《Aging Cell》：Targeting Hyperoxia-Induced Cellular Senescence in Developing Human Airway Cells: Senomorphics Versus Senolytics Versus Antioxidants
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Supplemental oxygen (hyperoxia), often provided to premature infants, can disrupt lung growth and contribute to development of neo
Supplemental oxygen (hyperoxia), often provided to premature infants, can disrupt lung growth and contribute to development of neonatal and pediatric lung diseases, necessitating understanding of underlying mechanisms. Researchers previously showed that even moderate hyperoxia (<?60% O2) induces detrimental cellular senescence in 18–22?weeks human fetal airway smooth muscle (fASM), a key cell type in airway contractility and remodeling. In this study, researchers examined the ability of senotherapeutics Fucoidan and Dasatinib (D)?+?Quercetin (Q) (D?+?Q) to mitigate adverse effects of hyperoxia and assessed the preventive effect of mitochondrial antioxidants (MitoQ). fASM cells exposed to normoxia (21% O2) or hyperoxia (50% O2) were treated with Fucoidan [100?μg/mL], D?+?Q [250?nM?+?375?nM] or MitoQ [100?nM] and assessed for senescence markers, senescence-associated secretory profile (SASP), extracellular matrix (ECM) deposition, and cell viability. Results showed that moderate hyperoxia increases senescence markers and SASP. Fucoidan decreased p21 expression and inhibited SASP release without inducing cell death, while D?+?Q decreased β-galactosidase (β-Gal) activity, p21 and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) expression, and caused cell death without affecting SASP in hyperoxia-induced senescent fASM. MitoQ prevented increases in senescence markers and SASP in hyperoxia-exposed fASM. These findings demonstrate distinct and viable strategies to counter hyperoxia-induced fASM senescence. Fucoidan (senomorphic), D?+?Q (senolytic), and MitoQ (prophylactic antioxidant) represent promising, mechanistically different approaches to alleviate detrimental effects of moderate hyperoxia in developing airways towards limiting perinatal lung disease.
这篇发表于《Aging Cell》的研究论文聚焦于早产婴儿常需接受的 supplemental oxygen（高氧，hyperoxia）治疗对发育中肺部的潜在危害。尽管临床实践已转向使用中度高氧（<?60% O2）以降低支气管肺发育不良（BPD）的风险，但这仍与后续的支气管疾病风险增加有关。此前研究已表明，中度高氧可在人类胎儿气道平滑肌（fASM）细胞中诱导有害的细胞衰老，而 fASM 作为气道收缩性和重塑的关键细胞类型，其衰老可能通过分泌衰老相关分泌表型（SASP）促进炎症和纤维化。然而，针对高氧诱导的 fASM 衰老的具体干预策略及其机制尚不明确。为此，研究人员开展了此项研究，旨在评估 senotherapeutic（衰老疗法）药物 Fucoidan、Dasatinib (D) + Quercetin (Q) (D + Q) 以及线粒体靶向抗氧化剂 MitoQ 对高氧诱导的 fASM 衰老的缓解或预防作用，并探讨其潜在机制。
为实现上述目标，研究人员采用了多项关键技术方法。首先，从 18–22 周孕龄的胎儿肺组织中分离并培养原代 fASM 细胞，并通过平滑肌肌球蛋白等标志物验证其表型。其次，建立了体外高氧暴露模型，将细胞暴露于 50% O2（高氧）或 21% O2（常氧）环境中 7 天以诱导衰老。随后，分别应用 Fucoidan（100 μg/mL）、D + Q（250 nM + 375 nM）进行治疗，或使用 MitoQ（100 nM）进行预防性处理。在检测手段方面，研究人员运用了多种方法：利用 CellEvent Senescence Green Detection Kit 检测 β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性；通过 ProteinSimple JESS 毛细管电泳系统定量分析 p21、PAI-1 等衰老标志物蛋白表达；采用 Luminex xMAP 多重细胞因子检测技术分析细胞上清液中的 SASP 因子谱；利用 Crystal Violet 染色评估细胞活力；通过基质金属蛋白酶（MMP）2 和 9 等的表达分析细胞外基质（ECM）沉积情况；最重要的是，研究采用了质谱流式细胞术（CyTOF）结合 t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) 和 Flow Self-Organizing Map (FlowSOM) 算法进行单细胞水平的蛋白质谱分析，构建了包含 p16、p21、Ki67 及多种 SASP 因子的抗体 panel，以精准鉴定和分群衰老细胞。
研究结果部分详细阐述了各项发现：
1. 高氧增加 fASM 的 β-Gal 活性
研究人员通过时间序列分析发现，与常氧组相比，暴露于 50% O2高氧环境的 fASM 细胞从第 3 天到第 8 天，其 β-Gal 活性显著增加，证实了高氧诱导了细胞衰老表型。
2. 高氧增加 ECM 沉积
ECM 沉积实验显示，高氧处理的细胞相较于常氧细胞，增加了胶原蛋白 I（COL1）和纤维连接蛋白（FN1）的沉积，而未改变胶原蛋白 III（COL3）的沉积，表明高氧诱导的衰老 fASM 具有促纤维化潜能。
3. Fucoidan 和 D + Q 处理对衰老标志物的影响
通过 JESS 和 β-Gal 活性检测发现，Fucoidan 降低了高氧暴露细胞中 p21 的表达，并在常氧细胞中降低了 β-Gal 活性，但对高氧细胞的 β-Gal 活性无影响。相比之下，D + Q 处理则显著降低了高氧暴露 fASM 中 p21、PAI-1 的表达水平以及 β-Gal 活性。值得注意的是，D + Q 在降低衰老标志物的同时，也导致了细胞数量的减少。
4. 高氧诱导的衰老 fASM 分泌更高水平的 SASP 蛋白
利用 96-Plex 细胞因子芯片分析发现，高氧暴露的 fASM 上清液中，有 62 种蛋白质的水平显著高于常氧组，其中包括多种促炎因子和趋化因子，证实高氧诱导了强烈的 SASP 分泌。
5. Fucoidan 抑制高氧诱导的衰老 fASM 的 SASP 分泌，而 D + Q 则不能
细胞活力测定（Crystal Violet）显示，Fucoidan 处理未引起细胞死亡，而 D + Q 处理则显著减少了细胞数量，且在常氧细胞中效果更强。进一步的 SASP 分析表明，Fucoidan 能够显著降低高氧诱导的衰老细胞中 CXCL9、IL1RA 等特定 SASP 因子的分泌。然而，D + Q 处理虽然清除了部分衰老细胞，却未能降低高氧增加的 SASP 蛋白水平。
6. 高氧增加一种可被抗氧化剂 MitoQ 抑制的衰老 fASM 细胞簇
CyTOF 单细胞分析是本研究的一大亮点。研究人员通过构建包含 14 种抗体的 panel 进行单细胞蛋白谱分析，并利用 t-SNE 和 FlowSOM 聚类，鉴定出一个特定的细胞簇（Cluster 6）。该簇细胞高表达 p16、p21、p53、磷酸化 NF-κB (p-NF-κB) p65 及多种 SASP 因子（如 CXCL1、IL-1α、MMP9），同时低表达增殖标志物 Ki67，被明确鉴定为高氧诱导的衰老 fASM 细胞。研究发现，高氧暴露显著增加了这一衰老细胞簇的比例，而预防性给予 MitoQ 则能有效抑制该衰老细胞簇的增加，并降低 MMP2 和 MMP9 的表达水平。
在讨论与结论部分，研究人员指出，本研究首次在发育中的气道细胞中，通过单细胞水平证实了中度高氧可诱导产生一个独特的、高表达多种衰老标志物和 SASP 因子的 fASM 细胞亚群（Cluster 6），并阐明了三种不同干预策略的独特作用机制。Fucoidan 作为一种 senomorphic（衰老形态调节剂），主要通过抑制 SASP 的释放发挥其抗炎作用，且不诱导细胞死亡，其作用可能与抑制 NF-κB 和 MAPKs 信号通路有关。D + Q 作为经典的 senolytic（衰老细胞清除剂），能够有效清除高氧诱导的衰老 fASM 细胞，降低 p21 和 PAI-1 等标志物，但令人意外的是，它并未能降低 SASP 水平，且对常氧细胞也表现出一定的细胞毒性，这提示在临床应用中需谨慎考虑剂量和时机。MitoQ 作为一种预防性线粒体抗氧化剂，则从源头上抑制了高氧诱导的线粒体 ROS 产生，从而有效阻止了衰老标志物、SASP 以及特定衰老细胞簇（Cluster 6）的形成。
综上所述，这项研究揭示了中度高氧诱导的 fASM 细胞衰老是一个可药物干预的靶点，并明确了三种机制迥异的有效策略：Fucoidan（Senomorphic）、D + Q（Senolytic）和 MitoQ（预防性抗氧化剂）。这些发现为未来开发针对早产儿高氧性肺损伤的治疗策略奠定了重要的临床前基础，强调了在针对发育中肺脏进行抗衰老治疗时，需要精确区分并靶向有害的衰老细胞，同时保留其在组织发育中可能具有的有益作用。
