菜籽白蛋白酶促交联的机理与动力学建模：温度、pH值和酶浓度的影响

《Journal of Food Engineering》：Mechanistic and kinetic modeling of enzymatic crosslinking of rapeseed albumins: influence of temperature, pH, and enzyme concentration

　　

Romain Faure|Sophie Beaubier|Ghislain Génin|Romain Kapel

法国洛林大学，CNRS，LRGP，F-54000 南锡

摘要：

由于酶的成本高昂以及反应机制的复杂性，植物蛋白质的酶促转化需要精确的动力学控制。本研究提出了一种创新方法，用于拟合实验性的酶促交联数据，从而实现植物蛋白质交联反应的建模和模拟。研究发现，油菜籽白蛋白（RA）通过转谷氨酰胺酶介导的交联过程表现出独特的交联产物形成趋势，这一趋势与操作条件（包括pH值、温度和酶浓度）无关。基于这些趋势，作者确定并形式化了一种独特的交联机制，通过一套交联方程描述了各个交联产物的形成和消耗过程。在特定操作条件下，RA的消耗动力学表现为平台期。这一平台期的成因被归因于酶的失活和底物可及性的限制。这些机制见解被纳入一个由微分方程组表示的动力学模型中，并通过拟合算法实现，以描述在不同pH值和温度条件下的实验交联动力学。通过对酶与底物比例的回归分析，发现了强烈的相关性。该模型准确地捕捉了RA单体、二聚体、三聚体及多分散产物的变化过程，从而能够定量预测不同工艺条件下的交联蛋白质产物分布。这种方法为拟合实验交联数据提供了一个稳健的框架，并为植物蛋白质系统中酶促交联过程的模拟和优化建立了预测工具。

引言

与动物蛋白相比，植物蛋白因其较低的环境影响和植物来源而受到越来越多的关注（Tang等人，2024年；Willett等人，2019年）。它们在食品中的功能主要体现在表面性质上，例如乳化能力和发泡能力（用于饮料、酱料、打发配料和烘焙产品），以及结构性质，尤其是凝胶化能力（控制肉类替代品和重组食品的质地和保水性能）（Damodaran，2005年；Foegeding & Davis，2011年）。然而，植物蛋白的表面性质和结构性能通常不如动物蛋白，这限制了它们的工业应用，因此改进和精确控制这些功能成为关键挑战（Day，2013年；Loveday，2019年）。因此，以可预测和可控的方式调整植物蛋白的功能对于加速其在食品配方中的应用至关重要。

为了改善植物蛋白的功能，已经探索了几种策略，其中酶促处理特别有吸引力，因为它们具有特异性和温和的操作条件（Karabulut等人，2024年）。酶促水解是最常用的改性方法，主要用于增强表面性质。例如，研究表明，控制性水解可以显著提高大豆蛋白、蚕豆蛋白和油菜籽蛋白的乳化能力和发泡能力（Beaubier等人，2023年；Eckert等人，2019年；Li等人，2025年）。已经开发了一系列建模方法来描述水解动力学，从而优化这一过程（Beaubier等人，2021年；Butré等人，2014年；Demirhan等人，2011年）。这些动力学框架在提高对酶促水解机制的理解和控制方面发挥了重要作用，突出了通过酶促转化来调整植物蛋白功能的重要性。

相比之下，由转谷氨酰胺酶介导的酶促交联会引起根本不同的结构和功能改变。微生物转谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺侧链和赖氨酸侧链之间共价异肽键的形成。异肽键形成的机制已经得到充分研究（Buchert等人，2010年；Folk & Cole，1966年；Yokoyama等人，2004年），主要包括两个步骤：首先是谷氨酰胺侧链上的酰基转移到酶的活性位点，释放出氨；其次是酶结合的中间体与赖氨酸侧链之间形成共价键。然而，控制交联产物形成的机制仍不甚明了，导致对扩展蛋白质网络形成的了解有限（Miwa，2020年）。对于油菜籽白蛋白，研究表明转谷氨酰胺酶介导的交联赋予了其出色的凝胶化特性，这与水解所促进的表面性质形成鲜明对比。此外，通过调整酶促过程参数，可以精细调节这些凝胶化特性，为蛋白质结构和质地设计提供了新的机会。尽管转谷氨酰胺酶作为增稠剂在工业上得到广泛应用，特别是在重组肉类和鱼类产品以及豆腐渣基制品中（De Góes-Favoni & Bueno，2014年），但从机制和动力学的角度来看，对其的研究远少于酶促水解。当前的监测方法主要局限于总体交联程度等指标，无法深入了解交联产物的性质和分布，从而阻碍了机制理解和动力学建模（Djoullah等人，2015年；Wang等人，2024年）。

在植物蛋白来源中，油菜籽蛋白是一种有潜力但尚未充分开发的资源，尤其是在从蛋白质成分生产中副产品的增值利用方面。油菜籽中的第二大储存蛋白——油菜籽白蛋白因其宽pH范围内的高溶解性、高热稳定性和紧凑的分子大小而特别受到关注（Albe-Slabi等人，2022年；Perera等人，2016年；Wanasundara等人，2024年）。这些特性使它们成为在广泛操作条件下研究酶促交联的理想底物。最近的一种尺寸排阻HPLC（SE-HPLC）方法能够精确监测油菜籽白蛋白的转谷氨酰胺酶介导的交联过程，并定量分析交联产物（Faure等人，2026年）。这一分析进展使得我们可以超越总体交联指标，定量描述整个反应过程中蛋白质种群的变化。

本研究从动力学角度探讨了转谷氨酰胺酶对油菜籽白蛋白的酶促交联作用。首先研究了操作条件对交联动力学的影响，然后基于定量数据制定了机制和动力学假设，并利用这些假设开发了一种能够描述广泛pH值和温度条件下实验交联动力学的拟合方法。最后，通过评估酶浓度对交联反应动力学的常数的影响，将该方法扩展到了不同的酶与底物比例下。

章节摘录

材料和化学品

油菜籽白蛋白（RA）分离物由Avril集团（法国）提供。该分离物是从工业级油菜籽粕中通过选择性提取白蛋白并在酸性条件下进一步纯化获得的。根据凯氏定氮法（N × 6.25，基于干物质）测定，所得RA分离物的纯度为99.6%。RA分离物在pH值3至9的宽范围内具有>98%的溶解度（Albe-Slabi等人，2022年）。微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）用于...

pH值和温度对交联动力学的影响

图1展示了在pH值5至8和温度40°C至60°C范围内油菜籽白蛋白（RA）的交联过程，显示了单体白蛋白的逐渐消耗以及二聚体、三聚体和较高分子量聚合物的同时形成。这一动力学曲线揭示了pH值和温度不仅影响整体反应速率，还影响这些相互连接结构的形成和增长。

根据...

结论

本研究建立了在不同pH值、温度和酶与底物比例下转谷氨酰胺酶介导的油菜籽白蛋白交联的机制和预测性动力学框架。所提出的拟合方法基于：（i）对操作条件对交联动力学的系统研究，（ii）确定控制产物种群动态的独特交联机制，以及（iii）分析限制酶促反应速率的因素。

为了...

CRediT作者贡献声明

Sophie Beaubier：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、可视化、验证、监督、资源提供、项目管理、方法论、研究、资金获取、正式分析、概念形成。Ghislain Génin：撰写——审阅与编辑、可视化、软件开发、方法论、正式分析、数据管理。Romain Kapel：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、监督、资源提供、项目管理、方法论、研究、资金获取

没有利益冲突。

在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT / OpenAI来辅助写作。使用该工具/服务后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

资金支持

本项工作得到了法国国家研究机构（ANR）的支持，作为JCJC项目“ANR-23-CE51-0003-01”的一部分。

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的报告内容。