将卵内RNA干扰（in ovo RNAi）改造为小脑神经环路形成过程中基因功能研究的工具

《Journal of Neuroscience Methods》：Adapting in ovo RNAi as a tool to study gene function during neural circuit formation in the cerebellum

　　

背景 小脑不仅对运动控制至关重要，还参与高级认知功能和情绪处理。其在神经发育障碍（如自闭症谱系障碍和注意力缺陷多动障碍）中的作用增强了对小脑发育分子机制的兴趣。研究人员此前建立了离体RNA干扰（ex ovo RNAi）技术，用于在鸡胚胎小脑体内神经环路形成期间进行时间可控的基因功能研究。然而，离体RNA干扰需要更高的技能，且效率低于卵内RNA干扰（in ovo RNAi），后者是研究人员为评估脊髓和外周神经系统基因功能而建立的技术。 新方法 为了提供一种比离体RNA干扰更简便的方法，研究人员将其卵内RNA干扰方案进行了改造，使其适用于小脑发育研究。该技术通过向鸡蛋内的鸡胚注射并电穿孔质粒和/或双链RNA（dsRNA），以操纵发育中小脑的基因表达。 结果 尽管对鸡胚进行了早期操作，但该方案仍允许在小脑发育过程中进行细胞类型特异性的功能缺失（loss-of-function）或功能获得（gain-of-function）分析。 与现有方法的比较 与离体方案相比，改造后的卵内RNA干扰方案更易学习，提高了存活率，从而提升了效率。为了验证该方法，研究人员复现了Endoglycan功能离体分析的表型。Endoglycan被证明可调节粘附强度。在发育中的小脑中，Endoglycan是浦肯野细胞（Purkinje cell）迁移所必需的，这反过来又影响颗粒细胞的增殖和小脑叶的生长。这些表型均可通过改造后的卵内RNA干扰方案复现。 结论 该改造方案提供了一种便捷的工具，用于研究小脑发育过程中疾病相关基因的功能，且具有更高的效率。

该论文发表于《Journal of Neuroscience Methods》，题为“Adapting in ovo RNAi as a tool to study gene function during neural circuit formation in the cerebellum”。研究人员针对小脑发育研究中现有技术存在的局限性，成功建立并验证了一种改良的卵内RNA干扰（in ovo RNAi）技术。传统的小鼠模型因出生后小脑仍在发育，难以分析环路形成期的基因功能；而鸡胚虽为优良模型，但缺乏遗传工具。研究人员此前建立的离体RNA干扰（ex ovo RNAi）虽有效，却操作难度大、效率低。为此，本研究旨在提供一种更高效、易学的替代方案。研究结果表明，改良后的卵内RNA干扰技术能够在胚胎早期（E3/E4）进行操作，并在后期发育阶段（至少至E14）仍能诱导显著的基因功能缺失表型，且成功复现了Endoglycan调控浦肯野细胞迁移的经典表型，证明了该方法的稳健性。这一成果为探索小脑发育及相关神经疾病的分子机制提供了强有力的技术手段。

关键技术方法主要包括：1. 卵内RNA干扰（in ovo RNAi）技术：在胚胎第3天（E3，HH18-20）通过开壳窗操作，将质粒和/或双链RNA（dsRNA）注射入神经管中央管，并利用特制玻璃钩调整头部角度进行电穿孔。2. 细胞类型特异性标记与验证：通过共电穿孔膜定位（法尼基化GFP）、胞质（RFP）或核定位（H2B-mGreenLantern）的报告基因质粒，结合特定细胞标志物抗体（如Calbindin、Vimentin、Doublecortin、Pax2）的免疫组织化学染色，验证不同细胞类型的转染效率。3. 表型分析：以Endoglycan为模型基因，利用dsRNA进行敲低，通过整体荧光观察和脑切片Calbindin染色评估小脑形态及浦肯野细胞迁移异常。

研究结果部分：

1. 1.
   卵内RNA干扰可用于靶向小脑发育过程中的不同细胞类型
   研究人员通过改进原有的脊髓及外周神经系统研究方案，成功将卵内RNA干扰应用于小脑。利用玻璃钩调整胚胎头部位置进行电穿孔，实现了对小脑原基的有效转染。结果显示，即使在早期（E3）进行电穿孔，报告基因（如法尼基化GFP）的表达仍能持续并有效覆盖E14（HH40）时的所有小脑叶。通过共转染不同亚细胞定位的报告质粒（膜定位GFP、胞质RFP、核定位H2B-mGreenLantern），并结合特异性抗体染色（抗Vimentin、抗Calbindin、抗Doublecortin、抗Pax2），研究人员证实了该技术能够成功靶向多种细胞类型，包括胶质细胞、浦肯野细胞、新生神经元以及中间神经元前体细胞（如星状细胞和篮状细胞前体）。
2. 2.
   通过卵内RNA干扰沉默Endoglycan导致浦肯野细胞迁移异常
   为了验证新方案的可靠性，研究人员利用卵内RNA干扰技术沉默了Endoglycan基因。此前的研究表明Endoglycan作为细胞粘附的调节因子，其缺失会导致脊髓轴突交叉异常及小脑浦肯野细胞迁移受阻。在本研究中，对照组（仅转染GFP质粒）胚胎小脑发育正常，浦肯野细胞排列成单层。相比之下，共转染dsEndoglycan和GFP质粒的实验组，小脑体积显著减小，叶状结构形成异常。免疫染色显示，浦肯野细胞未能正确迁移至皮层外围并形成单核细胞层，而是滞留于小叶中心区域。这一表型与之前利用离体RNA干扰技术获得的结果完全一致，从而验证了改良后卵内RNA干扰方案的有效性。

讨论部分总结及结论翻译：

研究人员指出，尽管操作在胚胎早期（E3）进行，但基因功能的阻断效果一直持续到小脑发育的较晚期（至少E14），这表明该方法能有效克服蛋白质预存带来的干扰，因为靶向的是小脑细胞的前体细胞，且随后的细胞分裂会稀释原有蛋白。该方案建立在成熟的脊髓和背根神经节转染方案基础上，相较于Luo和Redies（2004）或Green和Wingate（2014）的方法，本技术采用平行放置于体轴两侧的电极，不接触胚胎组织，避免了潜在的物理损伤，允许使用更高电压从而提高转染效率。研究人员还提供了详细的故障排除指南，强调了无菌操作、电极维护和电压校准的重要性。

结论

该改造方案为研究小脑发育过程中疾病相关基因的功能提供了一项便捷工具，且效率显著提高。