稀土上转换发光介质介导线粒体内源性钙超载诱导的焦亡，用于肿瘤免疫治疗

《Journal of Rare Earths》：Rare-earth upconversion luminescence mediate mitochondrial endogenous calcium overload-induced pyroptosis for tumor immunotherapy

　　

刘书宇|杜鹏业|郑建浩|雷鹏鹏|张宏杰

中国科学院长春应用化学研究所稀土资源利用国家重点实验室，中国长春130022

摘要

线粒体Ca²⁺过载是一种诱导焦亡的有前景的策略。然而，由于机体的稳态调节特性和肿瘤的酸性微环境，外源性引入Ca²⁺调节的方式往往效率低下。在这里，我们通过控制细胞外Ca²⁺的流入和内质网（ER）中的Ca²⁺泄漏，实现了有效的线粒体内源性Ca²⁺过载，从而诱导焦亡。具体来说，一方面，近红外照射下上转换纳米颗粒产生的单线态氧会刺激细胞膜表面的TRPV1通道打开，使Ca²⁺流入；另一方面，放线菌素D会打开ER上的Ryanodine受体通道，导致Ca²⁺泄漏。在细胞外Ca²⁺流入和ER Ca²⁺泄漏的双重作用下，细胞质中Ca²⁺浓度的增加进一步引发线粒体中的Ca²⁺过载，通过caspase 1/gasdermin D依赖的途径触发焦亡。重要的是，焦亡的发生会引发强烈的免疫反应，最终不仅能够有效治疗肿瘤，还能抑制肺转移。

引言

焦亡是一种新兴的程序性细胞死亡模式。[1], [2], [3] 一类被称为gasdermin的蛋白质因具有潜在的膜穿孔活性而在细胞死亡中起着重要作用。[4] 在经典的焦亡途径中，激活的caspase 1切割gasdermin D（GSDMD）蛋白，产生gasdermin-N（N-GSDMD）结构域。生成的N-GSDMD结构域与膜磷脂结合，导致细胞膜穿孔，从而引起细胞肿胀并形成大的气泡。这一过程进一步导致膜破裂，并释放大量细胞内容物（如乳酸脱氢酶（LDH）和炎症因子（如白细胞介素-1β（IL-1β））[5], [6], [7]。迄今为止报道的多种诱导焦亡的策略中，离子调节显示出巨大潜力。[8] 许多离子，如K⁺、Al³⁺、Zn²⁺和Ca²⁺，已被证明可以触发焦亡，释放出一系列细胞内容物，激活机体的免疫反应。[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15] 鉴于此，全面探索离子调节的治疗潜力至关重要。

Ca²⁺是参与细胞多种生理过程的第二信使。[16] 线粒体作为细胞钙信号传导的关键解码器，通过低亲和力的线粒体钙转运蛋白（MCU）复合体，特异性响应由内质网或质膜通道打开产生的局部高浓度钙微域。这种独特的敏感性使线粒体能够快速吸收钙离子，并及时调节核心功能，包括能量代谢和细胞死亡信号通路。[17], [18], [19] Ca²⁺浓度的轻微扰动就可能严重影响线粒体的正常功能。通常，线粒体内的游离Ca²⁺和结合Ca²⁺之间存在动态平衡。当细胞内Ca²⁺浓度升高时，线粒体内的Ca²⁺动态平衡被打破。严重的Ca²⁺过载会破坏线粒体，进一步激活caspase 1，从而触发肿瘤细胞发生焦亡，释放一系列细胞内容物，进而引发一系列免疫反应。[20], [21], [22]

目前，实现Ca²⁺过载的策略主要集中在引入外源性Ca²⁺来源，以增加肿瘤细胞内的钙水平，从而达到治疗目的。[23] 然而，传统的钙引入机制，如CaO₂和CaCO₃，在肿瘤细胞外的酸性微环境中会有一定程度的降解。[24], [25], [26], [27] 即使少量外源性钙进入肿瘤细胞，由于内质网（ER）的缓冲作用以及许多跨膜Ca²⁺转运蛋白/泵的存在（如瞬态受体电位（TRP）通道[28]和电压门控Ca²⁺通道[VGCC][29]，也很难打破肿瘤细胞的细胞内Ca²⁺稳态。[30] 因此，调节肿瘤自身携带的内源性Ca²⁺来源可能是一个更好的选择。ER是一种在细胞中储存Ca²⁺并维持细胞内Ca²⁺稳态的细胞器。[31], [32] Ryanodine受体通道（RYR）位于ER膜表面，在某些刺激下可以打开，释放ER中的Ca²⁺，使肿瘤细胞内的Ca²⁺浓度上升。[33] 然而，由于肿瘤细胞内环境的稳态限制，ER中Ca²⁺泄漏引起的Ca²⁺扰动效果有限。相关研究表明，肿瘤细胞外的Ca²⁺浓度大约是细胞内的1000倍。[34], [35], [36] 将细胞外的Ca²⁺引入细胞是一种实现线粒体Ca²⁺过载的好方法。细胞表面的Ca²⁺转运蛋白TRPV1在单线态氧（¹O₂）的刺激下可以打开，允许Ca²⁺从外部流入细胞。[37], [38], [39] 因此，巧妙结合细胞外Ca²⁺流入和ER Ca²⁺泄漏是一种有效诱导线粒体内源性Ca²⁺过载的有前景的策略。

在这项研究中，我们提出通过上转换发光（UCL）介导的线粒体内源性Ca²⁺过载来诱导焦亡并激活免疫功能，从而抑制肿瘤和肺转移。选择中空NaBiF₄: Yb, Er上转换纳米颗粒（UCNPs）作为光转换平台，因为它们具有独特的光学性质和高比表面积。[40] 然后将放线菌素D（TM）和Merocyanin 540（MC540）负载到UCNPs上，并用1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷乙醇胺（DSPE-mPEG）进行修饰，使其具有生物相容性（UMTP）。UMTP的抗肿瘤机制如图1所示。一方面，UMTP在近红外（NIR）照射下产生的¹O₂刺激细胞膜上的TRPV1通道打开，使Ca²⁺流入肿瘤细胞外部；另一方面，TM打开ER表面的RYR通道，使ER中的Ca²⁺泄漏到细胞质中。在细胞外Ca²⁺流入和ER Ca²⁺泄漏的双重作用下，细胞质中Ca²⁺浓度的增加进一步引发线粒体中的Ca²⁺过载，最终通过caspase 1/gasdermin D（GSDMD）依赖的途径触发焦亡。在焦亡过程中，细胞形成大的液泡并释放大量炎症分子和细胞内容物，从而引发免疫反应，有效抑制肿瘤增殖和肺转移。

部分片段

化学物质和材料

NH₄F（99.99%）、聚丙烯酸（PAA）（分子量1800 g/mol）、NaNO₃（99.0%）、Bi(NO₃)₃·5H₂O（98.0%）、放线菌素D（TM）和Ln(NO₃)₃·5H₂O（99.9%，Ln = Er, Yb）购买自Aladdin。荧光素5-异硫氰酸酯（FITC，HPLC ≥90%）购买自Solarbio。己烷（≥97%）和乙二醇（EG，≥99%）购买自Xilong Scientific。Merocyanin 540（MC540）购买自MedChemExpress。DSPE-mPEG购买自Ruixi Biological Technology（西安，中国）。CCK-8测定试剂盒、ROS

制备和表征

UMTP的合成过程如图1(a)所示。透射电子显微镜（TEM）观察到UMTP具有中空结构（图1(b–d)）。高分辨率TEM分析显示UMTP的条纹间距为0.308 nm，对应于NaBiF₄的101晶面（图1(e)）。元素映射图像证实了材料的多晶性质

结论

总之，使用UMTP调节线粒体内的内源性Ca²⁺过载可以诱导焦亡。它充分利用了肿瘤自身携带的Ca²⁺，并结合了细胞外Ca²⁺的流入和ER中的Ca²⁺泄漏，从而引发线粒体Ca²⁺过载，最终触发肿瘤细胞焦亡。此外，焦亡的发生会引发强烈的免疫反应，不仅能够有效治疗肿瘤，还能抑制肺转移。

利益冲突

作者声明没有竞争性财务利益。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可根据合理请求向相应作者获取。

资助项目

该项目得到了中国国家自然科学基金（52371254）、吉林省科技发展计划（20260101028JJ）和中国国家自然科学基金基础科学中心项目（22388101）的支持。

利益冲突声明

声明作者没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。