揭示鲁迪塔佩斯菲利皮纳鲁姆（Ruditapes philippinarum）在暴露于丁基羟基甲苯（BHT）后，氧化应激介导的多途径程序性细胞死亡的机制

《Journal of Hazardous Materials》：Unveiling the mechanisms of oxidative stress-mediated multi-pathway programmed cell death in Ruditapes philippinarum exposed to butylated hydroxytoluene (BHT)

　　

齐瑞成|王巧巧|李鹏飞|蔡荣军|苗静静|李泽源|潘luqing

教育部海洋大学海洋养殖重点实验室，中国青岛市，邮编266003

摘要

作为典型的新兴污染物，合成酚类抗氧化剂（SPAs）在各种环境介质和生物体中被广泛检测到，引发了重大的生态和健康问题。然而，SPAs对海洋生物的毒理学效应及其背后的分子机制仍知之甚少。通过整合转录组学、计算机模拟和实验验证，本研究阐明了在BHT胁迫下Ruditapes philippinarum中的“氧化应激–大分子损伤–细胞死亡”机制。我们的结果表明，BHT暴露会引发消化腺中ROS的显著积累。观察到一个时间依赖性的反应：最初0-6天内抗氧化防御被诱导，随后在12-21天阶段NRF2介导的途径受到抑制，最终导致抗氧化能力下降和大分子损伤。从机制上看，BHT诱导的ROS破坏了钙泵，导致Ca²⁺稳态失衡，并触发ER–线粒体应激轴，最终引发凋亡。此外，BHT还影响铁的稳态，导致Fe2?过载，从而驱动ALOX5介导的脂质过氧化，可能最终导致铁死亡（ferroptosis）。同时，NLRP3–CASPASE1信号通路的激活也可能触发焦亡（pyroptosis）。总体而言，这项研究提供了关于BHT如何在水生无脊椎动物中调控氧化应激介导的多途径程序性细胞死亡（PCD）的全面证据，为海洋生态系统中SPA污染的生态风险评估提供了重要的科学见解。

引言

合成酚类抗氧化剂（SPAs）是一类受阻的酚类化合物，在塑料、食品添加剂和个人护理产品等消费品中普遍存在[1]，[2]。由于在其整个生命周期中的广泛生产和释放，SPAs已成为陆地和水生环境中的持久性新兴污染物（ECs）[3]，[4]，[5]，[6]。这些化合物已在各种环境基质中被广泛检测到，包括河流[7]，[8]和海洋沉积物[9]、土壤[8]，[10]以及室内灰尘[11]，[12]。此外，它们的生物累积已在多种生物类群中被记录到，包括海鸟[13]、白鲸[14]和人类[15]，[16]。鉴于它们的神经毒性、干扰内分泌的作用以及对脊椎动物的生殖毒性[3]，[6]，SPAs对生态和公共健康构成了重大风险[8]，[17]，[18]。海洋是污染物的最终全球汇，海洋生态系统持续受到SPA暴露的压力。例如，在黄海和渤海的软体动物中观察到了SPAs的高积累[19]。然而，与陆地和水生脊椎动物相比，SPAs在海洋无脊椎动物中的毒理学机制仍不清楚，这代表了一个关键的知识空白，对生态风险评估和生物多样性保护至关重要。

氧化应激是外来物质诱导毒性的标志性机制。生物体通常利用Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）–核因子红细胞2相关因子2（NRF2）信号通路来激活抗氧化防御并中和活性氧（ROS）。防御系统不堪重负会导致大分子损伤、细胞器功能障碍，最终导致多种形式的细胞死亡[20]，[21]。在诸如Chlamys farreri和Mytilus coruscus这样的双壳类动物中，苯并[a]芘（BaP）的暴露会引发ROS积累、Nrf2或其同源物(McNrf2)的核转位，以及随后的脂质过氧化和DNA损伤[22]，[23]，[24]。关于特定的SPAs，据报道丁基化羟基茴香醚（BHA）和丁基化羟基甲苯（BHT）的暴露会在草鱼(Ctenopharyngodon idella)的肝脏中引发过量的ROS积累，同时总抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的活性增加，以及脂质过氧化加剧[25]。同样，在暴露于2,4-二叔丁基酚（2,4-DTBP）的亚洲蛤(Corbicula fluminea)中，观察到消化腺中抗氧化酶活性显著升高以及ROS和丙二醛（MDA）的积累[26]。虽然已知SPAs会引发氧化应激，但不同物种之间的抗氧化防御模式存在差异，需要更深入的机制研究。

氧化还原稳态的破坏可以触发涉及内质网（ER）和线粒体的细胞器应激级联反应，这是程序性细胞死亡（PCD）的核心[27]。过量的ROS和相关的氧化损伤会破坏ER Ca²⁺稳态，激活未折叠蛋白反应（UPR）[28]。这种细胞器应激进一步引发线粒体膜电位丧失，并扰乱线粒体融合和分裂的动态平衡，最终导致凋亡[27]，[29]。已知持久性有机污染物（POPs）会引发双壳类动物的PCD，例如BaP会在Chlamys farreri的血细胞中引发线粒体应激并激活凋亡信号通路[30]。纳米塑料在Ruditapes philippinarum的消化腺中引发显著的铁死亡（ferroptosis），其特征是ROS和Fe²⁺的积累、GSH/GSSG的减少以及脂质过氧化的增强，伴随着线粒体功能障碍[31]。此外，尽管已确定Caspase介导的Gasdermin E（GSDME）切割是Haliotis discus和Crassostrea gigas等水生无脊椎动物中焦亡的途径[32]，但POPs引发焦亡的具体机制仍不清楚。关于SPAs，研究显示它们可以通过“ER-线粒体应激”轴在脊椎动物中介导凋亡。例如，丙基没食子酸酯（PG）会在人类HTR8/SVneo细胞中引发线粒体Ca²⁺过载和膜电位失衡，通过ER应激相关途径诱导凋亡[34]。同样，BHT会破坏小鼠TM3 Leydig细胞中的细胞质和线粒体Ca²⁺稳态，引发ER应激和DNA损伤，从而激活内在的凋亡通路[35]。这表明SPAs可以介导脊椎动物的凋亡，但关于它们引发其他类型PCD的能力的研究尚不足。特别是，SPAs在水生无脊椎动物中引发的细胞死亡机制仍大多未探索。因此，阐明SPAs在海洋无脊椎动物中引发的多途径PCD轴对于明确毒理学机制和评估海洋生态风险至关重要。

节摘

动物和处理

2,6-二叔丁基-4-甲基酚（BHT，≥ 98%）来自北京Solarbio科技有限公司（中国北京）。关于R. philippinarum的适应条件的详细信息见补充信息（SI）的第1.1节。所有与动物相关的实验方案均符合国家实验室动物福利指南，并获得了中国海洋大学（青岛）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

转录组分析揭示氧化应激和细胞死亡反应

转录组分析显示，BHT显著扰乱了R. philippinarum消化腺中参与氧化应激和细胞死亡的关键基因的表达，大多数核心基因呈现整体上调趋势（图1A）。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析（图1B）确定了、GPX1、过氧化还原酶4/5（PRDX4/5）、激活转录因子4（ATF4）、线粒体融合素2（MFN2）、sequestosome 1（P62/SQSTM1）和caspase 1/8/9（CASPASE1/8/9）作为枢纽

讨论

近年来，作为典型的ECs，SPAs引起了人们对它们环境持久性和潜在健康风险的关注[8]，[17]。氧化应激是外来物质诱导毒性的核心机制[20]。先前的研究表明，SPAs会在淡水生物中引发ROS的显著过量产生，从而引发严重的氧化应激。例如，2,4-DTBP会抑制Cyprinus carpio中的抗氧化酶，但在Corbicula fluminea中会激活它们

结论

通过整合转录组学、计算模拟和实验验证，本研究阐明了在BHT胁迫下R. philippinarum中的“氧化应激–大分子损伤–细胞死亡”分子机制。我们的结果显示，BHT暴露会引发R. philippinarum消化腺中ROS的显著增加。最初0-6天内抗氧化防御被诱导，随后在12-21天阶段NRF2受到抑制，导致抗氧化能力下降

环境影响

本研究表明，BHT在Ruditapes philippinarum中引发过度氧化应激，触发ER–线粒体应激轴，激活了三种程序性细胞死亡通路：凋亡、铁死亡（ferroptosis）和焦亡（pyroptosis）。这些发现揭示了SPAs通过驱动多途径细胞功能障碍对海洋无脊椎动物造成低估的慢性风险。这种分子水平的损伤可能导致生物体的累积损伤。鉴于SPA污染物的普遍性，

CRediT作者贡献声明

王巧巧：方法学、研究、概念化。李鹏飞：方法学、研究。蔡荣军：方法学、研究。苗静静：监督、资源。李泽源：监督、资源。潘luqing：写作–审稿与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取、概念化。齐瑞成：写作–审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、软件、方法学、研究、数据分析

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用ChatGPT（OpenAI）来提高手稿的可读性和语言表达。使用该工具后，作者根据需要仔细审查和编辑了内容，我们对已发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号32273106）的支持。我们衷心感谢中国海洋大学的高性能生物超级计算中心和水产生态实验室提供的技术支持。同时，我们也感谢生理学实验室的工作人员在实验方面的协助，以及Sobereva博士在分子动力学模拟方面提供的宝贵指导。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。