在ALI中起关键作用。D-GalN/LPS诱导的ALI模型支持这一假设：研究表明，该模型引发的严重氧化应激和炎症反应会导致GSK-3β Ser9位点去磷酸化（即激活形式）水平显著增加，从而明确将上游应激信号与GSK-3β激活联系起来（Wei等人，2014年）。在炎症信号通路中，核因子-κB（NF-κB）是调节炎症介质表达的核心转录因子（Pan等人，2025年）。GSK-3β被发现是NF-κB通路的关键正向调节因子。其机制是激活的GSK-3β磷酸化NF-κB p65亚单位上的特定丝氨酸残基（如Ser468），不仅增强p65的转录活性，还促进其与目标基因启动子的结合及共激活因子的招募。因此，在Toll样受体和其他信号刺激下，GSK-3β的活性对于NF-κB完成其完全的炎症基因诱导功能是必要的。实验证据表明，特异性抑制GSK-3β可显著减弱NF-κB的转录活性，并有效减少TNF-α和IL-6等关键炎症因子的产生（Martin等人，2005年）。总之，从上游应激信号激活GSK-3β到其进一步放大NF-κB依赖的炎症反应，形成了一个明确的信号级联反应。鉴于该通路在ALI炎症放大机制中的核心地位，针对GSK-3β/NF-κB信号通路的干预为开发新的ALI治疗策略提供了潜在靶点。

在古代文明中，药物主要来源于植物、动物或矿物。治疗方法常结合宗教仪式和自然疗法。这些知识通过口口相传传播到不同地区，推动了医学进步。在中国，周朝之后，医学和药理学领域得到了发展，出现了许多医学和药理学著作，如《神农本草经》和《中药大典》（Bungau，2015年）。P. diversifolia指Pimpinella diversifolia DC的干燥全草，属于伞形科植物。它主要用于畲族和苗族的传统医学，并在《江西省中药炮制规范》中得到正式认可。它具有辛辣、略苦的味道和温性，归肺、脾、肝经络。具有散寒、消食积、健脾、止泻和消瘀消肿的功效，临床上主要用于治疗感冒、腹泻、痢疾、婴儿营养不良、皮肤瘙痒等疾病。新鲜草药还可捣碎外敷用于治疗脓肿、肿痛和蛇咬伤（Dong和Zhao，1991年）。现代药理学研究表明，P. diversifolia具有抗炎（Dong等人，2021年；Wang和Wang，2017年）、抗氧化（Zhao等人，2019年）和降血糖（Yang等人，2022年）作用。众所周知，精油具有抗菌、抗炎、抗氧化和镇痛作用（Aziz等人，2018年）。P. diversifolia的根、茎和叶富含精油，这可能是其抗炎和抗氧化作用的基础。先前的实验室研究表明，P. diversifolia根油（PDREO）对D-半乳糖胺（D-GalN）和LPS诱导的小鼠急性肝损伤具有显著保护作用（Hua等人，2023年）。其肝保护作用是否通过抑制炎症反应和氧化应激实现，以及PDREO中的抗炎和抗氧化活性成分，仍需进一步深入探究。

中药指纹技术是评估中药质量、鉴定中药及其成分和辨别其真伪的关键技术之一。谱效关系研究是将中药指纹技术与药理作用相结合的方法，用于选择与药理作用相关的化学成分（Han等人，2021年）。随着中药和现代分析技术的不断发展，中药指纹技术已广泛应用于中药材料的质量控制、药理物质基础研究、加工前后效果研究、提取、纯化和制备工艺优化以及有效成分筛选（Duan等人，2024年）。P. diversifolia是一种常用的畲族和苗族药用草药，传统上用于治疗肝脏相关疾病。然而，其肝保护活性成分尚未明确。基于我们初步发现的PDREO具有显著的抗炎和抗氧化活性，且鉴于GSK-3β/NF-κB轴是调节炎症和氧化应激的核心信号通路，本研究聚焦于这一通路以阐明其机制。因此，本文评估了PDREO的抗炎、抗氧化和抗ALI作用，并利用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症和氧化应激模型，通过中药指纹技术揭示PDREO的潜在抗氧化活性成分。通过网络药理学分析预测潜在靶点，然后通过分子对接进行验证。最后，在细胞和动物水平对选定的高活性单体进行了系统实验验证。我们的发现为P. diversifolia的传统应用提供了植物化学验证，并提出了新的ALI治疗候选分子。

试剂
LPS和C7-C40饱和脂肪烃购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。NAC、二氯甲烷和D-GalN购自上海马克林生化有限公司（中国上海）。苯甲磺酰氟（PMSF）、DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Thermo Fisher Science（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。 Petroleum ether购自杭州双林化学试剂有限公司（中国杭州），乙酸乙酯也购自同公司。

PDREO对D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤具有保护作用
D-GalN和LPS的共同给药是一种广泛用于诱导小鼠急性肝损伤的方法，其中D-GalN会增强啮齿动物对LPS诱导的肝毒性的敏感性（Decker和Keppler，1974年）。因此，我们建立了D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤模型来评估PDREO的肝保护作用（图1A）。通过苏木精和伊红（HE）染色显示，D-GalN/LPS诱导的模型导致肝组织结构紊乱……

讨论
Pimpinella属属于伞形科，是物种最丰富的属之一，约有150个物种分布于亚洲、欧洲和非洲，少数物种见于美洲。研究表明，Pimpinella植物主要含有萜类、苯丙素、黄酮类、香豆素和脂肪酸。现代药理学研究表明，Pimpinella植物具有多种生物活性……

结论
本研究系统地研究了Pimpinella diversifolia根油（PDREO）对抗急性肝损伤（ALI）的肝保护机制。我们证实PDREO通过同时抑制炎症反应和氧化应激显著缓解D-GalN/LPS诱导的肝损伤。通过GC-MS指纹图谱指导的谱效关系分析，我们鉴定了6种对这些效果有贡献的生物活性成分。在这些作者中，P59CRediT论文的署名贡献如下：

黄子欣（Zixin Huang）：验证、正式分析、数据整理。
秦润泽（Runze Qin）：验证、正式分析、数据整理。
刘宇（Yu Liu）：撰写——初稿、方法论部分。
蒋福生（Fusheng Jiang）：撰写——审稿与编辑、正式分析、数据整理。
李美娅（Meiya Li）：撰写——审稿与编辑、正式分析、数据整理、概念构思。
张春春（Chunchun Zhang）：调查研究、概念构思。
曹若宁（Ruoning Cao）：调查研究、资金筹集。
王家文（Jiawen Wang）：撰写——初稿、方法论部分。
彭素瑜（Suyu Peng）：撰写——未引用参考文献：Hamza等人，2026年；Ta等人，2006年。

**知情同意声明**：对于不涉及人类的研究，“不适用。”

**机构审查委员会声明**：该动物研究方案符合《实验动物护理和使用指南》，并获得了浙江中医药大学动物伦理委员会（IACUC-20230710-14）的批准。

**利益冲突**：作者声明没有利益冲突。

**资助**：本研究得到了浙江省自然科学基金（项目编号LY23H280007）和中医药科学院、浙江中医药大学科研基金（项目编号2024GJYY18, 2023JKJNTZ04）的财政支持。

**利益冲突声明**：作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系，这些关系可能影响本文所述的工作。