严格素合成酶催化的下图式-斯彭格勒反应的机理阐释：用于稀有哌嗪-吲哚骨架的合成

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Mechanistic Elucidation of Strictosidine Synthase-Catalyzed Pictet-Spengler Reaction for Rare Piperazine-Indole Scaffold Formation

　　

陈媛媛|张世清|卢万清| Mou明奇| 刘福凤| 苏浩| 盛翔

天津科技大学生物技术学院，中国天津市300457

摘要

Strictosidine合成酶（STR）是一种催化色胺（tryptamine）和secologanin之间Pictet-Spengler（PS）反应的酶，生成strictosidine。该产物是植物中多种吲哚生物碱合成的关键中间体，其中许多具有显著的治疗潜力。最近的研究表明，STR在催化色胺类似物反应形成新的生物碱骨架时表现出广泛的活性。值得注意的是，来自Rauvolfia serpentina的STR（RsSTR）已被证明能够从1H-indole-1-ethanamine（1-IEA）和secologanin合成具有不常见哌嗪基-[1,2-a]吲哚骨架的strictosidine类似物。在这项研究中，通过量子化学计算，在原子水平上揭示了RsSTR催化的1-IEA与secologanin反应的详细机制。所有参与反应路径的中间体和过渡态的结构都得到了优化，并获得了能量剖面。有趣的是，研究发现，决定反应速率的步骤从自然反应中的质子转移转变为环化步骤。比较分析表明，这种变化是由于底物与活性位点残基之间的相互作用不同所致。本研究中报道的机制细节为RsSTR在合成罕见哌嗪基吲哚骨架中的催化活性提供了宝贵的见解。此外，这些发现有助于指导设计具有特定合成功能的STR酶。

引言

Strictosidine合成酶（STR）催化色胺（tryptamine）和secologanin之间的反应，生成(S)-strictosidine^[1]（图1a）。这种产物是大量吲哚生物碱合成的关键中间体，其中许多具有显著的药用价值。[2]，[3] 实际上，STR催化的反应是一种Pictet-Spengler（PS）反应[2]，[3]，[4]，[5]，[6]，因此STR被认为是一种Pictet-Spenglerase（PSase）。值得注意的是，STR是首个被发现的PSase。[6]，[7]，[8] 随后，还报道了多种其他的PSase。[9]，[10]，[11] 在这些酶中，另一种关键成员是norcoclaurine合成酶（NCS），它催化多巴胺（dopamine）和4-羟基苯乙醛（4-hydroxyphenylacetaldehyde）之间的反应。[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]，[12] STR和NCS都因其生物催化应用的潜力而受到广泛关注。

STR最初是从Catharanthus roseus的悬浮液中提取的。[13]，[14] 随后，从其他生物体中鉴定并表征了越来越多的STR酶，包括Rauvolfia serpentina（RsSTR）和Ophiopogon pumila（OpSTR）[15]，[16]，[17] 这些STR酶的晶体结构已在各种结合形式下得到解析。[17]，[18]，[19]，[20]，[21]，[22] 对RsSTR与色胺（PDB ID: 2FPB）或secologanin（PDB ID: 2FPC）复合物的结构分析表明，色胺深埋在活性位点内部，而secologanin结合在活性位点入口处。[17] RsSTR与strictosidine（PDB ID: 2V91）复合物的解析结构提供了有关产物在活性位点结合模式的重要信息[18]，并用于研究STR在合成多种生物碱骨架中的催化机制[23]，[24]。这些使用量子化学计算的研究表明，STR催化的天然底物色胺和非天然底物1H-indole-4-ethanamine（4-IEA）与secologanin的反应遵循典型的Pictet-Spengler（PS）反应机制。

对RsSTR催化的反应进行的机制分析揭示了关键的结构信息，包括活性位点中最佳的底物结合模式。先前的研究表明，天然和非天然底物在活性位点的结合方式不同。[23] 对于天然底物，由于secologanin的体积较大，色胺优先在活性位点内部结合，遵循“色胺先结合”的模式。对于非天然醛类底物，由于它们的大小相似，色胺和短链脂肪醛在活性位点的结合顺序相对随机。[23]

先前的研究表明，STR酶具有几个理想的特征，如广泛的底物谱和高对映选择性。[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[25]，[26]，[27]，[28] 这些特性使得STR在合成重要的生物合成中间体方面非常有用。特别是，STR酶在催化各种色胺类似物生成多种具有药用价值的中间体方面表现出显著的随意性。[8]，[19]，[22] 最近的研究表明，RsSTR能够通过催化1H-indole-1-ethanamine（1-IEA）和secologanin之间的PS缩合反应（图1b），合成具有不常见哌嗪基-[1,2-a]吲哚骨架的(S)-strictosidine类似物。[19] 哌嗪衍生物是合成药物化合物和杀虫剂的重要中间体，这突显了RsSTR在这些化合物的高效生产中的生物催化潜力。目前，这种STR催化的非天然反应机制尚未得到解决。

在这项研究中，使用量子化学计算在原子水平上揭示了RsSTR形成罕见哌嗪基-[1,2-a]吲哚骨架的详细反应机制。如上所述，提出色胺比secologanin更优先结合到活性位点。[23] 有理由假设本研究中的底物也采用类似的结合模式，即1-IEA先结合，因此深埋在活性位点内部。基于优化的酶-底物复合物结构，优化了反应路径中的过渡态和中间体的结构，并评估了它们的能量。确定了能量上可行的反应路径，并分析了关键氨基酸残基在反应中的作用。

章节摘录

计算细节

本研究中的所有计算均使用Gaussian 16 Rev. C.01程序[29]和B3LYP-D3（BJ）杂化密度泛函方法[30]，[31]，[32]，[33] 进行。几何优化计算使用6-31G（d,p）基组，然后使用SMD溶剂化模型[34]在同一理论水平上进行单点能量计算。遵循先前关于酶促反应的计算研究的既定协议，介电常数设置为ε = 4。[23]，[24]

结果与讨论

为了确保识别出对应于全局能量最小值的酶-底物结构而非局部最小值，通过生成具有不同底物和活性位点残基位置的多个初始结构进行了构象搜索，该搜索基于对活性位点内相互作用的分析。所有构象随后都进行了几何优化，并比较了它们的能量。确定的最低能量结构显示在

结论

在这项研究中，使用量子化学计算在原子水平上揭示了RsSTR通过催化1H-indole-1-ethanamine（1-IEA）和secologanin之间的反应产生罕见哌嗪基-[1,2-a]吲哚骨架的详细机制。当前研究表明，非天然底物1-IEA在活性位点的结合非常紧密，证明了RsSTR的活性口袋具有灵活性。这为该酶的广泛底物谱提供了结构基础

CRediT作者贡献声明

卢万清：数据整理、研究。张世清：撰写——审阅与编辑、研究、形式分析。Mou明奇：撰写——初稿、数据整理。刘福凤：撰写——审阅与编辑、形式分析。苏浩：撰写——审阅与编辑、监督、形式分析。盛翔：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、方法论设计、资金申请、概念化。陈媛媛：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化，

利益冲突

作者声明没有竞争性财务利益。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在竞争性利益的财务利益/个人关系：盛翔报告获得了中国国家重点研发计划的支持。盛翔报告获得了海河合成生物学实验室创新基金的支持。盛翔报告获得了天津合成生物技术创新能力提升项目的支持。如果有其他作者，他们

致谢

中国国家重点研发计划（编号：2021YFA0911500）、海河合成生物学实验室创新基金（编号：22HHSWSS00020）以及天津合成生物技术创新能力提升项目（编号：TSBICIP-CXRC-026）的支持。