基于扩展π共轭桥策略增强斯托克斯位移及多模态成像引导I/II型光动力疗法与光热疗法协同治疗

《Aggregate》：Extended π-Conjugated Bridge Strategy for an Enhanced Stokes Shift and Multimodal Imaging-Guided Type I/II Photodynamic Therapy Integrated With Photothermal Therapy

　　

光诊疗（Phototheranostics）是实现恶性肿瘤同步诊断与治疗的关键模式，因此开发高性能光诊疗剂变得日益重要。在本研究中，研究人员通过扩展电子π桥策略，合成了一种具有聚集诱导发光（AIE, Aggregation-Induced Emission）特性的“千刃一体”光诊疗纳米平台（TDTIC-M），旨在增强斯托克斯位移，并实现多模态成像引导的I/II型光动力疗法与光热疗法（PDT-PTT, Photodynamic Therapy-Photothermal Therapy）协同光疗，用于治疗乳腺癌。具体而言，通过克脑文格尔缩合反应制备了具有给体-受体扭曲构型的目标化合物（TIC-M、TTIC-M和TDTIC-M）。其中，引入两个噻吩单元作为π桥的TDTIC-M衍生物，相对于TIC-M和TTIC-M展现出增强的光学特性。该衍生物进一步被DSPE-PEG2000封装，形成具有良好生物相容性的TDTIC-M纳米颗粒（NPs, Nanoparticles）。此类纳米颗粒表现出大的斯托克斯位移（~270 nm）、强大的活性氧生成能力（1O2、·OH和·O2?）以及显著的光热转换效率（27.93%）。此外，TDTIC-M纳米颗粒在体外展现出精确的溶酶体靶向能力和优异的光疗效果，并能有效调节凋亡相关蛋白（Caspase3、Bax和Bcl-2）的表达。更重要的是，通过整合I/II型PDT与PTT，TDTIC-M纳米颗粒展现出卓越的多模态成像效果和协同光疗效果。因此，TDTIC-M有望成为一种用于多模态成像引导癌症光疗的极具前景的光诊疗候选材料。

研究背景与现状

癌症治疗领域中，光诊疗作为一种能够实现实时诊断与原位治疗相结合的新兴策略，因其非侵入性、副作用小、高效及选择性高等优点受到广泛关注。其核心组成部分光诊疗剂，需兼具成像与治疗功能。然而，传统光诊疗材料（如BODIPY、ICG等）在高浓度或聚集状态下，常因分子间π-π堆积导致聚集导致淬灭（ACQ, Aggregation-Caused Quenching）效应，严重影响其诊疗效果。相比之下，聚集诱导发光（AIE）材料在聚集状态下荧光增强，为解决ACQ问题提供了新思路。尽管如此，开发集多模态成像（如荧光成像FLI、光声成像PAI、光热成像PTI）与协同治疗（I/II型PDT和PTT）于一体的多功能AIE光诊疗纳米平台仍面临巨大挑战，主要因为上述功能在能量耗散途径上存在竞争关系。

研究动机与目标

为克服上述挑战，本研究旨在开发一种“一体化”的光诊疗纳米平台。具体目标是通过扩展π共轭桥的分子设计策略，构建具有AIE特性的分子，并将其制备成纳米颗粒，以期同时实现：1）大的斯托克斯位移以减少自体荧光干扰；2）高效的I/II型活性氧（ROS, Reactive Oxygen Species）生成以克服肿瘤缺氧环境；3）高的光热转换效率；4）多模态成像引导能力；5）对特定细胞器（如溶酶体）的靶向功能。该研究期望为开发新型高性能光诊疗剂提供有效策略，论文最终发表在期刊《Aggregate》上。

关键技术与方法概述

为开展研究，研究人员采用了以下关键方法：首先，通过克脑文格尔缩合反应，以三苯胺衍生物为电子给体（D, Donor）、2-(6-甲基-3-氧代-2,3-二氢-1H-茚-1-亚基)丙二腈为电子受体（A, Acceptor），并以噻吩为π桥，合成了目标化合物TIC-M、TTIC-M和TDTIC-M。其次，利用密度泛函理论（DFT, Density Functional Theory）和含时密度泛函理论（TD-DFT, Time-Dependent DFT）计算，从理论上评估和筛选了最优分子TDTIC-M。接着，采用简单的薄膜水化法，将TDTIC-M与两亲性聚合物DSPE-PEG₂₀₀₀共组装，制备了TDTIC-M纳米颗粒，并对其形貌、尺寸、光学性质及稳定性进行了表征。随后，通过电子顺磁共振（EPR, Electron Paramagnetic Resonance）、化学探针（如DCFH-DA、ABDA、HPF、DHR123）及红外热成像等技术，系统评估了纳米颗粒的ROS（包括¹O₂、·OH、·O₂^?）生成能力和光热性能。在细胞实验中，使用MDA-MB-231、MCF-7等多种细胞系（样本来自商业细胞库）评估了纳米颗粒的生物相容性、摄取、亚细胞定位及体外光疗效果，并通过CCK-8、流式细胞术、蛋白免疫印迹（Western Blot）和活/死细胞染色进行分析。在动物实验中，建立了MDA-MB-231乳腺癌荷瘤裸鼠模型（动物来源：江苏集萃药康生物科技有限公司），通过静脉注射给药，利用小动物活体成像系统、光声成像系统和红外热像仪，评估了纳米颗粒的体内分布、多模态成像（NIR-I/II荧光成像、光声成像、光热成像）及协同治疗（I/II型PDT-PTT）效果，并通过监测肿瘤体积、体重及组织病理学（H&E染色）分析治疗安全性与有效性。

研究结果

2.1 TIC-M、TTIC-M和TDTIC-M的设计、合成与表征

研究人员设计并合成了三种具有D-π-A扭曲构型的AIE分子。理论计算（DFT/TD-DFT）表明，随着π桥（噻吩单元）的延长，TDTIC-M的最高占据分子轨道（HOMO, Highest Occupied Molecular Orbital）与最低未占分子轨道（LUMO, Lowest Unoccupied Molecular Orbital）的分离程度增大，能隙（ΔE）和单重态-三重态能隙（ΔE_ST）减小（TDTIC-M的ΔE_ST为0.081 eV），这有利于促进系间窜越（ISC, Intersystem Crossing）和ROS生成。光谱表征显示，TDTIC-M在二氯甲烷中的吸收和发射峰分别位于约600 nm和870 nm，具有约270 nm的大斯托克斯位移，且具有AIE特性。将TDTIC-M封装入DSPE-PEG₂₀₀₀形成的纳米颗粒（TDTIC-M NPs）在水相中分散均匀，动态光散射（DLS, Dynamic Light Scattering）测得其水合直径约为105 nm，透射电镜（TEM, Transmission Electron Microscopy）显示尺寸约60 nm，且在多种介质中（PBS、DMEM、FBS）储存14天保持稳定。

2.2 ROS生成能力与光热转换评估

EPR和化学探针实验证实，TDTIC-M NPs在光照下可产生多种ROS，包括用于II型PDT的单线态氧（¹O₂）以及用于I型PDT的羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（·O₂^?），其¹O₂量子产率高达78%。光热性能测试表明，在635 nm激光（800 mW/cm²）照射下，TDTIC-M NPs（10 μM）溶液温度可在300秒内从23°C升至78°C，光热转换效率计算为27.93%，且经过五个加热-冷却循环后性能稳定。细胞毒性实验显示，在浓度高达160 μM时，TDTIC-M NPs对多种正常细胞和肿瘤细胞均未表现出明显毒性，生物相容性良好。共聚焦显微镜成像显示，TDTIC-M NPs可被MDA-MB-231细胞有效摄取，并与溶酶体探针（LysoTracker Green）有高达0.85的共定位系数，表明其具有溶酶体靶向能力。细胞代谢实验表明，纳米颗粒可在传代培养过程中被有效清除。

2.3 TDTIC-M NPs的体外光疗效果评估

CCK-8实验表明，经TDTIC-M NPs处理并光照后，MDA-MB-231细胞存活率显著下降至18%，抑制率高达82%。活/死细胞（Calcein-AM/PI）染色显示，光照后出现大量PI染色的死亡细胞（红色荧光）。流式细胞术分析进一步证实，经NPs处理并光照后，细胞凋亡率超过90%。蛋白免疫印迹结果表明，光照条件下，TDTIC-M NPs可上调促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

2.4 TDTIC-M NPs的体内成像与治疗

在MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型中，静脉注射TDTIC-M NPs后，实现了高分辨率的近红外I区/II区（NIR-I/II）荧光成像、光声成像和光热成像。荧光和光声信号在肿瘤部位特异性富集，并随时间代谢而减弱，体现了良好的肿瘤靶向性。光热成像显示，在激光照射下，肿瘤局部温度可在3分钟内从约35°C升至超过50°C。体内治疗实验将小鼠分为四组：生理盐水组、生理盐水+激光组、TDTIC-M NPs组、TDTIC-M NPs+激光组。经过四个周期的治疗后，TDTIC-M NPs+激光组的肿瘤体积得到显著抑制，并观察到结痂。而小鼠体重在治疗期间无显著变化，主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色切片也未发现明显病理损伤，表明TDTIC-M NPs具有良好的体内生物安全性。

总结与讨论

本研究成功开发了一种基于扩展π共轭桥策略、具有AIE特性的多功能光诊疗纳米平台TDTIC-M。理论计算与实验表征共同验证了该设计策略的有效性：扩展π桥增强了分子内电荷转移，减小了ΔE_ST，从而协同提升了ROS生成（兼具I/II型PDT能力）和光热转换性能。所制备的TDTIC-M NPs具备尺寸均一、稳定性好、生物相容性高、溶酶体靶向、大斯托克斯位移等优点。体外和体内实验系统证明了其卓越的多模态成像（NIR-I/II FLI、PAI、PTI）能力和高效的I/II型PDT-PTT协同治疗功效，且对正常组织无明显毒性。该工作为开发新型AIE基多功能光诊疗系统提供了有效的分子设计策略和纳米平台构建方案。

研究结论翻译

总之，研究人员通过扩展π桥策略开发了一种具有AIE特性的多功能光诊疗系统（TDTIC-M），用于缺氧性三阴性乳腺癌的高效光诊疗。该系统整合了亚细胞靶向、近红外I/II区荧光成像、光声成像、光热成像以及多模态成像引导的协同I/II型光动力-光热疗法。具体而言，目标化合物通过克脑文格尔缩合反应合成，表现出独特的D-π-A扭曲构型和AIE特性。DFT理论计算表明，以两个噻吩单元为π桥的TDTIC-M，与TIC-M和TTIC-M相比，具有更小的ΔE和ΔE_ST值，该分子设计也实现了长发射波长和大斯托克斯位移。优化后的TDTIC-M发光体与DSPE-PEG2000组装形成TDTIC-M NPs。这些纳米颗粒尺寸小且均匀，具有良好的生物相容性和光稳定性，以及高的ROS生成产率（包括¹O₂、·OH和·O₂^?）和优异的光热转换效率。体外结果表明，TDTIC-M NPs在低浓度下无细胞毒性，具有清晰的荧光成像性能、特异靶向亚细胞细胞器的能力以及良好的抗肿瘤能力。此外，此类纳米颗粒在光照条件下促进Caspase-3和Bax的表达，同时有效抑制Bcl-2。体内实验表明，TDTIC-M NPs可提供高分辨率的NIR I/II荧光成像、光声成像和光热成像。值得注意的是，这些纳米颗粒在激光照射下展现出优异的协同I/II型PDT-PTT效果，且未引起明显的全身毒性。基于这些结果，优化后的TDTIC-M代表了一种用于缺氧性三阴性乳腺癌诊断成像和静脉注射治疗的有前景的光诊疗剂，为开发新型AIE基多模态光诊疗系统提供了有效策略。