《HUMAN MUTATION》：Novel ABCG5 and ABCG8 Variants in Sitosterolemia: Insights Into Haemolysis, Calcium Dysregulation and Therapeutic Challenges
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Sitosterolemia（谷甾醇血症）是一种由ABCG5或ABCG8基因突变引起的罕见常染色体隐性脂质代谢疾病，其特征是膳食植物甾醇的病理性蓄积。该病临床表现异质性强，可出现黄瘤、早发动脉粥样硬化及血细胞异常（如口形红细胞增多症、溶血性贫血和血小板减少症）
Sitosterolemia（谷甾醇血症）是一种由ABCG5或ABCG8基因突变引起的罕见常染色体隐性脂质代谢疾病，其特征是膳食植物甾醇的病理性蓄积。该病临床表现异质性强，可出现黄瘤、早发动脉粥样硬化及血细胞异常（如口形红细胞增多症、溶血性贫血和血小板减少症），导致诊断极为困难。本研究对四名不明原因遗传性溶血性贫血且具有反复输血史的患者进行研究，以明确其分子与功能机制并探索治疗策略。研究人员进行了血液学检测（包括全血细胞计数、外周血涂片、网织红细胞计数、EMA结合试验、红细胞酶活性及血红蛋白病的高效液相色谱分析）以及肝、肾和血脂功能的生化检测。血浆甾醇水平通过气相色谱-质谱法（GC–MS）进行定量，功能学检测则包括渗透压应激下的细胞内钙离子（Ca2+）流、红细胞密度谱分析及活性氧（ROS）测定。全外显子组测序鉴定了三种纯合无义变异：在两个同胞中发现新型ABCG8基因变异（p.Trp584?），在一个患者中鉴定出ABCG5基因变异（p.Arg243?），在另一患者中鉴定出ABCG8基因变异（p.Ser129?）。两名患者的血浆植物甾醇（主要为豆甾醇和β-谷甾醇）水平显著升高。依折麦布治疗（10 mg/天，持续6个月）能有效降低甾醇水平，但未能使血红蛋白恢复正常或显著减少过度水化红细胞群体。功能学研究表明，患者红细胞内Ca2+水平升高、应激下钙内流增强、ROS升高，且存在持续的口形红细胞群体。生物信息学预测工具证实了所鉴定变异具有致病性。尽管进行了甾醇降低治疗，但持续的溶血提示，由于甾醇掺入红细胞膜、膜流动性改变、氧化应激及钙稳态失调，已造成了不可逆的红细胞膜损伤。本研究结果表明，将依折麦布与钙调节疗法联用，可能成为减轻Sitosterolemia患者溶血的新型策略。
论文解读文章
一、 研究背景、存在问题与研究目的
Sitosterolemia（谷甾醇血症），亦称植物甾醇血症，是一种罕见的常染色体隐性脂质代谢疾病，由编码甾醇转运蛋白Sterolin-1和Sterolin-2的ABCG5或ABCG8基因功能缺失突变引起。该病表现为肠道植物甾醇过度吸收及胆汁排泄减少，导致其在血液和组织中病理性蓄积。临床表现多样，包括黄瘤、早发动脉粥样硬化及血液学异常，其中血液学表现（如溶血性贫血、口形红细胞增多症、血小板减少症）是重要但常被忽视的特征。由于常规血脂谱检测无法区分植物甾醇与胆固醇，且临床表现常与家族性高胆固醇血症或遗传性溶血性贫血相似，该病极易被漏诊或误诊。目前全球仅有约110例经分子确诊的病例，提示其诊断率严重不足。本研究旨在通过对印度人群中四名表现为不明原因溶血性贫血的患者进行多维度研究，明确其致病基因突变，并评估依折麦布治疗对植物甾醇水平、血液学指标及红细胞功能的影响，以深入探讨该病的病理生理机制与潜在治疗策略。
二、 主要关键技术方法
研究人员招募了四名具有不明原因遗传性溶血性贫血及反复输血史的印度患者。通过全外显子组测序（Whole-exome sequencing, WES）结合生物信息学分析（如基于gnomAD、ClinVar、HGMD、LOVD等数据库及CADD、MutationTaster、phyloP、phastCons、GERP等预测工具）进行致病基因鉴定，并依据美国医学遗传学与基因组学学会/分子病理学学会（ACMG/AMP）指南对变异进行分类。血液学评估包括全血细胞计数、外周血涂片形态学观察、网织红细胞计数、EMA结合试验、红细胞酶活性检测（包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD、丙酮酸激酶PK、葡萄糖磷酸异构酶GPI、嘧啶-5′-核苷酸酶P5′N）及血红蛋白高效液相色谱（HPLC）分析。生化检测涵盖肝功能、肾功能和血脂谱。血浆植物甾醇（包括豆甾醇、β-谷甾醇等）定量采用气相色谱-质谱法（GC–MS）。功能学研究利用健康对照者红细胞进行，包括：使用荧光染料Fluo-4-AM通过流式细胞术测定基础及渗透性肿胀（蒸馏水刺激）应激下细胞内游离钙离子水平；利用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内活性氧（ROS）水平；通过Percoll密度梯度离心法分析红细胞密度分布，以评估过度水化红细胞比例。
三、 研究结果
1. 临床与分子特征
四名患者均表现为脾大、慢性溶血性贫血，其中两例有血小板减少。外周血涂片均观察到口形红细胞。所有患者均排除了常见的膜缺陷、酶缺陷、血红蛋白病及自身免疫性溶血。WES鉴定出三种纯合无义变异：两名同胞携带新型ABCG8基因p.Trp584?变异；一名患者携带ABCG5基因p.Arg243?变异；另一患者携带ABCG8基因p.Ser129?变异。生物信息学分析支持这些变异均为致病/可能致病。
2. 植物甾醇水平与治疗反应
两名患者（Case I 和 Case II）在接受依折麦布（10 mg/天）治疗6个月后，血浆豆甾醇和β-谷甾醇水平均有所下降。然而，治疗前后，患者的血红蛋白水平（Case I: 8.0 vs 7.9 g/dL; Case II: 8.1 vs 6.3 g/dL）及血小板计数并未实现正常化，提示尽管甾醇降低，但血液学改善有限。
3. 功能学研究揭示的病理机制
（a）钙稳态失调：与健康对照相比，患者红细胞内基础游离钙（Ca2+）水平显著升高（p= 0.05），并且在渗透性肿胀应激下钙内流增强。
（b）氧化应激增强：患者红细胞内活性氧（ROS）水平较对照升高（p= 0.07）。
（c）红细胞密度异常：Percoll密度梯度分析显示，患者存在显著的低密度、过度水化红细胞群体，这是口形红细胞增多的特征。经6个月依折麦布治疗后，此异常细胞群体比例仅有轻微改善。
四、 讨论与结论
本研究强调了Sitosterolemia的临床表现异质性，特别是其可以表现为正常的血脂谱，从而增加诊断难度。分子分析鉴定出一个新型ABCG8无义变异，并通过生物信息学和功能学数据证实了其致病性。尽管依折麦布治疗可有效降低血浆植物甾醇水平，但未能有效纠正患者的贫血，这表明仅靠降低甾醇不足以逆转已发生的红细胞膜损伤。功能学研究揭示了该病溶血的新机制：植物甾醇掺入红细胞膜导致膜流动性与结构改变，引发细胞内钙稳态失调和氧化应激增强，共同导致红细胞脆性增加、过度水化和提前破坏。持续的溶血可能源于这些钙介导和氧化损伤导致的不可逆膜结构改变。
研究结论翻译：本研究表明，Sitosterolemia可表现为严重的溶血性贫血和正常的血脂谱，这可能延误诊断。分子确认和功能谱分析揭示了细胞内钙稳态失调和氧化应激是导致红细胞破坏的重要因素。尽管依折麦布有效降低了血浆植物甾醇水平，但在研究期间未观察到血红蛋白改善，这可能受到多种临床因素的影响，或由于不可逆的红细胞膜改变而非单纯的治疗失败。靶向钙稳态（例如通过PIEZO1抑制剂或抗氧化剂）与依折麦布联合治疗，可能是一种旨在解决依折麦布单独使用未能纠正的持续性溶血的新治疗方向。
