健脾清化颗粒通过靶向DNMT-尿素循环轴改善代谢紊乱相关脂肪肝疾病的机制

《Journal of Ethnopharmacology》：Mechanism of Jianpi Qinghua Granule in ameliorating Metabolic Dysfunction-Associated Fatty Liver Disease by Targeting the DNMT-Urea Cycle Axis

　　肖艳艳|吴华毅|鞠文雄|徐俊飞|陈琪|比力克孜·阿布杜赫利利|蔡梦杰|金圣一|尹秦毅|田静|卢浩|韩旭
上海中医药大学附属曙光医院内分泌科，上海，中国

**摘要**
**民族药理学相关性**
健脾清化颗粒（JPQH）是一种医院制剂的传统中药方剂，用于治疗胰岛素抵抗及相关代谢紊乱。然而，其在代谢功能障碍相关性脂肪肝病（MAFLD）中的药效学基础和表观遗传机制尚不清楚。

**研究目的**
本研究旨在评估JPQH对高脂饮食（HFD）诱导的MAFLD的治疗效果，并确定其作用是否涉及通过DNA甲基化调节和肝脏尿素循环代谢。

**材料与方法**
HFD诱导的MAFLD小鼠接受JPQH治疗4周。通过UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS/MS鉴定血液吸收的成分。通过网络药理学、肝脏转录组学和靶向代谢组学整合方法探索机制。使用焦磷酸测序、RT-qPCR、Western blotting、分子对接和分子动力学模拟进行验证。

**结果**
JPQH改善了葡萄糖-脂质代谢紊乱和肝脏损伤，表现为血清TC、TG、ALT和AST水平降低（P < 0.05），肝脏MDA水平下降（P < 0.01），OGTT/ITT反应改善（P < 0.001），GSH/GSSG比率恢复（P < 0.05），以及炎症和纤维化相关基因表达下调（P < 0.05）。共鉴定出44种血液吸收成分和87个JPQH-MAFLD共轭靶点。综合分析突出了氮代谢和精氨酸及脯氨酸代谢的作用。JPQH恢复了尿素循环中间产物，上调了CPS1、OTC、ASS1、ASL和ARG1的表达（P < 0.01），并减少了肝脏氨积累（P < 0.01）。机制上，JPQH降低了DNMT1/DNMT3A的表达，减弱了尿素循环酶基因的启动子超甲基化，并恢复了其转录和蛋白质表达。核心黄酮类化合物（包括-genistein、baicalein、nepetin、hispidulin和quercetin 3,4′-dimethylether）在计算机模拟中显示出与DNMT1和DNMT3A的稳定结合。

**结论**
JPQH通过表观遗传调控DNMT-尿素循环轴，恢复肝脏氮代谢和氨解毒，从而对MAFLD具有保护作用。

**引言**
2020年，国际共识小组提出使用“MAFLD”这一新术语，代替旧的“NAFLD”（非酒精性脂肪肝病）（Bence & Birnbaum, 2021; Rong et al., 2022）。随着城市化进程的加快和饮食西化，特别是肥胖和糖尿病的上升，MAFLD的发病率逐年增加（Chan et al., 2022）。Chan等人的研究显示，全球MAFLD发病率为38.77%，亚洲为36.31%（Song et al., 2024）。预计在未来几十年内，由于人口老化和生活方式的变化，中国MAFLD的负担将进一步增加（Estes et al., 2018）。
MAFLD是一种由慢性能量过剩驱动的代谢紊乱，其特征是从单纯脂肪变性到脂肪性肝炎和纤维化的肝脏损伤谱系。防止炎症和纤维化的进展是MAFLD的主要治疗目标（Androutsakos et al., 2022）。在涉及的代谢途径中，肝脏尿素循环尤为重要，因为它是氨解毒的主要途径。越来越多的证据表明，在MAFLD早期阶段，由于尿素生成受损和关键尿素循环酶表达减少，会出现肝性和系统性高氨血症（De Chiara et al., 2018; Eriksen et al., 2019; Jalan et al., 2016）。过量的氨可通过促进氧化应激、炎症信号传导和肝星形细胞活化进一步加重疾病进展（Eriksen et al., 2019; Jalan et al., 2016）。这些发现表明，尿素循环功能障碍不仅是MAFLD的代谢后果，也是肝脏损伤的活跃驱动因素。然而，导致MAFLD中尿素循环受损的上游机制尚未完全明了。新兴证据表明，表观遗传失调，特别是DNA甲基化，可能提供了代谢应激与氨解毒缺陷之间的机制联系。表观遗传学描述了基因表达变化的机制，而不改变实际遗传序列（Lee et al., 2014）。这些作用主要涉及核苷酸甲基化、组蛋白修饰和染色体重塑（Hyun & Jung, 2020）。过量脂质摄入和代谢负荷已被证明会在MAFLD中引起表观遗传变化（H. C. Chen et al., 2020; Zaiou et al., 2021）。值得注意的是，MAFLD中尿素循环功能障碍与编码尿素循环酶的基因异常DNA甲基化有关（De Chiara et al., 2018）。因此，调节DNA甲基化可能是一种重要的上游调控机制，可以恢复尿素循环活性，增强氨清除，最终减轻MAFLD中的炎症和纤维化。

MAFLD是一种与胰岛素抵抗、氧化应激和肝外代谢紊乱相关的多因素代谢疾病，使用传统的单一靶点策略难以治疗。中医以其多组分和多靶点作用而著称（Maiese, 2025），因此可能提供一种治疗途径。健脾清化颗粒（JPQH）源自《脾胃论》中描述的经典中药方剂“补脾益胃、泻阴火、升阳汤”，包含八味药材：蒙苦参（Astragalus mongholicus Bunge）、党参（Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.）、黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）、黄连（Coptis chinensis Franch.）、玉竹（Dioscorea opposita Thunb.）、红参（Polygonatum sibiricum Redouté）、葛根（Pueraria lobata (Willd.) Ohwi）和欧洲荚蒾（Euonymus alatus (Thunb.) Siebold）。临床研究表明，JPQH已用于治疗代谢紊乱超过二十年，包括2型糖尿病和胰岛素抵抗（Liu et al., 2022）。先前的研究表明，JPQH可改善糖脂代谢，减轻炎症，并在实验模型中减轻脂肪肝损伤（Gong et al., 2020; Liu et al., 2022; Tian et al., 2023; Wang et al., 2024）。然而，其活性成分、核心靶点和在MAFLD中的分子机制仍不甚明确。

**研究策略**
本研究采用多维“药物-成分-靶点-疾病”分析（Zhang et al., 2023）结合转录组学和代谢组学分析作为整体研究策略。我们的科学目标是鉴定健脾清化颗粒（JPQH）的主要血液吸收活性成分，并明确JPQH是否通过调节DNA甲基化和恢复肝脏尿素循环代谢来缓解MAFLD。该工作旨在定义JPQH在MAFLD中的药效学基础和分子机制，并为其临床应用提供机制支持。

**材料**
健脾清化颗粒（上海雷云翔药业有限公司，230201，中国）、BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime, P0010S）、OTC抗体（Proteintech, 67553-1-Ig）、CPS1抗体（Proteintech, 67630-1-Ig）、DNMT1抗体（Abcam, ab188453）、DNMT3A抗体（Abcam, ab188470）、HRP标记的山羊抗兔IgG（Boster, BA1054）、HRP标记的山羊抗鼠IgG（Boster, BA1050）、HiScript? II Q RT SuperMix（Vazyme, R233）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme, Q711）、GSH/GSSG检测试剂。

**MAFLD小鼠模型的建立**
构建了MAFLD小鼠模型（图1a）。12周后，HFD小鼠的体重显著高于NCD饮食组（图1b）。OGTT显示HFD小鼠的AUC（0-120分钟）显著增加（图1c），表明葡萄糖耐受性受损，MAFLD模型建立成功。

**JPQH改善MAFLD小鼠的系统代谢紊乱**
模型组小鼠的体重、肝脂肪沉积、肝脏重量和肝脏指数显著高于对照组，而JPQH治疗剂量依赖性地改善了这些指标。

**讨论**
本研究探讨了健脾清化颗粒（JPQH）改善MAFLD的机制。结果表明，JPQH剂量依赖性地减轻肥胖和葡萄糖-脂质代谢紊乱，减少氧化应激，缓解MAFLD小鼠的肝脂肪变性和炎症，并揭示了一种涉及表观遗传调控DNMT-尿素循环轴的新肝保护机制。鉴定血液吸收成分对于阐明中医药的药效学基础至关重要。

**结论**
本研究表明，JPQH通过恢复尿素循环功能和减少肝脏氨积累来缓解HFD诱导的MAFLD。机制上，HFD增加了DNMT1和DNMT3A的表达，导致关键尿素循环酶（如CPS1和OTC）的启动子超甲基化，从而降低酶表达和氨解毒能力。JPQH通过抑制DNMT1/DNMT3A的表达，减少启动子超甲基化，恢复尿素循环酶的表达，逆转了这些变化。

**作者贡献声明**
田静：监督、数据管理
尹秦毅：研究
卢浩：监督、方法学、概念构思
徐俊飞：方法学、研究
鞠文雄：可视化
吴华毅：正式分析、数据管理
韩旭：写作-审查与编辑、监督、方法学、概念构思
肖艳艳：写作-审查与编辑、初稿编写、正式分析
金圣一：研究
蔡梦杰：研究
比力克孜·阿布杜赫利利：可视化
陈琪：