提高紫花苜蓿（Medicago sativa L.）对低pH值和高铝土壤的耐受性

《Crop Science》：Improving low-pH and high-aluminum field tolerance in alfalfa (Medicago sativa L.)

　　摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是美国第四大经济价值最高的田间作物。然而，在以酸性土壤为主的地區，包括美国东南部，紫花苜蓿的产量受到限制。本研究的目的是为了探讨低pH值土壤对产量和秋季休眠特性的影响，并筛选出适合下一轮育种的优质基因型。从国家植物种质资源系统的966个不同基因资源中，选择了133个基因型，在低pH值的田间环境中进行了为期三年的评估。通过这些基因型之间的杂交，得到了半同胞家族，并在六个不同环境条件下（年-地点组合）对它们进行了行种植实验：一个自然低pH值土壤（pH 4.9–5.2，可提取铝含量为10.41–11.38 mg kg?1）和一个调整过pH值的土壤（pH 6.37–7.07，可提取铝含量为0.01–2.29 mg kg?1）。研究结果表明，酸性胁迫导致每株鲜重产量减少了61克（p < 0.001），秋季休眠等级下降了1.47级（p < 0.01）。在相对较短的研究期间，调整过pH值的土壤条件并没有显示出比低pH值土壤更高的存活率。基于低pH值和调整后pH值条件下的产量数据建立的酸性土壤适应性指数（ASAI）显示，在至少4个测试环境中，有56个半同胞家族表现出良好的耐酸性，表明其稳定性较高。尽管存在环境差异和基因型与环境的交互作用，但产量（遗传力估计值为0.80–0.90）和耐酸性（遗传力估计值为0.854）仍具有较高的遗传性，这表明可以从这些基因资源中培育出适应特定地区的、耐酸性和耐铝性的品种。

**通俗语言总结**

紫花苜蓿是一种具有较高经济价值的作物，但在美国东南部由于不耐酸性和富铝土壤而未得到充分利用。本研究旨在寻找具有更好耐酸性能力的紫花苜蓿品系，以开发适合该地区的新商业品种。研究发现，有56个品系在低pH值和富铝土壤中表现优异。这项研究强调了在目标环境中评估多样基因资源的价值。

**缩写说明**

- ASAI：酸性土壤适应性指数（Acid Soil Adaptation Index）
- AY：每株每株鲜重产量（average yield per plant per cut）
- CEC：阳离子交换容量（cation exchange capacity）
- DMY：鲜重产量（dry matter yield）
- FDR：秋季休眠等级（fall dormancy rating）
- OM：有机质（organic matter）
- PI：植物引入（plant introduction）
- SD：标准差（standard deviation）
- TY：每年每株总产量（total yield per plant per year）

**1 引言**

酸性土壤（pH < 5.5）分布广泛，占全球无冰土壤的50%（Von Uexküll & Mutert, 1995）。全球超过60%的酸性土壤集中在温暖的热带和亚热带地区，这对许多粮食不安全国家的农作物生产构成了重大障碍（Che et al., 2023; Kopittke et al., 2019; Sanchez et al., 2003; Zhu & Shen, 2024）。土壤pH值影响植物所需大多数必需营养素的可用性，因此植物的反应性会因土壤质地、阳离子交换容量（CEC）、有机质（OM）含量、具体作物和品种、酸度程度以及生长环境等因素而大不相同（Delhaize & Ryan, 1995; Hajiboland et al., 2023）。在pH < 5.5的土壤中，氮（N）、磷（P）、钾（K）、硫（S）、钙（Ca）、镁（Mg）和钼（Mo）等元素的可用性显著降低，而铁（Fe）、锰（Mn）、硼（B）、铜（Cu）和铝（Al）等重金属的可用性则大大增加（Roques et al., 2013）。这些因素可能导致多种营养缺乏症状以及铝和锰的毒性（Riede & Anderson, 1996; Zheng, 2010）。在酸性土壤上，铝毒性和磷缺乏是限制作物生产力的两个主要因素，其中磷缺乏还会因土壤溶液中铁和铝氧化物的固定作用而加剧（Che et al., 2023; Zheng, 2010）。由于这些胁迫同时发生在田间，很难区分过量质子、各种营养缺乏和金属毒性的影响（Zhao et al., 2014）。耐酸性品种必须具备更好的养分吸收和利用能力，以及抵御铝和锰毒性的机制。2023年，美国紫花苜蓿的种植面积超过1560万英亩（630万公顷），产值超过106亿美元（USDA-NASS, 2024a, 2024b）。研究表明，紫花苜蓿对低pH值土壤中的铝毒性非常敏感，这种土壤条件会抑制根系生长（Delhaize et al., 1993; Khu et al., 2012）、生物量产量（Bouton, 1996）、持久性（Wolf et al., 1994）、固氮能力（Ferguson et al., 2013）以及组织培养中的愈伤组织生长（Parrott & Bouton, 1990）。土壤溶液中高浓度的游离铝离子会干扰多个根细胞过程，包括阳离子养分的吸收、细胞壁稳定性以及钙信号传导（Buol & Eswaran, 1993）。铝离子会结合并破坏对质膜结构和功能至关重要的蛋白质和脂质，导致质膜去极化，干扰细胞稳态，尤其是钙离子的平衡（Panda & Matsumoto, 2007）。铝毒性还会干扰果胶基质中的羧基群，增加细胞壁的硬度，减少水分和矿物质养分的吸收，并影响根尖细胞的分裂和伸长（Delhaize et al., 2007; Kochian et al., 2004; D. Zhang et al., 2014）。这些因素共同导致根系发育受阻，而根系是紫花苜蓿收获后再生和越冬休眠期间的重要能量储备（Hesterman & Durling, 1991; Rice et al., 1977）。紫花苜蓿需要大量磷、钾和钙才能保持高产，每生产一吨干物质需要消耗6吨磷、48吨钾和30吨钙（Undersander et al., 2011）。低pH值土壤中这些养分的生物利用度降低，再加上铝胁迫导致的根系生长受阻，可能是紫花苜蓿在低pH值土壤下表现不佳的原因。尽管施用石灰和石膏可以改善紫花苜蓿的生长状况，但这些改良措施通常无法深入到足够深的土层中，无法满足根系的需求（Undersander et al., 2011）。此外，长期来说，在许多田间环境中，尤其是在边远地区和发展中国家，土壤改良措施成本高昂且操作不便（Bouton, 1996）。因此，长期在酸性土壤中栽培紫花苜蓿的最佳方法是培育耐低pH值和铝的品种。过去三十年间，大量研究致力于了解紫花苜蓿对低pH值和铝耐受性的遗传基础（Barone et al., 2008; Bouton, 1996; Bouton & Sumner, 1983; Bouton et al., 1986; Dall'Agnol et al., 1996; Khu et al., 2010, 2012; Ma et al., 2018; Narasimhamoorthy et al., 2007; Pan et al., 2008; Parrot & Bouton, 1990; Sledge et al., 2002）。然而，这些努力尚未带来耐性品种的诞生。紫花苜蓿育种过程中存在许多内在障碍，限制了这一性的改进。作为一种多年生植物，紫花苜蓿需要经过3-5年的表型评估才能进行选择性繁殖。这种方法虽然有效，但受到资源限制，需要每年多次收获大量且多样化的基因资源，且许多重要数量性状（如产量）的遗传力较低（Li & Brummer, 2012）。持续的基因分离、非加性遗传效应和环境因素的相互作用会导致表型变异较大，从而降低选择效率（Acharya et al., 2020; Annicchiarico et al., 2015; M. Casler, 1998）。此外，还需要考虑许多其他经济重要的性状，如持久性、营养价值和秋季休眠等级（FDR），这些性状可能与鲜重产量（DMY）无关或呈负相关（M. Casler, 2001）。鉴于低pH值和铝胁迫的复杂性，耐受性被认为是一个高度量化的性状，涉及与养分效率提高和铝耐受性相关的等位基因（Khu et al., 2010; Ma et al., 2018）。本研究的目标是利用多年多地点的田间表型评估系统，评价一组半同胞家族的低pH值和铝耐受性。在四年间，分别在不同pH值的田间条件下测量了鲜重产量（DMY）、秋季休眠等级（FDR）和持久性。通过比较基因型在低pH值和调整后pH值条件下的表现与平均表现，评估了DMY的遗传力以及低pH值胁迫对FDR和持久性的影响。采用酸性土壤适应性指数（ASAI）（Howeler, 1991）筛选出表现最佳的家族，并从中选择最佳个体，为下一轮选择性繁殖提供遗传基础。

**2 材料与方法**

**2.1 基因资源开发与田间建立**

2014年，将来自国家植物种质资源系统的966个基因资源直接播种在乔治亚州蒂夫顿市Black Shank Farm的育苗箱中，行间距为75厘米，土壤pH值为4.90。经过四年的评估后，选出318株生长最旺盛的植株，并将其移植到乔治亚州雅典市的田地中，那里的土壤pH值为5.12，继续进行了三年的评估。从133个选定的基因资源中挑出最佳植株，通过蜜蜂辅助进行杂交。杂交产生的半同胞种子在温室中培育，然后将幼苗移植到乔治亚州雅典市的J. Phil Campbell研究与教育中心西区进行两次田间试验（地理坐标：33.8693°N, ?83.4499°W）。其中一个试验在自然低pH值土壤环境中进行（pH 5.09，可提取铝含量为8.10 mg kg?1），另一个试验在调整过pH值的土壤环境中进行，在种植前每公顷施用了405公斤Pennington快效石灰（pH 5.82，2020年5月）（见表S1）。2021年10月18日至19日，向调整过pH值的土壤施用了381公斤石灰和381公斤石膏，将pH值调整至6.18，可提取铝含量调整为0.45 mg kg?1。这两个试验地点的土壤类型均为高度风化的Cecil砂质粘壤土（粘粒含量高、高岭石型、热性土地利用类型Kanhapludults），这是皮埃蒙特地区的典型土壤类型。每个试验包含138个基因型（133个半同胞家族和5个对照组，包括2个为东南部地区开发的商业品种以及3个在实验室和温室中培育的耐铝基因型），采用随机完全区组设计，每个重复三次。每个小区包含8株同一家族的植株，行间距为5英尺，株距为2.5英尺。两个试验均通过茎段繁殖的方式在2022年秋季重新在乔治亚大学蒂夫顿分校的动物科学农场进行了复制（地理坐标：31.4996°N, ?83.5312°W）。蒂夫顿市的低pH值土壤pH值为4.9，可提取铝含量为11.38 mg kg?1；调整过pH值的土壤pH值为7.07，可提取铝含量为0.01 mg kg?1（见表S1）。这两个试验地点的土壤均属于Tifton系列粘壤土（细粒粘土、高岭石型、热性土地利用类型Kandiudults）。试验管理遵循UGA扩展机构的建议（Hancock et al., 2015），并在乔治亚大学土壤、植物和水实验室进行了土壤测试，以确定pH值、可提取铝含量及施肥需求（Reeve & Sumner, 1971）。

**2.2 表型数据收集**

2021年至2024年在雅典市，以及2023年和2024年在蒂夫顿市，收集了包括鲜重产量（DMY）、每株植株数和秋季休眠等级（FDR）在内的表型数据。在整个生长季节（大约每年5月至10月），每隔25-28天对每个小区的植株进行10%-25%的开花期的收获。鲜重产量的测定方法是在田间称量每个小区的鲜重，将其样品在对流烤箱中干燥48小时后，再乘以鲜重百分比得到。2022年和2023年在雅典的几次收获因鹿的严重破坏（分别发生在2022年7月和9月以及2023年8月和9月）而不得不被废弃。每年每块田地的总产量（TY）是通过将生长季节内每次收获的干物质产量（DMY）相加计算得出的，而每次切割的平均产量（AY）则是通过将TY除以每年的切割次数来得出的。持久性是通过定期计算每块田地中的植物数量来衡量的。在所有地点和条件下，至少每年进行两次植物计数。最接近第一次收获时的植物计数与最接近最后一次收获时的植物计数平均后，得到了每种条件×地点×年份组合下的每块田地的平均植物数量。评估了不同环境和条件下的平均植物数量，以确定低pH值土壤条件对持久性的影响，并识别出在低pH值田间压力下具有优异持久性的品种。为了评估半同胞群体的自由度校正（FDR），测量了每个家族行中最高、最短和中等高度个体的秋季高度（以厘米为单位）。2021年12月20日和2022年10月24日在雅典记录了植物高度。对每个休眠类别的11个对照品种的所有五个重复实验都测量了这三个高度，这用于创建一个回归方程，根据平均高度为每个家族分配FDR。在蒂夫顿，发现在建立后，调整pH值组中的重复实验1受到了线虫的影响。为了减少数据量，将重复实验2中的AY与重复实验1中的AY进行了比较。那些在重复实验1中的产量比在重复实验2中少50%以上的样本被移除了（图S1）。2023年从重复实验1中移除了6块田地，2024年移除了51块田地。

2.3 产量数据分析

所有地点、年份和条件的DMY数据都汇总在Microsoft Excel（版本2412）中，并使用RStudio（版本2025.5.0.496）生成了汇总统计。评估了不同条件和环境之间的变化，以评估低pH值田间土壤对该群体产量表现的影响，并识别出具有优异持久性的家族基因型。使用调整pH值条件下的平均产量来预测低pH值条件下的平均产量，以确定是否确实需要在低pH值田间土壤中进行测试来识别耐酸基因型。使用受限最大似然（REML）混合模型分析评估了基因型、环境以及基因型与环境的相互作用（G × E）。测试了多种模型参数化方案，并选择了Akaik信息量准则（AIC）最低的模型，以达到最佳拟合度和模型复杂性的平衡。最终模型包括基因型、环境（年份×地点）以及G × E作为随机效应，土壤pH值条件和每块田地的平均植物数量作为固定效应。使用RStudio中的SpATS（空间分析中使用样条的田间试验）包进行了空间分析，以考虑每个土壤pH条件内的空间异质性（Rodríguez-álvarez等人，2014）。对于每个环境（年份×地点组合），模型以基因型作为固定效应进行拟合，并对行和范围位置的空间趋势进行了建模。通过残差诊断验证了模型的拟合度和假设，包括QQ图、残差直方图和残差与拟合值图（图S2）。

2.4 酸性土壤适应指数

根据Howeler（1991）中描述的方法，评估了苜蓿基因型对酸性土壤的耐受性：

其中ASAI是酸性土壤适应指数，Ys是在低pH条件下的产量，Yp是在调整pH条件下的产量，μs是在低pH条件下的平均产量，μp是在调整条件下的平均产量。该指数表明，耐受性基因型的ASAI > 1，而非耐受性基因型的ASAI < 1。每年×地点组合以及所有环境中的家族基因型分别分配了ASAI值。

2.5 遗传力

使用三种方法估计了遗传力（H2）。分别在调整pH值和低pH值条件下基于家族平均值计算了遗传力（H2f），如下所示：

其中Vg是基因型方差，Vg × e是基因型与环境的相互作用，Ve是残差方差，L是环境数量，R是重复次数（Holland等人，2002）。方差成分来源于一个混合模型，该模型包含了基因型、环境、基因型与环境以及平均植株数量作为随机效应。L等于6（雅典4年的数据和蒂夫顿2年的数据），R等于2。除了通用模型外，还使用Piepho模型和Cullis模型估计了遗传力，这些模型对不平衡的研究设计具有鲁棒性（Piepho & Mohring, 2007; Schmidt等人，2019）。使用inti R包中的H2cal函数计算了跨环境的遗传力，考虑了环境数量和重复次数。通过使用lmer（lme4包）拟合相同的线性混合模型并用emmeans提取调整后的平均值来估计遗传力。最后，使用ranef函数从模型中提取了经验最佳线性无偏预测因子来估计遗传力。

3 结果

3.1 低pH值压力对DMY的影响

与调整pH值条件相比，低pH值田间条件使每次切割的每行田地的平均干物质产量减少了52.7克（p < 0.001），尽管这种差异的幅度因年份和地点而异（图1）。在2024年的蒂夫顿，这一趋势发生了逆转，低pH值条件下的产量比调整pH值条件下的产量高出37.7克。所有环境中的配对学生t检验显示产量差异具有统计学意义（p < 0.001）。平均产量（AY）和总产量（TY）的平均值和标准差因环境和条件而显著不同（表1）。图1显示了在整个（a）和按环境（年份×地点）（b）划分的条件下，每次切割的平均干物质产量（AY）的变化。Δ值表示调整pH值条件与低pH值条件之间的平均产量差异。星号表示基于t检验的统计学上显著的差异（***p < 0.001）。表1显示了按环境（地点×年份）和土壤pH条件划分的每次切割的平均产量（g，AY）和总产量（g，TY）的平均值、标准差和最大值。

3.2 低pH值和调整pH值土壤条件下的产量表现显著相关，皮尔逊相关系数为0.597。使用低pH值条件下的AY预测调整pH值条件下的AY的简单线性模型显示出这种关系非常显著（p < 0.01），其调整后的R2为0.36（图2）。使用调整pH值条件下的AY作为固定效应，低pH值条件下的平均植物数量作为随机效应的混合模型分析进一步证明了这一关系。平均植物数量的内类相关性显示，每块田地的平均植物数量解释了低pH值条件下AY变化的22%，以及调整pH值条件下方差的32%。通过绘制低pH值条件下的AY与调整pH值条件下的AY之间的关系进一步证明了低pH值压力对AY的影响（图2）。

3.3 酸性土壤耐受性（ASAI）

使用ASAI值来评估苜蓿基因型对酸性土壤的耐受性，方法如下：

其中ASAI是酸性土壤适应指数，Ys是在低pH条件下的产量，Yp是在调整pH条件下的产量，μs是在低pH条件下的平均产量，μp是在调整条件下的平均产量。该指数表明，耐受性基因型的ASAI > 1，而非耐受性基因型的ASAI < 1。ASAI值分别针对每年×地点组合和所有环境为家族基因型进行了分配。

3.4 遗传力

使用三种方法估计了遗传力（H2）。分别根据调整pH值和低pH值条件下的家族平均值计算了遗传力（H2f），如下所示：

其中Vg是基因型方差，Vg × e是基因型与环境的相互作用，Ve是残差方差，L是环境数量，R是重复次数（Holland等人，2002）。方差成分来源于一个混合模型，其中基因型、环境、基因型与环境以及平均植株数量作为随机效应。L等于6（雅典4年的数据和蒂夫顿2年的数据），R等于2。除了通用模型外，还使用了Piepho模型和Cullis模型来估计遗传力，这些模型对不平衡的研究设计具有鲁棒性（Piepho & Mohring, 2007; Schmidt等人，2019）。使用inti R包中的H2cal函数计算了跨环境的遗传力，考虑了环境数量和重复次数。使用lmer（lme4包）拟合了相同的线性混合模型，并使用emmeans提取了调整后的平均值。最后，使用ranef函数从模型中计算了经验最佳线性无偏预测因子来得出遗传力估计值。还分别使用以下公式计算了每个地点和年份及条件组合的广义遗传力估计值。**广泛意义上的遗传率估计，涵盖了每个独特的条件×地点×年份组合。环境与年份**

| 条件 | H2 | 基因型方差 | 残差方差 |
|-------|------|---------|---------|
| 雅典2021 | 0.466 | 1382.7 | 3219.7 |
| 雅典2021（低）| 0.344 | 482.3 | 1867.1 |
| 雅典2022 | 0.550 | 7610.1 | 12618.4 |
| 雅典2022（低）| 0.571 | 4432.7 | 6748.4 |
| 雅典2023 | 0.553 | 8719.8 | 14289.9 |
| 雅典2023（低）| 0.478 | 3228.3 | 7163.1 |
| 蒂夫顿2023 | 0.756 | 7954.5 | 5033.1 |
| 蒂夫顿2023（低）| 0.422 | 2172.8 | 6050.5 |
| 雅典2024 | 0.288 | 1275.4 | 6383.2 |
| 雅典2024（低）| 0.388 | 442.8 | 1420.0 |
| 蒂夫顿2024 | 0.815 | 9240.9 | 3536.3 |
| 蒂夫顿2024（低）| 0.447 | 3023.1 | 7574.4 |

ASAI的遗传率是使用线性混合效应模型估算的，该模型分别计算了每个环境（地点×年份）的ASAI值。模型以基因型和环境作为随机效应进行拟合，并提取了方差成分。遗传率估计值为0.854，略高于使用相同公式估算的AY的遗传率。ASAI在不同环境中的相关模式与AY非常相似，如预期，范围从0.28（蒂夫顿2023-雅典2024）到0.84（雅典2022-雅典2023）（图5）。总体而言，在同一地点内观察到的相关性较高，而随着时间的推移相关性下降（即，2021年雅典的数据与2022年雅典的数据相关性更强，而与2024年雅典的数据相关性较弱）。

**图5**：显示了AY（每次收割的平均产量）（a）和酸性土壤适应指数（ASAI）（b）的皮尔逊成对相关系数图，深蓝色表示强正相关，深红色表示强负相关，浅颜色表示弱相关。

**3.4 秋季休眠评级**

配对t检验显示，低pH值和铝（Al）胁迫显著影响了FDR，平均低1.47个级别（t = -16.096，df = 137，p < 0.01）。在低pH条件下，平均植株高度也显著降低，平均短4.87厘米（t = -19.134，df = 137，p < 0.01）。FDR与AY之间的皮尔逊相关系数为0.261，平均植株高度与AY之间的相关系数为0.299。方差分析表明，FDR作为唯一固定效应，是AY的显著预测因子（F(1, 545) = 34.02，p < 0.01），尽管调整后的R2仅为0.057。这表明尽管AY和FDR之间存在意义相关，但效应大小太小或信号太嘈杂，无法获得高预测能力。建模FDR和条件作为固定效应时显示，每增加一个秋季休眠级别，AY平均增加34.06克（F(2, 544) = 20.27，p < 0.01）。分别评估低pH和调整pH条件时，FDR在低pH条件下不是AY的显著预测因子（F(1, 272) = 2.634，p = 0.106），但在调整pH条件下具有显著性（F(1, 271) = 13.22，p = 0.0003）（图6）。

**图6**：显示了在不同pH条件下TY（年总产量）（g）和秋季休眠评级（FDR）之间的相关性差异。总体而言，调整pH条件下的平均值更高，变异也更大（FDR：平均值 = 4.38，标准差[SD] = 1.68；AY：平均值 = 233 g，SD = 145；低pH条件：平均值 = 2.90，SD = 1.22；AY：平均值 = 182 g，SD = 105）（图7）。在胁迫条件下，分布变得更加集中，这可能解释了为什么FDR在低pH条件下与AY没有显著相关性，但在调整pH条件下却有显著相关性。因为休眠检查是在调整pH的田间土壤中进行的，所以低pH条件下的FDR应该被视为低pH和铝胁迫如何影响休眠时间的指标，而不是该基因型休眠级别的准确测量。

**3.5 持久性**

持久性以每年每块田地的平均植物数量来衡量，在不同pH条件下存在显著差异。在雅典的所有年份中，低pH条件下的每块田地平均植物数量比调整pH条件下的多0.217株（p = 0.03）；在蒂夫顿，低pH条件下的每块田地平均植物数量比调整pH条件下的多0.398株（p < 0.01）。这些差异在不同年份间有显著差异，仅在2024年的雅典和蒂夫顿观察到显著差异（表5）。

**表5**：按地点×年份和条件划分的每块田地的平均植物数量。

**注：** p值是通过t检验确定的，用于识别条件之间的持续性差异。NS表示p > 0.05，单个星号（*）表示p < 0.05，双星号（**）表示p < 0.01。将持久性视为每块田地按地点和条件的死亡率百分比来看，结果显示在蒂夫顿两年后，存活率几乎没有差异（0.4%），在雅典四年后也是如此（0.6%）（表6）。地点的不同导致差异方向不同，低pH条件的持久性略微较高，而在调整pH条件下则具有优势。

**4.1 低pH值和铝胁迫对DMY的影响**

正如预期的那样，低pH值的土壤条件显著降低了DMY。在低pH值和铝胁迫下，AY的平均值和范围都减少了（图7a）。AY的平均差异为61克。鉴于本次田间试验使用的行株大小较小（5英尺×2.5英尺/1.5米×0.7米），这一差异相当于每次收割减少525千克/公顷。空间种植地块与密集种植草地地块之间的AY相关性因植物竞争的差异而变化，但在饲料育种计划的早期阶段，通常会进行行株评估，以适应更大的种植规模（M. D. Casler等人，1996年）。调整pH条件和低pH条件下的DMY差异在不同环境中显著不同，表明年份和地点是DMY的重要驱动因素。在苜蓿研究中，显著的环境和基因型×环境（G × E）效应很常见（Acharya等人，2020年；Brummer & Casler，2014年）。显著的G × E交互作用使得选择表现最佳的基因型变得复杂，因为表现可能在不同环境中不一致，并导致它们的相对排名发生变化（Bekeko，2017年；DeLacy等人，1996年；Fernandez，1991年）。显著的G × E交互作用需要针对特定环境进行育种工作，包括非生物胁迫因素（Annicchiarico等人，2022年）。尽管环境和G × E效应显著，但观察到的基因型方差较大，表明在该种群中存在遗传改良的潜力。调整pH条件和低pH条件下的AY显著相关，R2值为0.351。这表明虽然在不同pH条件下的表现呈正相关，但仅使用调整pH条件预测低pH条件下的表现时，仍有显著变异未被解释。考虑到在多年和不同地点维持和表型分析所需的资源，可能在育种过程的早期阶段仅在低pH环境中进行选择，并在后期验证在调整pH土壤中的表现是否得到保持可能更高效。2024年蒂夫顿的产量差异发生了反转，即使在考虑了线虫损害后，低pH条件的产量也高于调整pH条件（图1）。2023年12月的土壤测试显示，蒂夫顿的低pH条件下的K（平均56毫克/千克）和P（平均80毫克/千克）高于调整pH条件（平均40千克/千克，49毫克/千克），尽管土壤高度酸性和铝含量丰富（pH 4.90，可提取铝 = 11.58毫克/千克）（表S1）。根据土壤测试结果进行施肥，以恢复低pH和调整pH田地的相似肥力。然而，肥力的差异表明低pH田地的有机质（OM）含量较高，这可能解释了蒂夫顿低pH条件下表现改善的部分原因。如果确实如此，这表明高肥力的土壤可以克服低pH和铝胁迫对苜蓿产量和表现的一些负面影响。这与先前的假设一致，即低pH和铝胁迫的主要影响是减少养分吸收和可用性（Kochian等人，2004年；Zhao等人，2014年；Zheng，2010年）。其他土壤特性，如CEC和持水能力，也可能解释这一意外结果，但本研究中没有测量这些特性。

**4.2 ASAI和AY的遗传率**

数据集的复杂性允许通过使用不同的数据子集来估算酸耐受性，并计算ASAI值。虽然基因型的相对排名和差异幅度在不同环境中有所不同，但相同的基因型始终被识别出来。这一点通过至少在四种环境（地点×年份组合）中被识别的56个基因型得到证实（图4），并且通过所有年份在雅典和蒂夫顿都被识别的44个基因型得到强调。这种高度的重叠表明酸耐受性是由遗传因素而非环境因素驱动的，尽管存在显著的G × E效应。这种高度的重叠验证了本研究中进行的田间评估有效识别了耐受基因型，并表明酸耐受性在该种群中是一个稳定的性状。在总共评估的138个基因型中识别出56个耐受基因型是一个很高的比例，特别是考虑到在之前的研究中改进铝耐受性的难度（Bouton，1996年；Dall'Agnol等人，1996年；Khu等人，2012年）。这可能是由于初始种群的遗传多样性以及选出具有改进的低pH和铝耐受性的亲本基因型所致。AY的遗传率估计值（0.800–0.898）和ASAI的遗传率估计值（0.854）对于数量性状来说相对较高。苜蓿的DMY遗传率估计值在不同研究和种群中差异很大，从极低（0.02）到极高（0.97）不等（Acharya等人，2020年；He等人，2022年）。调整pH条件下的AY遗传率高于低pH条件，但在各条件之间相当。这可能是由于调整pH条件下的产量变化较大，从而可以将更多变异归因于基因型。该种群中AY和ASAI的高遗传率可能是因为进行了广泛的表型分析，按月平均或汇总产量得到3302个数据点来描述138个基因型。这些大量的数据减少了表型分析的误差，并有助于准确评估每个基因型，尽管存在显著的环境和G × E效应。

**4.3 低pH值和铝胁迫对FDR和持久性的影响**

在低pH土壤胁迫下，FDR的平均值和标准差显著降低。这表明低pH值和铝胁迫扰乱了休眠时间，导致植物在季节早期进入休眠状态。这对苜蓿种植可能有利，因为它使植物能够在根系中保留能量储备，以适应春季更理想的生长条件。先前的研究表明，在温和气候条件下，如澳大利亚（Pembleton & Sathish, 2014）和中国（Wang et al., 2009），休眠品种在干旱条件下的表现更好。在北美也发现，由于“干旱诱导的休眠作用”，紫花苜蓿具有极强的耐旱性，这种休眠特性使植物能够在胁迫期间保存根部碳水化合物，并在胁迫缓解后恢复生长（Orloff et al., 2014, 2005）。在低pH条件下观察到的休眠抑制可能是一种适应性反应，表明其对低pH和铝土矿胁迫具有较高的耐受性。由于用于休眠性检测的对照品种并未在低pH的田间环境中种植，因此低pH条件下的FDR（休眠抑制程度）并不能准确反映真正的休眠评级，而只是一个有趣的观察结果，揭示了紫花苜蓿对低pH田间胁迫的生理响应。在低pH胁迫下，FDR分布的压缩现象与AY组的数据趋势一致。尽管之前尚未研究非生物胁迫对紫花苜蓿秋季休眠时期的影响，但已有研究表明，非生物胁迫会降低其他作物的数量性状表型变异，例如在干旱胁迫下的玉米（Cerrudo et al., 2018）和水稻（Venkateshwarlu et al., 2022）的产量。调整pH后的FDR平均值略低于预期，为4.38，最小值为1.02，最大值为9.34。这可能部分是由于用于休眠性检测的对照品种是在不同气候条件下培育的（Teuber et al., 1998），或者是因为数据收集时温度已经下降到足以观察到生长减缓的程度。例如，对照品种Bulldog505（ Entry 133）的FDR平均值为2.77，而其已知的休眠评级为5；对照品种Bulldog805（Entry 132）的FDR平均值为5.62，其已知的休眠评级为8。鉴于这种降低，选择具有稳定高ASAI（酸敏感性指数）和FDR>4的个体可以确保我们保留了半休眠性和非休眠性的耐酸基因型。进入下一轮选育的候选品种将接受进一步的FDR特性评估。总体而言，FDR与DMI（生长天数）之间存在轻微的正相关（r = 0.261）。在高度稳定的耐受性基因型中，FDR与DMI的相关性更强（r = 0.413），但这可能是由于16个基因型的数据集比所有138个基因型中的噪声更少。无论如何，FDR是在美国东南部及亚热带地区培育品种时需要考虑的一个重要性状，因为在温暖的气候下，非休眠性品种一年可以收获多达10次，从而提高干草/青贮饲料的产量或实现近乎全年放牧（Acharya et al., 2020）。在低pH和调整pH条件下，品种的持久性没有显著差异。尽管不同条件下的平均每株植物数量存在统计学上的显著差异，但平均差异小于0.5株，且低pH条件略微占优势。在不同环境中，这种差异仅在2024年的Athens和Tifton显著，其中调整pH组在Athens经过4年后占据优势，在Tifton经过2年后占据优势。每株植物的平均数量是进行线性混合模型分析时减少残差误差的重要因素，但这种差异似乎不足以具有生物学意义，这可能是由于研究时间较短。由于紫花苜蓿的生长周期可长达10年以上，因此酸性和铝胁迫可能需要更长时间才能显著降低其持久性。这一点从Athens低pH条件下的死亡率增加可以得到验证（尽管增幅较小，见表6）。然而，这些结果与之前的研究结果相反，那些研究发现在低pH和高铝条件下紫花苜蓿的存活率显著下降（Liatukiene et al., 2020; Wolf et al., 1994）。尽管努力选择了相似的田间地点，但本研究的持久性可能受到了其他土壤特性的影响，如土壤质地、持水能力、阳离子交换能力和肥力。在另一种对铝敏感的豆科植物——大豆中的研究表明，即使在轻微的胁迫水平（<100 mg kg?1）下，其表现也会提升（X.-B. Zhang et al., 2007）。可能土壤中的otoxicity（毒性）水平低于导致紫花苜蓿死亡率增加的阈值。这凸显了评估铝耐受性的复杂性，基因型与微环境之间的复杂相互作用可能会显著影响表型。需要进一步研究以确定长期不同胁迫水平下酸性土壤胁迫对存活率的影响。

4.4 选育意义

本研究的目的是培育出高产、耐低pH和铝的品种，以适应美国东南部的生产条件。多年多地点、分条件进行的田间表型筛选工作在筛选紫花苜蓿的耐低pH和铝能力方面非常有效。与以往使用温室（Dall'Agnol et al., 1996; Khu et al., 2010; Sledge et al., 2002）或实验室检测（Barone et al., 2008; Parrott & Bouton, 1990; Rosellini et al., 2002; Tesfaye et al., 2001）的方法相比，这种方法更加耗时耗力，但它能够筛选出重要的农艺性状，如DMI和FDR，以及铝耐受性。在目标环境中进行选择有助于确保这些选育周期能够有效转化为改进品种的开发。本研究中收集的大量数据提高了表型准确性，并应在下一轮选育中带来更好的遗传增益。通过实验室检测和温室筛选培育出的基因型在田间表现出色不佳，进一步强调了田间表型筛选的价值（见表S2）。使用ASAI作为筛选标准可以确保选出的品种在低pH和调整pH条件下都能获得高产量。仅选择在各种环境中都具有高ASAI值且FDR适合美国东南部条件的基因型（半休眠性：5–7；非休眠性：8–11），可以最大化这一轮选育的遗传增益。这进一步强调了在田间环境中直接进行表型筛选的好处，因为否则FDR无法可靠估算，而FDR是品种开发中的关键因素。目前的研究最终确定了56个对酸性土壤具有改进耐受性的紫花苜蓿基因型，其中21个基因型的表现优于最佳商业品种（见表S2）。需要进一步的工作来确定紫花苜蓿耐低pH和铝的具体遗传和生理机制。尽管如此，这项研究强调了在广泛田间环境中进行表型筛选的重要性，并为培育适应美国东南部的耐酸品种迈出了重要一步。

作者贡献：

Holly Wright Presley：数据管理；正式分析；研究方法；数据可视化；初稿撰写；审稿和编辑。
Ali Missaoui：概念构思；资金获取；资源配置；监督；审稿和编辑。

致谢

作者感谢UGA牧草育种团队为这项研究收集表型数据所付出的努力。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。