基于免疫信息学的淋病奈瑟菌保守铜相关蛋白多表位疫苗设计

《Biotechnology and Applied Biochemistry》：Immunoinformatics-Based Design of a Multi-Epitope Vaccine Targeting a Conserved Copper–Associated Protein in Neisseria gonorrhoeae

　　

： 淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）由于快速增长的抗菌素耐药性和缺乏有效疫苗，构成了一个紧迫的公共卫生挑战。靶向参与基本生理过程的保守细菌通路，可能为疫苗抗原发现提供新机会。本研究应用了一个基于免疫信息学的流程，探索一种保守的铜相关蛋白作为多表位疫苗设计的潜在抗原来源。通过对396个临床基因组的分析，证实了高通量组装质量，并通过全蛋白质组范围筛选金属结合特征，鉴定出一个高度保守的假设蛋白（AKOBGLPP_01618）。该候选蛋白表现出强烈的预测抗原性、在分离株中的高流行率（99.5%）以及与人类蛋白质无检测到的同源性。计算机分析基于预测的金属配位残基和保守的基因组背景，提示了潜在的铜结合特征。表位图谱分析鉴定出富含B细胞表位的区域，这些区域被精炼为保守的、表面可及的肽段。预测的细胞毒性T细胞和辅助性T细胞表位在纳入多表位构建体之前，经过了免疫原性、安全性和菌株保守性的筛选。最终构建体包含一个靶向TLR4的佐剂和经过加工优化的连接肽。由此产生的155个氨基酸的构建体表现出良好的理化特性、预测的溶解度以及估计的全球人群覆盖率为74.84%。对接分析表明，在多个预测构象中，该构建体与TLR4/MD-2复合物具有一致的相互作用倾向。尽管这些发现为所提出的构建体提供了初步的计算支持，但仍需实验验证来确认抗原功能、免疫原性和受体结合。总之，本研究将一种保守的铜相关蛋白鉴定为潜在的抗原来源，并提出了一种探索针对淋病奈瑟菌的疫苗候选者的计算框架。

研究背景、问题与目的

淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）是淋病的病原体，被世界卫生组织列为重点病原体。由于抗菌素耐药性的快速出现，其治疗日益受到威胁，且目前尚无许可上市的疫苗。传统疫苗策略面临主要障碍，因为该病原体表面结构（如菌毛和不透明蛋白）具有广泛的抗原变异以及利于免疫逃逸的相变机制。这促使淋病疫苗学范式转向靶向参与核心生理过程、不易发生变异的高度保守的必需抗原。其中，靶向细菌金属稳态机制是一个有前景的途径。铜是多种关键酶（如亚硝酸盐还原酶AniA和细胞色素c氧化酶）的必需辅助因子，但过量时毒性很强。因此，淋球菌进化出了精密的铜获取、运输、储存和外排系统以维持最佳的细胞内水平。在其他细菌中，铜储存蛋白家族可螯合过量的胞质铜，减轻毒性并为铜酶提供储备。在淋病奈瑟菌中，虽然典型的铜输出蛋白和伴侣蛋白已被表征，但一个专门的、保守的铜储存蛋白仍然难以捉摸，它代表了一个潜在的致命弱点——是应激反应通路中一个对在宿主环境（如富含铜的吞噬体）中生存至关重要的、保守的核心组分。靶向此类蛋白可以破坏基本的稳态过程，削弱细菌的适应性和毒力。反向疫苗学和免疫信息学的进步使得全基因组鉴定保守疫苗靶点成为可能。这些方法允许对病原体蛋白质组进行计算筛选，以识别抗原性蛋白并设计由选定的B细胞和T细胞表位组成的多表位疫苗。通过将免疫反应聚焦于保守且具有免疫原性的区域，同时排除非保护性序列，多表位疫苗具有多项优势，包括提高特异性、模块化设计以及适合快速开发。该策略特别适用于像淋病奈瑟菌这样定义保守保护性抗原具有挑战性的病原体。

为此，研究人员开展了本研究，旨在利用涵盖396个临床淋病奈瑟菌分离株的泛基因组方法，确保广泛的菌株代表性。他们采用了一个系统的计算流程：（i）在淋病奈瑟菌中鉴定一种新型、高度保守、推定具有铜结合能力的蛋白；（ii）全面绘制其免疫显性和保守的B细胞及T细胞表位；（iii）设计一个包含TLR4佐剂的新型多表位疫苗构建体并进行生物物理表征；（iv）进行计算机对接以评估其与人类TLR4/MD-2受体复合物相互作用的潜力。这项研究提供了一个经过计算评估的疫苗候选物，其靶向细菌的基本生存通路，为对抗耐药性淋病提供了有前景的新策略。

主要关键技术方法

研究人员利用了一个包含396个临床淋病奈瑟菌分离株基因组的队列。他们首先使用QUAST和BUSCO对基因组组装质量和基因空间完整性进行了评估。随后，选取高质量参考基因组（GCA_040404645.1; WHO_A_2024），使用Prokka进行功能注释。通过靶向的计算机挖掘策略，从注释中筛选出铜/金属稳态相关基因。为了发现新型候选铜结合蛋白，研究人员基于组氨酸和半胱氨酸残基的百分比，对参考蛋白质组进行了全蛋白质组范围的无偏筛选。候选蛋白的抗原性通过VaxiJen评估，亚细胞定位通过PSORTb预测。对首要候选蛋白AKOBGLPP_01618进行了泛基因组保守性分析、人源同源性筛查和金属结合位点预测。使用免疫信息学工具（如BepiPred、ElliPro、NetMHCpan、NetMHCIIpan）进行了线性B细胞表位富集区域鉴定、CTL和HTL表位预测，并对预测表位进行了免疫原性、过敏性、毒性和保守性过滤。全球人群覆盖率通过IEDB工具估算。多表位疫苗构建体被设计为由佐剂、连接肽和表位块组成的嵌合多肽，其理化性质、溶解度、三级结构和与TLR4/MD-2复合物的相互作用潜力分别通过ProtParam、Protein-Sol、AlphaFold/I-TASSER以及HADDOCK/ClusPro对接进行了计算评估。

研究结果

3.1 淋病奈瑟菌临床分离株基因组组装质量评估

对396个基因组进行的质量评估显示，基因组大小紧密聚集在2.15-2.30 Mb之间，大多数组装体（≥87%）被分解为1-3个重叠群，N50值较高。BUSCO分析显示平均完整单拷贝BUSCOs比例为98.7% ± 1.2%。这些结果表明基因组具有高度的连续性和完整性，为下游分析提供了可靠基础。

3.2 参考基因组的结构和功能注释

对参考基因组的注释产生了2321个预测的编码序列，其中38%被注释为假设蛋白，突出了功能基因组学的知识缺口。

3.3 铜和金属稳态决定因子的系统水平鉴定

通过关键词筛选，鉴定出了一个与铜处理、利用和金属离子生理相关的基因网络，包括两个P型ATP酶（CopA_1和CopA_2）、铜结合亚硝酸盐还原酶（AniA）、铜结合脂蛋白（NosL）、细胞色素c氧化酶亚基（CcoN1）以及多种金属蛋白酶和转运蛋白。

3.4 首要候选疫苗靶点的亚细胞定位和评估

对候选蛋白的亚细胞定位预测显示，首要候选蛋白AKOBGLPP_01618被高置信度地预测为胞质定位。尽管胞质定位可能限制抗体可及性，但胞内蛋白是T细胞表位的重要来源，适合用于诱导细胞免疫的疫苗策略。

3.5 首要候选蛋白的抗原性筛选

使用VaxiJen评估抗原性，假设蛋白AKOBGLPP_01618获得了最高的抗原性评分（0.7690），被分类为强抗原，因此被选为下游表位作图的初级候选蛋白。

3.6 首要疫苗候选蛋白的保守性和安全性分析

3.7 AKOBGLPP_01618的泛基因组保守性：BLASTp搜索显示，该候选基因存在于396个分离株中的394个（99.5%），平均蛋白质序列同一性为98.7% ± 1.1%，表明其高度保守。

3.9 安全性评估：缺乏人源同源性：对AKOBGLPP_01618全长序列及其最终选择的每个表位进行人源蛋白质组同源性筛查，未检测到显著同源性，表明自身免疫交叉反应风险低。

3.10 线性B细胞表位预测

对AKOBGLPP_01618的线性抗原景观分析鉴定出六个主要的B细胞表位富集区域。通过多步骤精炼流程（基于抗原性、表面可及性和保守性过滤），从这些区域中筛选出八个高优先级的15肽，作为后续MHC-II表位预测的输入。

3.11 表位预测与分析

CTL表位预测：使用NetMHCpan EL 4.1预测了针对主要HLA I类等位基因的CTL表位，鉴定出20个强结合子和83个弱结合子，并进一步根据结合强度和等位基因混杂性进行了筛选。

HTL表位预测：使用NetMHCIIpan 4.1对来自B细胞表位富集区域的15肽进行了HTL表位预测，鉴定出多个能强结合两个或更多HLA-DR等位基因的表位。

免疫学过滤：对候选CTL和HTL表位进行了多级过滤，包括抗原性、过敏性、毒性、免疫原性（针对CTL表位）和100%菌株保守性验证，最终选定了4个CTL表位和5个HTL表位用于疫苗构建。

3.12 全球人群覆盖率分析

基于最终表位集和相关HLA限制，预测的全球人群覆盖率约为74.84%（至少识别一个表位-HLA组合），41.97%的个体预测可识别两个或更多组合。

3.13 多表位疫苗构建体的设计与表征

设计了一个嵌合多表位疫苗构建体，架构为：佐剂 - (EAAAK连接肽) - [HTL表位块] - [CTL表位块]。HTL表位之间使用GPGPG连接肽，CTL表位之间使用AAY连接肽。最终构建体包含155个氨基酸。

3.14 疫苗构建体的理化表征

通过ProtParam分析，该构建体分子量为16.45 kDa，理论等电点(pI)为7.31，不稳定指数为34.41（稳定），GRAVY值为-0.795（亲水）。AllerTOP预测为非过敏原。Protein-Sol预测其在大肠杆菌中表达具有可接受的溶解度。

3.15 三维结构预测与验证

使用AlphaFold和I-TASSER进行的结构建模显示，该构建体全局折叠置信度低，这是富含连接肽的合成多表位疫苗的典型特征，表明其具有灵活性而非稳定的球状折叠，局部表位核心区域显示出二级结构倾向。

3.16 TLR4结合界面与蛋白质-蛋白质对接分析

使用HADDOCK和ClusPro对疫苗构建体与人类TLR4/MD-2复合物进行了多构象对接分析。尽管由于构建体灵活性导致界面均方根偏差较高，但两种独立对接平台的结果都表明，构建体倾向于与TLR4胞外域的一个溶剂可及区域相互作用，显示出相互作用位点的一致性倾向。对接结果应谨慎解释，被视为初步的计算证据，表明存在结构兼容性，但不能确认稳定的高亲和力结合或生物学功能。

讨论与结论总结

讨论部分总结：研究讨论了靶向铜稳态作为对抗耐药性淋病奈瑟菌疫苗策略的前景。候选蛋白AKOBGLPP_01618的高保守性和缺乏人源同源性是其作为疫苗靶点的优势。研究强调了对表位进行多层级精炼以平衡广度、安全性和可制造性的重要性。尽管多表位疫苗构建体显示出良好的计算特性，并提示了与TLR4相互作用的可能性，但研究人员也指出了本研究的局限性：候选蛋白的铜结合功能是推断的，表位预测依赖于计算模型，构建体的灵活性限制了结构预测和对接的可靠性，且未进行分子动力学模拟或对照实验。未来的研究方向包括实验验证候选蛋白的金属结合功能、评估多表位疫苗构建体的体外免疫原性、TLR4信号激活以及最终的体内保护效力研究。

研究结论翻译：本研究提出了一个基于免疫信息学的框架，用于鉴定和评估淋病奈瑟菌中一种保守的铜相关蛋白作为潜在抗原来源。泛基因组分析、表位预测和计算表征支持了多表位疫苗构建体的设计，该构建体具有良好的预测理化特性和广泛的理论HLA人群覆盖率。对接模拟提示了与TLR4受体一致的相互作用表面，尽管需要进一步的计算和实验研究来确认受体结合和免疫原活性。这些发现突显了铜稳态作为未来淋球菌疫苗研究的一个潜在有希望的靶点，并为后续的实验验证提供了计算基础。