《Journal of Hazardous Materials》：Temperature-dependent biofilm and sublancin production arrest soil arsenic and antibiotic resistance gene mobility
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气候变化引发的升温与砷污染协同威胁农业可持续性，其通过重构微生物群落和加速抗菌素耐药性传播。本研究通过温室和田间联合试验证明，由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168产生的生物膜以及sublancin（一种糖基化抗菌肽），可同时固定根际砷并抑
气候变化引发的升温与砷污染协同威胁农业可持续性，其通过重构微生物群落和加速抗菌素耐药性传播。本研究通过温室和田间联合试验证明，由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168产生的生物膜以及sublancin（一种糖基化抗菌肽），可同时固定根际砷并抑制抗生素抗性基因（ARGs）的水平转移。温度依赖性生物膜形成（25–35°C）增强了砷在胞外聚合物（EPS）基质中的封存，扫描电镜-能谱分析（SEM-EDX）显示在35°C时砷的重量百分比增加了74%，飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）分析证实，在温室和田间试验中，生物膜定殖的根表面关联砷分别增加了约14倍和9倍。Sublancin产量在30°C时达到峰值（129.72 mg L?1），选择性抑制了所有12种受试的致病性革兰氏阳性菌（抑制率为74–86%），同时保留了革兰氏阴性菌群落。在所有温度条件下，生物改良剂使水平基因转移（HGT）频率降低了74.7%（p< 0.001）。转录组分析揭示了胞外多糖生物合成（错误发现率FDR ~1.0 × 10?27）和sublancin合成机制（sunA：+3.5 log2）的协同上调，以及常规ARGs（vanA, blaTEM: ?2.5 至 ?4.0 log2）的下调。这些发现确立了sublancin作为一种双重功能、气候适应性的土壤生物改良剂，能在气候变暖情景下同时解决砷生物积累和抗生素抗性基因扩散问题。
气候变化引发的全球变暖与砷污染是当前农业土壤健康面临的双重胁迫。一方面，自1850-1900年以来全球已升温1.1°C，预计未来几十年内将达到1.5°C，这通过加速土壤有机质分解、触发养分流失、降低土壤质量，并重构土壤微生物群落，对农业土壤系统构成根本性威胁。另一方面，全球近五分之一的农业用地受到砷污染，浓度从背景值5 mg/kg到极端值超过4000 mg/kg不等，危及14亿人的粮食安全。这两种压力源相互作用，升温可能增强砷的生物有效性，并加速抗生素耐药性的传播。然而，目前关于土壤微生物对气候变化和砷污染的响应研究分散在不同领域，尚未整合探究其对微生物群落功能、污染物归趋及抗性基因扩散的协同效应。为此，研究人员开展了此项研究，旨在探究将枯草芽孢杆菌168的生物膜及其产生的抗菌肽sublancin联合作为一种生物改良剂，在田间条件下同时缓解砷污染和抗生素抗性基因传播的潜力，并阐明其在气候变化升温背景下的适应性。本研究论文发表在《Journal of Hazardous Materials》。
为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：综合使用了温室微宇宙和田间平行试验体系，模拟夏季升温（25、30、35°C）并评估生物膜形成与sublancin产量的温度依赖性。通过晶体紫染色法定量生物膜形成。利用扫描电镜-能谱联用（SEM-EDX）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）对生物膜内的砷进行高分辨率元素分布与深度剖析映射。采用反相高效液相色谱（HPLC）和核磁共振氢谱（1H-NMR）纯化与表征sublancin。通过定量聚合酶链反应（qPCR）和转录组测序，分析了砷抗性、生物膜形成、sublancin合成及磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（PTS）相关基因的表达模式。构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）并进行功能富集分析。最后，通过土壤微宇宙接合实验，量化了生物改良剂对水平基因转移（HGT）频率的抑制效果。
细菌生物膜发育与砷响应：通过晶体紫染色法发现，枯草芽孢杆菌生物膜形成呈现温度依赖性模式。砷的存在刺激了生物膜的形成，且在30°C时响应最强。扫描电镜观察和能谱分析证实，生物膜显著吸附了砷，减少了植物根系对砷的积累。总砷分析显示，施加生物膜后，从土壤到植物的砷质量平衡含量降低。这些结果表明，生物膜作为一种适应性策略，能够封存有毒的砷，特别是在升温可能增强砷生物有效性的气候情景下。
温度依赖性砷形态分级：高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用（HPLC-ICP-MS）分析和连续提取法揭示了温度对砷形态和生物有效性的影响。升温促进了砷（V）向毒性更强、移动性更高的砷（III）转化。然而，枯草芽孢杆菌生物膜的胞外聚合物（EPS）能有效固定两种形态的砷。连续提取显示，升温改变了砷在不同组分（可交换态、铁锰氧化物结合态、有机结合态、残渣态）间的分配，其中有机结合态砷在35°C时显著增加。这表明升温条件下，砷的自然衰减机制可能增强，但同时也可能从原生矿物中释放更多的砷。
Sublancin提取与土壤微生物生物量效应：研究成功从优化发酵的枯草芽孢杆菌168中提取并纯化了高纯度的sublancin。核磁共振氢谱确认了其S-连接的糖肽结构。土壤微生物生物量碳（MBC）分析表明，sublancin处理在不同温度下均显著降低了MBC，其中最大抑制效果出现在其最佳生产温度30°C。在35°C时MBC部分恢复，可能与sublancin热稳定性下降或微生物代谢率增强有关。这突显了气候变暖可能从根本上改变抗菌肽在农业土壤中的生态影响。
Sublancin对金黄色葡萄球菌的剂量依赖性效应：研究发现sublancin对金黄色葡萄球菌的生长抑制具有明显的剂量依赖性。其作用机制涉及多靶点破坏DNA复制、转录和蛋白质合成，而不损害细胞壁完整性。Sublancin的活性依赖于功能性的磷酸转移酶系统（PTS），并在48小时内保持稳定的抗菌活性，显示出对抗药性金黄色葡萄球菌的治疗潜力。
砷在生物膜中的截留：扫描电镜-能谱分析和飞行时间二次离子质谱分析提供了生物膜截留砷的直接可视化证据。砷在生物膜基质中的积累随温度升高而显著增加，在35°C时达到最高，相对于30°C砷的重量百分比增加了约74%。在温室和田间种植的水稻根系表面，生物膜定殖区域的砷信号强度远高于无生物膜对照，分别增加了约14倍和9倍。砷的富集热点空间分布与生物膜覆盖区域高度吻合，证实了根际砷优先被生物膜胞外聚合物层截留。长期稳定性受干湿交替条件和水解酶活性影响，但部分砷可能转化为稳定的有机金属配合物。
基因表达与代谢网络：基因本体富集分析显示，胞外多糖合成、信号转导和重金属抗性通路显著富集。热图分析揭示了砷抗性基因、sublancin基因和生物膜基因的差异化温度依赖性表达模式。STRING蛋白质-蛋白质相互作用网络分析识别出Spo0A和SinR等枢纽蛋白，它们连接着生物膜形成和砷应激响应模块。KEGG通路富集在35°C时突出了双组分系统、磷酸转移酶系统和细菌分泌系统，表明通过Spo0A主调控因子对eps、sin和ars操纵子进行协同调控。
Sublancin、磷酸转移酶系统与抗生素耐药性之间的相互关联：火山图分析显示，在30°C时，磷酸转移酶系统基因和sublancin合成基因（特别是sunA）显著上调。与此同时，经典的抗生素抗性基因如vanA和blaTEM显著下调。这种反向关系可能反映了细胞资源分配的竞争或调控串扰。基因本体富集分析证实了磷酸转移酶活性和碳水化合物跨膜转运活动的上调，表明细胞进行了重编程，强调碳水化合物代谢和磷酸转移系统。
Sublancin对土壤微生物群落的影响：箱线图和弦图分析证实了sublancin的选择性活性：它能显著减少革兰氏阳性菌的丰度，而对革兰氏阴性菌影响甚微，这归因于其作用机制依赖于革兰氏阳性菌中普遍存在的磷酸转移酶系统。sublancin处理导致土壤微生物群落结构发生显著变化，革兰氏阳性菌如Bacillus、Streptomyces等丰度大幅降低，而革兰氏阴性菌如Escherichia、Pseudomonas等保持稳定。抗生素抗性基因（ARG）丰度分析显示，在无sublancin时，ARG丰度随温度升高而增加；施加sublancin后，在35°C时ARG丰度急剧升高，表明在高温和抗菌肽选择压力共同作用下，可能富集了携带多重抗性机制的细菌。主成分分析（PCA）表明，sublancin处理增强了不同温度下ARG谱的分离。
致病菌减少：sublancin处理能选择性抑制土壤中的致病性革兰氏阳性菌。在测试的12种病原菌中，所有菌株的菌落形成单位（CFU）均较未处理对照显著减少，抑制率在74.3%至85.5%之间，其中包括人类机会致病菌和植物病原菌。这种选择性源于sublancin对活性磷酸转移酶系统的依赖，其通过破坏DNA复制、转录和蛋白质生物合成导致细胞死亡。
生物改良剂对抗生素抗性基因迁移的影响：接合实验定量评估了生物改良剂对水平基因转移频率的抑制效果。在液体培养基和土壤微宇宙中，施加生物改良剂（含sublancin）使质粒的水平基因转移频率降低了74.7%，转接合子数量也相应大幅减少。在温室和田间土壤中，该抑制效果在所有测试温度下均得以维持，且在30°C时抑制效果最强。这种抑制作用主要归因于sublancin对革兰氏阳性供体细胞的杀灭、对细胞膜完整性和接合配对形成效率的破坏，以及可能的能量限制。
在讨论部分，研究人员深入探讨了生物膜与sublancin在30-35°C温度窗口内的协同作用机制：胞外多糖产生在35°C达到峰值，而sublancin的产量和抗菌活性在30°C达到最佳，两者功能最优区间重叠，恰好与预测的农业升温情景相符。高于35°C，两者稳定性或形成均会下降。sublancin对革兰氏阳性菌的选择性抑制，在消除病原菌和竞争者的同时，可能通过释放微生物坏死物质为土壤提供养分脉冲，并可能促进土壤有机质的稳定。尽管存在sublancin抗性突变和间接交叉耐药性的潜在风险，但其对磷酸转移酶功能的依赖使得抗性具有适应性代价。生物膜介导的砷封存长期稳定性受到干湿交替、水解酶活性以及砷向稳定有机金属配合物转化的影响。该生物改良剂策略展示了一种在气候变暖条件下，同时管理土壤污染和抗生素耐药性传播的多功能途径，但长期的田间研究对于评估其对土壤氮磷循环和微生物群落恢复力的影响至关重要。
研究结论：本研究确立了枯草芽孢杆菌168来源的生物膜和sublancin作为一种集成的、双重功能的生物改良剂，可用于在气候胁迫下的农业土壤中同时缓解砷污染和抗生素抗性基因扩散。温度优化的生物膜形成（25–35°C）将砷在胞外聚合物基质中的封存增强了高达~2,250%（飞行时间二次离子质谱分析结果），且在温室和田间试验中效果一致（根关联砷截留分别增加14倍和9倍）。Sublancin作为一种精准抗菌剂，通过依赖于磷酸转移酶系统的杀菌活性，选择性抑制了12种致病性革兰氏阳性菌（抑制率74–86%），同时通过SunI介导的自身免疫性保留了革兰氏阴性菌群落和枯草芽孢杆菌的活力。接合实验证实，水平基因转移频率降低了74.7%（p< 0.001），且在所有温度条件下的两种土壤系统中效果均得以维持。转录组分析揭示了sublancin生物合成和胞外多糖产生的协同上调，以及经典抗生素抗性基因的下调，表明代谢重编程同时有利于抗菌肽生产并抑制了抗性决定簇。Sublancin的最佳生产温度（30.8°C）与预测的农业变暖情景相吻合，赋予了其直接的 climate-adaptive 相关性。这些发现首次提供了整合证据，表明单一微生物生物改良剂能够在变暖条件下同时阻止砷的迁移和抗生素抗性基因的转移，为污染农业生态系统的多功能土壤管理奠定了基础。
