基于PCR的H5N1流感检测方法在牛奶中的效果评估：一项实验室间比较研究表明方法依赖性的敏感性差异

《Journal of Food Protection》：Evaluation of PCR-Based H5N1 Influenza Detection Methods in Milk from an Inter-laboratory Comparison Study Demonstrating Method-Dependent Sensitivity Variability

　　梅根·R·米勒 | 柯尔斯廷·弗罗斯特 | 艾米丽·L·史密斯 | 余汉金 | 乔迪·乌拉塞克 | 马修·克梅特 | 卡丽娜·赫特沃 | 安雅·施利尔夫 | 莎拉·M·内姆瑟 | 安德里·特卡琴科 | 劳拉·B·古德曼 | 奥尔吉卡·塞里克 | 凯莉·阿尔梅斯 | 克里斯蒂娜·洛亚科诺 | 拉文德·雷迪 | 斯蒂芬·乌利格 | 格雷戈里·H·泰森
美国食品药品监督管理局兽医医学中心，8401 Muirkirk Road, Laurel, MD 20708

**摘要**
自2024年3月以来，H5N1高致病性禽流感（HPAI）在美国的奶牛中被检测到。这种具有传染性的病毒存在于未经过巴氏杀菌的牛奶中，而此前尚未对该基质进行过H5N1的检测。因此，实时反转录定量聚合酶链反应（rRT-qPCR）检测方法对于通过筛查和早期检测牛奶样本来进行动物诊断和食品安全至关重要。这项实验室间的比较研究评估了来自政府、学术界和商业机构的45个实验室使用基于PCR的H5N1检测方法的性能，这些样本中添加了浓度在85至170,000个基因组拷贝/100 μL之间的灭活H5N1病毒培养物。各实验室使用其常规协议对样本进行了检测。检测率（ROD）、Ct值以及50%样本呈阳性结果的检测限（LOD50）通过按提取方法和PCR试剂盒组合分组进行了分析，以比较灵敏度。对于高浓度样本（17,000和170,000拷贝/100 μL），检测率≥99%；然而，在较低浓度下，检测率显著下降，在1,700拷贝/100 μL时仅有34%的实验室能够可靠地检测到病毒，在85拷贝/100 μL时仅有24%的实验室能够检测到病毒。参与者使用了八种不同的方法，其中一些方法能够持续检测到低水平的病毒，而其他方法在低拷贝水平下检测率为零。这项研究表明不同实验室在H5N1检测能力上存在显著差异，方法选择对灵敏度有影响。这一发现对人类和动物健康监测及应急响应具有重要意义，凸显了需要评估牛奶中H5N1检测的方案和质量控制措施。

**引言**
自2022年以来，H5N1 2.3.4.4b亚型在野生鸟类和美国家禽中广泛传播，偶尔也会在哺乳动物中发生溢出事件（Puryear等人，2023年；USDA）。人类感染也时有发生，通常是由于直接接触受感染的家禽（Beigel等人，2005年）。2024年3月，美国农业部（USDA）报告了首次在奶牛群中确认发现H5N1（Burrough等人，2024年），并且受感染奶牛的未经过巴氏杀菌的牛奶中也检测到了具有传染性的病毒。到2024年5月，已报告两例与接触受感染奶牛相关的人类病例，但没有发现人际传播的证据（Garg等人，2024年）。截至2025年1月，共有16个州的900多个奶牛群受到影响，记录了70例人类病例（Rolfes等人，2025年）。这些发现，特别是原始牛奶中存在传染性病毒以及传播途径的不确定性，引发了人们对牛奶安全和巴氏杀菌效果的担忧。作为回应，USDA启动了自愿性的“奶牛群状况计划”，包括每周对原始牛奶进行检测，并推出了“全国牛奶检测策略”，从生产商那里收集未经过巴氏杀菌的牛奶样本和流行病学数据（USDA，2024年5月）。同时进行的实验研究表明，巴氏杀菌在灭活病毒方面非常有效（Spackman等人，2024年）。基于实时反转录定量聚合酶链反应（rRT-qPCR）的分子诊断方法对于监测、早期发现病毒传播以及筛查巴氏杀菌前牛奶和环境样本仍然至关重要。

基于PCR的分子检测方法因能够检测到低水平的基因组物质而具有很高的灵敏度。尽管基于PCR的方法无法确定基因组物质是否具有传染性，但这些方法可以提供有关病毒基因组特性的关键信息。对于H5N1的检测，基于PCR的检测方法可以在几小时内完成，并且已经在家禽样本中得到了广泛应用（Spackman等人，2003年）。然而，这些方法尚未在牛奶中广泛用于H5N1的检测。牛奶是一种具有挑战性的基质，因为它含有高脂肪成分和可能干扰基于PCR检测的酶（Schrader等人，2012年）。USDA国家兽医服务实验室（NVSL）向国家动物健康实验室网络（NAHLN）提供了用于动物诊断的牛奶样本H5N1检测的官方监管方案，包括样本处理程序以及商业提取和PCR试剂盒的建议。其他政府和行业组织也开发了自己的方案。鉴于需要准确检测牛奶产品中的H5N1以及存在多种方案的事实，评估和比较不同方法的灵敏度变得至关重要。为此，食品药品监督管理局（FDA）兽医医学中心的兽医实验室调查与响应网络（Vet-LIRN）、FDA/伊利诺伊理工大学食品安全与健康联合莫菲特能力测试实验室（MPTL）以及NAHLN共同开展了一项实验室间比较研究。Vet-LIRN和MPTL已经成功领导了许多能力测试，包括针对紧急响应和病毒病原体的实验室间比较研究（Deng等人，2023年；Deng等人，2022年；Nemser等人，2025年）。

**研究目的**
本研究的总体目标是使用盲法测试样本来评估多个实验室基于PCR的H5N1检测方法的性能，目的是探讨参与者提供可重复结果的能力，以确定牛奶中是否存在HPAI病毒。牛奶中的病毒浓度因牛奶类型而异，包括来自有症状奶牛的原始牛奶、来自无症状奶牛的原始牛奶、运输过程中的大型储罐牛奶以及零售巴氏杀菌牛奶。病毒浓度范围从个别奶牛的10^7拷贝/mL（Burrough等人，2024年；Stachler等人，2025年）到零售巴氏杀菌牛奶的1,000拷贝/mL（Spackman等人，2024年；Spackman等人，2024年）。此次实验室间比较研究使用了多种浓度范围，以反映实际样品情况，并提供了低浓度挑战样本，以帮助确定每个参与者的LOD50。研究结果包括：（i）比较各参与者的结果；（ii）比较关键的方法学方法以识别趋势；（iii）提供可操作的反馈，以帮助实验室在研究后提高性能（这是实验室间比较研究的主要预期目标）。这项研究代表了政府、学术界和商业实验室45个参与者的共同努力。

**方法与材料**
**病毒**
H5N1 HPAI株rg-A/bald eagle/FL/W22-134-OP/2022在使用二乙烯亚胺（BEI）灭活后运输至MPTL。具体步骤为：准备100 mM BEI，并将其与病毒一起预热至36 ± 2 °C；处理病毒至最终BEI浓度为5 mM，在室温下连续混合25分钟，然后在36 ± 2 °C下垂直振荡器中孵育至少48小时。灭活后，用1 M硫代硫酸钠将BEI中和至最终浓度20 mM，并在室温下混合60分钟。通过病毒分离试验确认灭活效果，包括至少在易感宿主系统（如受精鸡胚）中传代两次。BEI可以灭活流感病毒，但不会完全降解病毒RNA，因此即使在处理后仍可检测到病毒。研究表明，灭活后的流感病毒RNA仍可通过RT-PCR检测到（Adi等人，2019年；Sarkar等人，2017年）。应用BioSystems QuantStudio Absolute Q dPCR系统（Thermo Fisher Scientific）测定RNA浓度为平均435,067个基因组拷贝/μL。

**实验室间比较样本制备**
MPTL从当地杂货店购买了零售全脂牛奶，通过rRT-qPCR确认其中不含H5N1，并准备了55组测试样本。每组包含16个样本（每个 tubes 100 μL），其中包含空白牛奶样本或添加了不同浓度灭活H5N1病毒的牛奶样本（表1）。MPTL使用内部质量控制程序验证了接种样本的稳定性和均匀性。

**表1. 样本组成**
| 样本ID | 描述 |
| --- | --- |
| 1VM-09 | 空白 - 100 μL牛奶 |
| 2VM-14 | 空白 - 100 μL牛奶 |
| 3VM-01 | 约85拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 4VM-11 | 约85拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 5VM-04 | 约170拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 6VM-06 | 约170拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 7VM-15 | 约170拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 8VM-02 | 约1,700拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 9VM-08 | 约1,700拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 10VM-10 | 约1,700拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 11 | |
| 12VM-13 | 约1,700拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 13VM-03 | 约17,000拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 14VM-07 | 约17,000拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 15VM-05 | 约17,000拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| 16VM-12 | 约17,000拷贝灭活H5N1 / 100 μL牛奶 |
| | |

**样本验证**
根据NVSL-SOP-0068.05和NVSL-WI-1843（NAHLN，2023年，2024年）中的方法对接种样本进行处理。样本在PrimeStore分子运输介质（MTM）中稀释1:3，使用MagMAX CORE核酸纯化试剂盒在Kingfisher Flex仪器（Kingfisher Flex，Life Technologies Holdings Pte Ltd，新加坡）上提取核酸。纯化的RNA被逆转录为cDNA，并用针对IAV基质基因（IAV M）的引物和探针进行扩增（Integrated DNA Technologies，IDT），使用AgPath-ID One-Step RT-PCR试剂盒（Thermo Fisher）。rRT-qPCR在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR仪器上运行，使用版本2.3软件。IAV M引物和探针序列来自NVSL-SOP-0068.05，属于机密信息。

**样本分发与结果提交**
根据制造商提供的说明，样本用Saf-T-Pak STP-320 UN 3373 B类冷冻绝缘运输系统包装在干冰上，并通过FedEx Priority Overnight寄送到每个参与实验室。参与者收到样本后被要求立即开始检测。他们按照实验室的常规H5N1检测程序进行操作，仅在程序要求时使用内部对照。样本分析后，参与者将其结果报告为“检测到”（D）、“未检测到”（ND）或“不确定”（IN）。参与者需要提交Ct值、方法信息及任何修改内容。

**数据分析方法**
数据评估使用QuoData认证的方法进行了基于实时PCR数据的样本特征化，该方法基于ISO标准（ISO，2021年，2022年，2025年）定义的标准化统计方法，广泛应用于方法验证、能力测试和参考材料表征。此外，该方法还包括QuoData提供的高级方法学发展。检测概率（PODs）用于计算LOD50值，采用ISO 16140推荐的互补对数-对数（cloglog）回归模型进行建模，并在ISO 11781中以扩展形式应用，实现了μKPI软件（ISO，2021年，ISO，2022年，ISO，2025年；QuoData）。Uhlig等人（Uhlig等人，2015年）描述了该方法的理论细节。使用QuoData专门为实时PCR数据评估改编的LASSO方法识别方法相关差异。每位参与者被分配了一个唯一编号（PIN）。PIN 10-11的结果在LOD50值和调整后的Ct值方面与其他使用相同方法 laboratories相比异常高，这些结果被排除在LASSO分析之外并视为异常值。PIN 170-3的结果因该实验室无法检测到IAV M而未被纳入分析。

**结果**
共有45个实验室注册参加了这项实验室间比较研究，包括Vet-LIRN、NAHLN、实验室网络联盟、私人实验室和政府实验室。收到了来自45个实验室的42个数据集，其中两名参与者因方法问题被排除在分析之外。实验室报告了IAV M标志物的“总体检测”情况（表2）以及Ct值（补充表1）。根据其既定的工作流程，一些实验室还检测了H5、H5 Clade 2.3.4.4和H7亚型（补充表2-4）。

**表2. 参与者提交的“总体检测”结果**
D – 检测到；N – 未检测到；I – 不确定

**注：**
低拷贝数的样本旨在挑战IAV M rRT-PCR检测的极限，可能会导致Ct值超过实验室的典型临界值，从而使一些样本被报告为ND或IN，即使它们确实含有病毒。没有任何参与者报告假阳性结果。对于含有170,000拷贝/100 μL和17,000拷贝/100 μL的样本，检测率（ROD）均≥99%。随着基因组拷贝数的降低，检测率下降，在1,700拷贝/100 μL时仅有87%的实验室能够检测到病毒，在170拷贝/100 μL时仅有34%的实验室能够检测到病毒。在最低的拷贝水平85份/100微升时，只有24%的参与者能够检测到阳性样本（表3）。有效体积是根据每位参与者方法中的输入体积差异计算得出的，这些差异可能会影响检测效果，尤其是在低拷贝水平时（补充表5和表6）。表3显示了所有样本的总体检测情况。检测结果包括不同组成样本的数量、实验室间的阳性检出率（ROD）以及是否报告了IAV M或H5目标的Ct值。空白样本的检出率为0%。随着拷贝数的增加，检出率也相应提高。

表4列出了各种方法的表现参数。PIN 10-11和PIN 170-3的结果未用于回归分析。每个参数都用不同颜色编码（从红色到绿色渐变），表现最差的方法组以最深的红色表示，表现最好的方法组以最深的绿色表示。重复性的评估也是如此，标准差越大表示重复性越差用红色表示，重复性越好用绿色表示。参与者的具体方法细节在补充表6中有总结。参与实验室使用了六种不同的提取试剂盒和六种不同的PCR试剂盒，包括自动化平台和手动方法。29名参与者使用了AgPath-ID一步RT-PCR试剂盒与不同版本的MagMAX提取试剂盒或IndiMag病原体核酸提取试剂盒组合；5名参与者使用了QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini试剂盒与QIAGEN一步RT-PCR试剂盒组合，8名使用了VetMax Gold试剂盒。其余参与者使用了其他试剂盒组合或内部制备方法。除三名外，所有参与者都使用了某种形式的内部对照，其中37名使用了Xeno内部阳性对照。

基于（1）实验室特定的LOD50值（每有效体积的拷贝数，其自然对数经过处理以确保正态分布）和（2）含有170,000份/100微升样本的调整后Ct值（补充表8），进行了LASSO分析，以研究不同的方法组合、提取试剂盒和PCR试剂盒是否可以根据其对IAV M目标的敏感性进行区分或分组。最终确定了八组不同组合的方法，并用颜色编码为A-H（表4）。其中五组方法有四个或更多参与者使用，三组方法仅由一名参与者使用。由于样本量较小，后三组的参数比较不可靠。根据识别出的方法，通过LOD50和调整后Ct值以及Ct值的重复性和扩增效率进行了回归分析（表4）。

总体而言，A组方法在敏感性、重复性和扩增效率方面始终优于其他方法组。相反，D组和E组在多个参数上的表现较差。有三名参与者使用了其他方法（F、G和H），这些方法无法得出有意义的比较结论。对于A、B和C方法，1,700份/100微升样本的Ct值范围为32.72-33.31（图1A和表4），LOD50为2.07-3.24份/有效体积（图1B和表4）。重要的是，这些方法在性能上没有显著差异（补充表9）。

讨论：
rRT-qPCR检测在动物和公共卫生监测中广泛使用，有助于筛查和早期发现现有和新兴病原体，包括在临床、食品、动物或环境样本中。这项实验室间比较探讨了参与者使用各种基于PCR的方法识别牛奶中是否存在HPAI病毒的能力。向参与者发送了拷贝水平分别为170,000、17,000、1,700、170和85份/100微升的盲样，其中170和85份/100微升的样本用于确定每位参与者的LOD50。这项研究提供了丰富的数据集，可以进一步分析方法性能和敏感性。参与者报告的结果包括IAV M标志物的总体检测情况（表1）以及IAV M的Ct值（补充表1）和其他标志物（补充表2-4）。一些参与者仅使用了IAV M标志物，而其他人进行了进一步测试以识别H5。此外，报告了多种Ct阈值，这使得理解他们的总体检测结果变得困难。例如，不同实验室报告的阳性检出率（ROD）存在差异，这取决于是否考虑任何Ct值作为检测结果。计算出的检出率显示，在高拷贝水平样本中，检出率超过98%，且没有假阳性（表2）。然而，随着拷贝数的降低，检出率也下降。需要注意的是，每位参与者都遵循自己的常规测试方案，可能包括预处理步骤、稀释步骤和/或不同的提取和RT-PCR反应体积。这些因素都会影响有效体积，有效体积范围从1.4到8.89微升（补充表6）。在85或170份/100微升的拷贝水平下，样本可能低于检测限（LOD），这取决于有效体积。在低浓度样本中，可能存在少量或没有模板链，导致无法检测到病毒，从而产生变异结果（Bernardo等人，2013；Ellison等人，2006）。为了提高检测性能，参与者可以在解释Ct值时重新评估他们的决策标准并评估有效体积。

在H5N1疫情高峰期，据报道，部分奶牛的原始牛奶中的病毒滴度可达10^8.8 TCID50/mL，其他研究也报告了类似的浓度（Kaiser等人，2025；Stachler等人，2025）。这项研究结果表明，大多数参与者能够可靠地检测到中等至高浓度牛奶中的H5N1 RNA，并且能够识别出在高病毒负荷情况下可能出现的关键阳性结果。然而，通常会将来自单个动物的牛奶与600-800头奶牛的牛奶混合在一起，导致病毒浓度大幅稀释（Spackman等人，2024）。与此预期一致的是，RT-PCR阳性的巴氏杀菌零售牛奶产品中的平均病毒基因组载量为约1,000份/100微升（Spackman等人，2024）。鉴于一些实际样本中观察到的较低浓度，实验室在低病毒载量下实现敏感检测至关重要。在这项研究中，只有9名参与者在170份/100微升浓度下一致检测到H5N1（1,700份/mL）。值得注意的是，大约50%的实验室至少能检测到其中一种复制品的阳性结果。这些低浓度样本被特意作为挑战样本，以便参与者评估他们的检测水平并找出潜在的方法改进点。

由于这项实验室间比较参与的参与者人数众多，因此比较了方法之间的灵敏度差异。评估主要基于ISO 16140中描述的方法学，包括对数-对数模型，但额外的统计分析超出了标准要求，提供了更全面的分析，以进一步增强评估的可靠性和深度。根据使用的提取和PCR试剂盒，将八种方法分组。其中三种方法仅由一名参与者使用，未纳入直接比较。还应注意的是，使用每种方法的参与者人数从4到17不等。使用较少参与者的方法可能在结论的置信度上较低，在评估这些方法时应予以考虑。尽管扩增效率在各方法之间相似，但表明引物选择对性能影响较小。使用A、B或C方法时的性能没有显著差异，并且这些方法比D和E方法更敏感。只有两种提取试剂盒经过了牛奶基质的验证：MagMAX CORE（方法A）和IndiMag Pathogen（方法B）。值得注意的是，即使使用相同试剂盒组合的参与者，其检测结果也有所不同，表明过程中其他因素也可能影响灵敏度。一名参与者使用了F方法，该实验室的结果相对较差，这不一定仅归因于提取试剂盒本身，也可能受到实验室特定因素的影响。该方法的最佳检测限（LOD）为34.66，而使用非常相似试剂盒组合的参与者的LOD为2.08-3.24（表4）。其中一个潜在原因是MagMAX 96病毒RNA分离试剂盒未针对牛奶样本进行验证；然而，在评估工作流程时，应考虑多种可能影响方法性能的因素。例如，RNA提取试剂盒的选择会显著影响RNA的产量和纯度，即使是比较针对相同样本类型的商业试剂盒也是如此（Rump等人，2010）。同样，RNA的完整性在提取前受到样本处理和操作的影响，这可能会显著影响下游rRT-qPCR的敏感性（Browne等人，2020）。工作流程的可变性和分析前的处理，包括样本采集、储存和技术人员经验等因素，可能导致假阴性或降低检测性能，突显了在整个分析过程中采取严格质量控制措施的重要性。

实验室间比较练习是方法评估的重要组成部分。这些研究允许参与者将其方法性能与其他实验室进行比较，并找出改进机会。除了性能评估外，实验室间比较还能促进持续学习，鼓励实验室反思其分析实践、采用新程序并采取纠正措施。通过反复参与和分享见解，实验室可以增强技术能力，提高数据可靠性，并促进方法标准的整体进步。这项研究使参与者能够将其H5N1检测方法与其他方法进行比较，并可能采用不同的方法。LOD的差异可能是由试剂盒特定问题以及更广泛的分析前和方法学变量引起的，参与者应仔细评估其方法的所有方面。拥有准确可靠的基于PCR的检测方法对于辅助动物和公共卫生应急响应至关重要。结论：本研究评估了政府实验室、学术机构和商业实验室检测牛奶中H5N1高致病性禽流感病毒的能力。虽然在高病毒载量下的检测结果一致，但在低病毒浓度下的检测性能显著下降，这表明检测灵敏度存在较大差异。研究结果表明，提取试剂盒的选择、PCR方法和样品处理过程都是影响检测结果的潜在因素。通过提供能力基准，本研究使参与实验室能够对其检测性能进行批判性评估，并确定可以改进检测结果的方法。最终，敏感且可靠的检测方法对于有效的公共卫生应急响应至关重要。

免责声明：本文所表达的观点仅代表作者个人观点，并不一定反映美国卫生与公共服务部、美国食品药品监督管理局或美国政府的官方政策。文中提及的任何商业材料、设备或流程并不构成美国食品药品监督管理局的批准、认可或推荐。

人工智能辅助技术的声明：在准备本研究的过程中，作者使用了ELSA这一由FDA开发的人工智能工具来提高论文的可读性。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对出版物的内容承担全部责任。

未引用的参考文献：
Real-time, 2023; Guidance, 2024; QuoData, 2025; Spackman等人, 2024; Spackman等人, 2024; USDA, xxxx; USDA, 2024b.

作者贡献声明：
Megan R. Miller：撰写——初稿撰写、项目管理、方法论设计、数据整理、概念构思。
Kirstin Frost：撰写——审阅与编辑、可视化处理、软件应用、资源协调、数据分析。
Emily L. Smith：撰写——审阅与编辑、资源协调、数据分析。
Yuhan Jin：资源协调、数据分析。
Jodie Ulaszek：资源协调、项目管理。
Matthew Kmet：资源协调、项目管理。
Karina Hettwer：软件应用、数据分析。
Anja Schlierf：软件应用、数据分析。
Sarah M. Nemser：撰写——审阅与编辑、监督指导、项目管理、方法论设计。
Andriy Tkachenko：撰写——审阅与编辑、数据分析。
Laura B. Goodman：撰写——审阅与编辑、方法论设计、数据分析。
Olgica Ceric：撰写——审阅与编辑、项目管理、数据分析。
Kelli Almes：撰写——审阅与编辑、资源协调、项目管理。
Christina Loiacono：撰写——审阅与编辑、资源协调、项目管理。
Ravinder Reddy：监督指导、资源协调、项目管理。
Steffen Uhlig：撰写——审阅与编辑、监督指导、软件应用、资源协调、数据分析。
Gregory H. Tyson：撰写——审阅与编辑、监督指导、资源协调、项目管理。