多功能评估水热合成氧化钙纳米颗粒：抗氧化、抗菌及细胞毒性研究

《Materials Research Bulletin》：Multifunctional Assessment of Hydrothermally Synthesized Calcium Oxide Nanoparticles: Antioxidant, Antimicrobial, and Cytotoxic Investigations

　　作者：Shweta M. Pawar, Satyajeet S. Patil, Aravind H. Patil, Masidd Khalate, Akhilesh P. Patil, Pramod S. Patil
印度马哈拉施特拉邦科尔哈普尔市希瓦吉大学物理系薄膜材料实验室

**摘要**
细菌和真菌对现有药物的耐药性日益增强，这迫切需要开发新的抗菌药物。因此，寻找传统疗法（如广谱抗生素、唑类抗真菌药和联合用药疗法）之外的新治疗选择至关重要。近年来，基于纳米技术的方法（尤其是金属和金属氧化物纳米颗粒）因其广谱活性、稳定性以及克服微生物耐药机制的潜力而受到越来越多的关注。在水热合成后，全面评估了氧化钙纳米颗粒（CaO NPs）的多功能生物活性。通过X射线衍射（XRD）数据的Rietveld精修、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）和能量分散X射线光谱（EDS）等广泛的表征方法，确认合成的CaO是纯净的多晶态。采用Well扩散法评估了这些纳米颗粒对常见真菌菌株（白色念珠菌和黑曲霉）、革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性细菌（大肠杆菌）的抗菌效果。此外，还通过DPPH（2,2-二苯基-1-皮克里尔肼）自由基清除实验测量了CaO NPs的抗氧化活性。实验表明，这些纳米颗粒具有剂量依赖性的自由基清除能力，暗示其在特定情况下能够调节氧化应激。L929成纤维细胞毒性测试显示，在治疗剂量下其毒性较低，细胞存活率始终高于85%，说明其具有良好的生物相容性。CaO NPs兼具抗菌、抗氧化和生物相容性。这些多功能特性使其成为先进生物医学应用的理想候选材料，尤其是在应对多重耐药病原体的关键威胁以及减轻氧化应激方面。

**引言**
COVID-19大流行暴露了全球卫生系统的脆弱性，凸显了对抗传染病的创新需求的迫切性。随着世界继续与各种感染的普遍威胁作斗争，抗菌素耐药性（AMR）问题也变得尤为突出[1]。细菌和真菌疾病风险的增加引发了人们对全球健康的担忧。细菌和真菌对抗生素及抗真菌药物的耐药性是导致这一问题的主要原因，使得感染更难治疗和控制[2]。纳米颗粒因其独特的物理化学性质（如高表面积、增强的反应性和抗菌活性）而受到关注，成为潜在的传染病治疗方法[3][4]。先前的研究表明，如Cu2O–TiO2/rGO等纳米复合材料在可见光照射下对多种病原体表现出改进的抗菌活性，显示出工程纳米材料对抗耐药微生物的潜力[5]。Mg(OH)2纳米片也被报道可以通过直接破坏细菌细胞膜发挥有效的抗菌作用，在紫外光照射下其效率进一步提高，显示出在微生物控制应用中的强大潜力[6]。金属氧化物纳米颗粒因其广泛的抗菌性能、低毒性和在不同应用中的适应性而受到广泛关注[7]。例如氧化铜（CuO）[8]、氧化锌（ZnO）[9]、二氧化钛（TiO2）[10]、氧化镁（MgO）[11]和氧化钙（CaO）[12]等金属氧化物纳米颗粒具有高表面积、抗菌活性和反应性等显著特性。它们的抗菌活性与其独特的物理化学性质有关，尤其是生成活性氧（ROS）的能力。活性氧（ROS）是能够诱导微生物细胞氧化应激的反应性化学物质，包括超氧阴离子（O2•?）、羟基自由基（•OH）和过氧化氢（H2O2）。由于纳米颗粒体积小，表面积大，能够更有效地与微生物细胞相互作用，具有更多的活性接触区域[13]。此外，金属氧化物纳米颗粒对革兰氏阳性和阴性细菌以及真菌都更具效力，因为它们能够穿透微生物膜并到达细胞内部目标[14]。

**氧化钙（CaO）**
CaO是一种碱性无机化合物，具有多种工业和科学用途。由于其宽带隙（约7.1 eV），CaO被归类为绝缘半导体。它的磁化率低，为抗磁性物质，因此在多种环境中具有稳定性。通常通过高温分解石灰石（CaCO3）来制备CaO[15]。CaO是一种天然化合物，已被广泛研究用于水处理[16]、催化剂[17]和水泥生产[18]等工业领域。最近的研究还探讨了其在医学应用中的潜力，尤其是在抗菌治疗方面。氧化钙纳米颗粒（CaO NPs）因其出色的稳定性、无毒性和生物相容性而成为治疗微生物感染的可行选择[19]。CaO具有强烈的离子晶体结构，主要为面心立方（FCC）晶格，由Ca2+阳离子和O2-阴离子通过离子键结合形成[20]。已有多种合成CaO NPs的方法，包括共沉淀[21]、溶胶-凝胶法[22]、水热法[23]、微波辅助法[24]和绿色合成法[25]。其中，水热法是最常用的合成方法，利用高压和高温使钙前体和溶剂发生反应生成CaO[23]。本研究采用水热法合成CaO NPs，并通过XRD数据的Rietveld精修确认了其晶体结构。Well扩散法用于评估CaO NPs对革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性（大肠杆菌）细菌的抗菌效果，同样方法也用于评估其对黑曲霉和白色念珠菌的抗菌效果。实验结果显示CaO NPs具有显著的抑制作用，表明其能够抵抗多种病原体感染。使用DPPH自由基清除实验检测了其抗氧化活性和抗菌特性，发现其具有浓度依赖性的自由基清除能力，表明它们能够减轻氧化应激。这种活性表明自由基可能通过电子传输通道被直接或间接中和。此外，CaO NPs在抗菌过程中也会生成活性氧（ROS），从而破坏微生物细胞[14]。

**部分内容摘要**
**CaO NPs的合成**
采用水热法成功合成CaO NPs。首先制备了100 mL浓度为0.05 M的硝酸钙（Ca(NO3)2）溶液，然后逐滴加入0.8 M的NaOH直至形成沉淀。加入1%的Triton X-100作为表面活性剂后搅拌15分钟，随后将混合物高压灭菌2、4、6、8和10小时。灭菌后进行离心（5000 r.p.m.），然后用蒸馏水和乙醇洗涤沉淀物。

**热重分析（TGA）**
随着温度升高，Ca(OH)2的热行为表现出一些重要特征。TGA曲线显示了与Ca(OH)2热分解及相关过程相关的重量变化（见图2）。在50°C开始、400°C结束的第一阶段，表面吸附或被困的水分子蒸发导致重量损失2.295%。这些水分来自空气中的水分，随着温度升高而释放。

**抗氧化活性**
通过ROS清除实验评估了CaO NPs的抗氧化能力，主要是为了了解其清除外部产生的ROS的效率。实验中使用的CaO NPs浓度分别为200、400、600、800和1000 μg/ml。抗氧化活性通过以下公式计算：
**DPPH自由基清除活性 (%) = (对照组吸光度 - 测试样品吸光度) / 对照组吸光度 × 100**

**CaO NPs的细胞毒性**
药物的细胞毒性是指其损害甚至杀死细胞的能力，通过MTT实验等测试进行评估，该实验通过测量线粒体活性来确定细胞存活率（见图17a）。图17b展示了相应的定量分析结果。实验使用了五种浓度（20、40、60、80和100 μl）。L929成纤维细胞系用于细胞毒性研究（见表6）。

**CaO NPs的抗菌机制**
CaO NPs的抗菌机制主要取决于其大小，较小的纳米颗粒表现出更高的活性。此外，碱性效应、ROS的生成、细胞膜完整性的破坏以及微生物的物理损伤等因素也对其抗菌效果有贡献。CaO在细菌环境中溶解会产生pH值约为11的Ca(OH)2，从而改变细菌的生长环境；而过量的OH-离子会干扰细胞呼吸。

**结论**
本研究采用水热法合成CaO NPs，并通过热分析、结构分析、光谱分析和显微观察对其进行了表征。XRD确认了颗粒的面心立方相，并通过Rietveld精修进一步确认了晶体结构；XPS进一步验证了CaO NPs的化学性质。FTIR、拉曼光谱和UV-DRS进一步确认了其结构和光学特性。

**作者贡献声明**
Khalate Masidd N.：撰写、审稿与编辑；Pramod S. Patil：监督、资源管理、方法论、资金获取、数据分析、概念构思；Akhilesh P. Patil：撰写、审稿与编辑、数据分析；Shweta Pawar：撰写、原始草稿、软件使用、数据管理；Aravind H. Patil：数据分析；Satyajeet S. Patil：撰写、审稿与编辑、软件使用、数据分析。

**利益冲突声明**
作者Shweta M. Pawar感谢Chhatrapati Shahu Maharaj研究培训与人类发展研究所（SARTHI）提供的财务支持。作者感谢UGC DSA第二阶段（2018–2023）和DST-PURSE第二阶段（2018–2023）项目为印度马哈拉施特拉邦科尔哈普尔市希瓦吉大学物理系提供的研究设施。同时感谢该校计算机中心提供的计算资源。