炎症细胞因子与脂质代谢物在浆液性卵巢癌中的因果相互作用：来自一项遗传关联研究的见解

《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》：Causal Interplay Between Inflammatory Cytokines and Lipid Metabolites in Serous Ovarian Carcinoma: Insights From a Genetic Association Study

　　摘要

背景
在浆液性卵巢癌（SOC）中，炎症细胞因子和代谢重编程的因果作用和相互作用仍不清楚。本研究使用孟德尔随机化（MR）方法探讨了它们之间的关系。

方法
在这项双样本MR分析中，炎症细胞因子和血液代谢物的全基因组关联研究（GWAS）数据被用作暴露因素，而FinnGen联盟提供的SOC数据作为结果变量。主要使用的MR方法是逆方差加权（IVW），同时辅以MR Egger、加权中位数和加权模式。应用了两步中介MR方法来评估特定代谢物是否介导了炎症细胞因子对SOC的影响。为了评估研究的稳健性，进行了敏感性分析，包括异质性和多效性测试。

结果
确定了五种炎症细胞因子是SOC的风险因素：CSF1（OR = 1.69，95% CI: 1.17–2.43）、CXCL1（OR = 1.40，95% CI: 1.01–1.93）、IL-20（OR = 1.86，95% CI: 1.03–3.35）、IL-8（OR = 1.61，95% CI: 1.08–2.39）和VEGF-A（OR = 1.24，95% CI: 1.00–1.54）。此外，1-棕榈酰-GPG（16:0）可能介导了IL-8与SOC之间的关系，解释了约10%的总效应。未检测到多效性或异质性。

结论
这项双样本MR研究提供了初步的遗传学证据，表明炎症细胞因子增加了SOC的风险，其中脂质代谢部分介导了IL-8的效应。这些发现突显了炎症和代谢在SOC发病机制中的相互作用，并提出了潜在的生物标志物和治疗靶点。由于样本量有限且数据集仅包括欧洲人群，这些发现需要在更大规模、多祖先群体的研究中进一步验证。

缩写
GWAS：全基因组关联研究
IVs：工具变量
IVW：逆方差加权
MR：孟德尔随机化
OR：比值比
SOC：浆液性卵巢癌

1 背景
卵巢癌仍然是全球女性中肿瘤相关死亡的主要原因之一。在其组织学亚型中，浆液性卵巢癌（SOC），特别是高级别浆液性卵巢癌（HGSOC），是最具侵袭性的形式，预后最差[1, 2]。由于早期没有特定症状且缺乏有效的群体筛查策略，大多数患者在晚期才被诊断出来[3]。此外，高复发率和获得性化疗耐药性的发展进一步导致了较差的总体生存结果。先前的研究表明，SOC的发生与子宫内膜异位症家族史、环境暴露和不良生活方式因素有关[4]。然而，SOC的精确发病机制仍很大程度上不清楚。在精准医疗和个性化医疗的时代，从病因学和通路角度识别可操作的因果靶点和可转化的生物标志物具有重要的科学价值和临床意义。慢性炎症微环境被广泛认为是疾病发生和进展的主要驱动因素，炎症细胞因子和趋化因子在这些过程中起着关键的调节作用[5]。多种介质通过促进血管生成、诱导上皮-间充质转化、重编程髓系细胞以及招募免疫抑制细胞群体，从而维持“促肿瘤的炎症-免疫失衡”，促进了疾病的发展[6, 7]。重要的是，与炎症相关的信号通路不是孤立运作的，也不是由单一因果事件引起的；相反，它们与代谢网络紧密耦合并动态相互作用[8, 9]。与炎症并行，代谢重编程也被认为是癌症的特征[10, 11]。血液代谢物不仅反映了能量代谢和生物合成途径的状态，还可能作为连接慢性炎症与恶性转化的关键桥梁[12]。观察性研究提供了将特定代谢组谱与卵巢癌联系起来的基础证据。例如，Chen等人使用两步代谢组学策略，识别出27-诺-5β-胆甾烷-3,7,12,24,25戊醇葡萄糖醛酸苷（CPG）等特定的血清代谢物作为上皮卵巢癌的潜在诊断生物标志物，表明即使在疾病早期也存在代谢紊乱[13]。此外，Zeleznik等人的一项为期23年的前瞻性研究表明，诊断前循环中某些脂质组（特别是鞘磷脂）的水平升高与卵巢癌的风险增加有关[14]。然而，这些发现本质上受到逆向因果关系和混杂偏倚的限制，使得建立因果推断变得困难。因此，区分同时发生的改变和真正的因果关系，以及量化它们对疾病机制的中介作用，仍然是病因学研究和治疗靶点发现中的主要挑战。由于传统观察性设计的这些局限性，确定炎症和代谢改变是SOC的原因、结果还是仅仅是旁观者需要替代的方法论方法。虽然随机对照试验（RCT）是建立因果关系的金标准，但在解决病因学问题时常常面临伦理和可行性限制。孟德尔随机化（MR）利用与暴露因素相关的遗传变异作为工具变量（IVs），提供了一种稳健的策略来减轻混杂和逆向因果关系，从而为这些限制提供潜在的解决方案。基于孟德尔分离定律和独立分配的原则，遗传变异在配子形成过程中随机分配，并在受精时固定。这些遗传分配发生在疾病发作之前，通常不受自我选择的环境或生活方式因素的影响；MR对逆向因果关系和未测量的混杂具有很高的抵抗力[15, 16]。此外，两步中介MR允许从暴露到结果的分步途径分析，从而量化中介的因果贡献，并将关联提升为因果证据。随着FinnGen和NHGRI-EBI GWAS目录等大规模、公开可访问资源的日益可用，这些策略的可行性和可重复性得到了极大的提高。基于这些考虑，本研究旨在测试两个假设：（1）炎症细胞因子对SOC的风险具有因果效应；（2）特定的血液代谢物介导了炎症细胞因子与SOC之间的关系。为此，我们应用了双样本MR框架来研究炎症细胞因子与SOC之间的潜在因果关联，随后采用两步中介MR方法来评估特定代谢物是否在该途径中起中介作用。我们的目标是进一步阐明连接炎症、代谢和SOC的机制轴，从而为机制理解、风险分层和生物标志物开发提供新的、可测试的线索，同时为后续的功能验证和转化研究奠定基础。

2 方法
2.1 研究设计概述
在这项研究中，我们采用了两步MR方法来研究炎症细胞因子与SOC之间的潜在因果关联，并进一步评估这些关联是否由血液代谢物介导。第一步，进行了双样本MR分析，以评估炎症细胞因子和血液代谢物与SOC之间的因果关系，从而确定与SOC风险相关的候选暴露因素。第二步，我们检查了选定炎症细胞因子与代谢物之间的潜在因果关系，并随后量化了代谢物对炎症细胞因子-SOC途径的中介效应（图1）。这项研究按照STROBE-MR（使用孟德尔随机化加强流行病学观察性研究报告）指南报告（数据S3）进行。

2.2 数据来源
卵巢癌的全基因组关联研究（GWAS）总结数据来自FinnGen联盟（https://www.finngen.fi/en/access_results）。该数据集包括1025例卵巢癌患者，其中852例为SOC，167,189例为对照组。对于本次分析，我们特别使用了来自SOC（852例对比167,189例对照组）的GWAS总结统计数据来进行MR分析。91种炎症细胞因子（GCST90274758–GCST90274848）[17]和1400种血液代谢物及其比例（GCST90199621–GCST902010209）[18]的GWAS总结统计数据来自NHGRI-EBI GWAS目录（https://www.ebi.ac.uk/gwas/）。

2.3 工具变量选择
选择与感兴趣的暴露因素显著相关的单核苷酸多态性（SNPs）作为IVs，采用的阈值是p < 5 × 10^-5。应用了几种质量控制程序来确保IVs的有效性。首先，使用r2 < 0.001的阈值和10,000 kb的聚类窗口大小进行了连锁不平衡（LD）剪枝。然后，使用公式F = β2/SE2计算每个SNP的F统计量。F统计量≥10的SNPs被认为是足够强的工具变量，而F统计量< 10的SNPs被视为弱工具变量，并从后续分析中排除。

2.4 统计分析
进行了两步MR分析，以估计暴露因素（炎症细胞因子）和中介因素（代谢物）与结果（SOC）之间的潜在因果关系。这种方法用于评估代谢物在多大程度上介导了暴露-结果关系。具体来说，首先估计了暴露因素对中介因素的因果效应（β1），然后估计了中介因素对结果的效应（β2）。然后计算中介效应为β1 × β2，并使用delta方法量化中介效应相对于总效应的比例（图1）。MR分析使用了五种方法：逆方差加权（IVW）、MR-Egger、加权中位数和加权模式。其中，IVW被认为是主要分析方法；因此，从IVW方法得出的p值被视为主要结果，其他四种方法作为敏感性分析。结果以比值比（OR）及其相应的95%置信区间（CI）报告，p < 0.05被视为统计显著。为了确保因果方向是从暴露到结果，还进行了反向MR分析。只有在正向MR分析中具有显著p值且在反向MR分析中p值不显著的关联才被认为是稳健的；未满足这些标准的结果被排除在进一步解释之外。为了进一步确保双样本MR框架中因果推断的稳健性，我们进行了一系列敏感性分析。使用Cochran的Q检验评估了SNP特异性因果估计的异质性，p < 0.05表示显著异质性。使用MR-Egger回归截距和MR-PRESSO全局检验评估了水平多效性；如果任一检验的p值< 0.05，则认为关联具有水平多效性。具有水平多效性证据的因果关系被认为是不可靠的，并被排除在进一步解释之外。在检查多效性和异质性之后，我们对符合条件的暴露因素进行了留一法分析。在这种方法中，依次排除每个SNP，并重新计算剩余SNPs的综合效应。如果去除单个SNP后总体置信区间没有显著变化，则认为结果是稳健的。所有统计分析都是使用R软件（版本4.2.1）进行的，使用TwoSampleMR包进行MR分析。

3 结果
通过MR分析，我们确定了五种炎症细胞因子和68种血液代谢物与SOC具有潜在的因果关联。中介MR分析进一步显示1-棕榈酰-GPG（16:0）介导了IL-8对SOC的效应（数据S1和S2）。

3.2 炎症细胞因子对SOC的影响
IVW分析确定了五种与SOC具有显著因果关联的炎症细胞因子，MR分析中使用的SNP数量从8到19不等。所有五种炎症细胞因子都被确定为SOC的风险因素。IVW估计值如下：CSF1（OR = 1.688，95% CI: 1.174至2.426；F统计量：20.88至203.67）、CXCL1（OR = 1.396，95% CI: 1.012至1.927；F统计量：20.89至547.00）、IL-20（OR = 1.862，95% CI: 1.034至3.353；F统计量：20.97至27.03）、IL-8（OR = 1.610，95% CI: 1.082至2.394；F统计量：21.10至61.76）和VEGF-A（OR = 1.239，95% CI: 1.000至1.535；F统计量：21.08至943.51）（图2和图3）。所有F统计量显著超过了10的传统阈值，表明没有弱的工具变量偏差。此外，事后功效计算显示这些识别因素的统计功效水平各不相同。CSF1显示出足够的统计功效（80.8%，实现80%功效所需的最小可检测OR为1.68）。IL-8和IL-20的功效接近标准阈值（分别为73.9%和73.1%）。相比之下，由于CXCL1和VEGF-A的效应较小以及SOC病例样本量有限，其分析相对效力较低（分别为30.5%和29.4%），这表明应谨慎解释这些特定关联。

图2显示了循环炎症蛋白与SOC之间的因果关系森林图。IVW：逆方差加权；nSNP：单核苷酸多态数；OR：比值比。图3：在图表查看器或PowerPoint中打开

(A) 冰山图：与卵巢癌（SOC）可能存在因果关系的炎性细胞因子。(B–F) CSF1、CXCL1、IL20、IL8、VEGF-A与SOC之间因果关联的散点图。

3.3 血液代谢物对卵巢癌（SOC）的影响

磁共振（MR）分析共识别出68种与SOC有显著因果关联的血液代谢物，分析中使用的单核苷酸多态性（SNPs）数量从14到46不等（F统计量：19.503至2297.785）。其中，39种代谢物与SOC风险呈正相关，而29种代谢物呈负相关（数据S2）。

3.4 炎性细胞因子对血液代谢物的影响

在本研究中，MR分析确定了5种炎性细胞因子和68种可能与SOC有因果关联的血液代谢物。随后，我们调查了这5种炎性细胞因子与68种代谢物之间的因果关系。逆方差加权（IVW）分析显示，IL-8与1-棕榈酰-GPG（16:0）之间存在正相关的初步证据（OR = 1.140，95% CI：1.001–1.297），这一结论基于MR分析中使用的16个SNPs（图4）。图4：在图表查看器或PowerPoint中打开

IL-8、1-棕榈酰-GPG（16:0）与SOC之间因果关系的森林图。IVW：逆方差加权；nSNP：单核苷酸多态性数量；OR：比值比。

3.5 1-棕榈酰-GPG（16:0）在IL-8与SOC之间因果关联中的中介作用

中介MR分析表明，1-棕榈酰-GPG（16:0）可能部分介导了IL-8对SOC的影响。具体而言，IL-8与SOC呈正相关（β = 0.4760，95% CI：0.0791–0.8729），而1-棕榈酰-GPG（16:0）也与SOC风险增加相关（β = 0.3633，95% CI：0.1475–0.5791）。此外，观察到IL-8与1-棕榈酰-GPG（16:0）水平之间也存在正相关（β = 0.1307，95% CI：0.0015–0.2599）。1-棕榈酰-GPG（16:0）的中介效应估计为0.0475（95% CI：-0.0073至0.1022），占总效应的9.98%（图1和图4）。

3.6 敏感性分析

Cochran's Q检验表明，所选SNPs之间没有显著的异质性。MR-Egger回归和MR-PRESSO全局检验均未检测到水平多态性的证据。此外，留一法分析表明，观察到的因果关系并非由任何单一SNP驱动。

4 讨论

在本研究中，我们应用双向MR筛选了91种炎性细胞因子，并确定了其中5种与SOC有潜在因果关联的细胞因子。此外，我们使用两步中介MR来检查血液代谢物是否介导了炎性细胞因子对SOC的影响。结果表明，CSF1、CXCL1、IL-20、IL-8和VEGF-A可能是SOC的潜在风险因素。中介MR分析进一步表明，脂质代谢物1-棕榈酰-GPG（16:0）部分介导了IL-8对SOC的影响。多项敏感性测试验证了这些发现的稳健性。总体而言，这种以生物标志物为导向的方法为SOC的病因提供了新的、可靠的见解。为了进一步阐明潜在机制，我们在后续部分讨论了这些发现的含义。慢性炎症和免疫失衡是SOC发生和进展的核心背景[19]。CXCL1、IL-8和IL-20属于趋化因子家族，它们通过与相应的受体CXCR1/2或IL-20R结合来维持和放大炎症反应。卵巢癌微环境中持续升高的促炎信号会导致NF-κB和STAT3等通路的持续激活，从而缩短G1期，加速DNA合成和细胞分裂，促进肿瘤快速生长，并增加基因组不稳定性[20, 21]。CXCL1通过CXCR2招募免疫细胞并将其重新编程为免疫抑制表型，导致Arg-1/iNOS/ROS介导的CD8+ T细胞抑制和Tregs的扩增[22, 23]。升高的IL-8也与中性粒细胞浸润密切相关；通过Jagged2信号部分激活的中性粒细胞水平会损害CD8+ T细胞的细胞毒性，进一步加剧慢性炎症和免疫逃逸[24]。临床数据显示，晚期卵巢癌患者的血清CXCL1水平高于早期患者[25]；IL-8水平升高的患者更容易发生转移，总体生存率更低；动物实验表明，阻断IL-8信号可以逆转对顺铂和紫杉醇的耐药性[26]。作为IL-10家族中的促炎成员，IL-20不仅促进了慢性炎症环境，还在受体复合物结合后促进了上皮-间充质转化，从而增强了细胞迁移和侵袭性[27, 28]。总体而言，这些发现表明炎性趋化因子通过慢性炎症及其相关机制推动SOC的疾病进程和恶性进展。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的极化是SOC进展的另一个关键机制。CSF1是一种经典的巨噬细胞集落刺激因子，它与CSF1R结合并激活下游的PI3K–AKT、MAPK/ERK和JAK/STAT3信号通路，从而促进单核细胞招募并分化为免疫抑制性的M2型TAMs[29]。M2极化的TAMs分泌VEGF和IL-10等效应分子，这些分子协同作用促进血管生成和基质重塑。此外，它们还损害抗原呈递并上调PD-L1表达，进一步削弱抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤进展和转移[30, 31]。值得注意的是，CSF1信号通过动员髓源性抑制细胞（MDSCs）来补充CXCL1–IL-8轴在免疫细胞招募中的作用。TAMs与MDSCs共同形成了一个促进肿瘤细胞侵袭、黏附和免疫逃逸的合作网络[32]。血管生成和缺氧驱动的微环境重塑是肿瘤进展的特征。VEGF-A是一种经典的血管生成因子，它促进内皮细胞增殖、迁移和血管通透性，从而驱动肿瘤中的新血管形成[33]。VEGF-A并非单独作用；近期研究表明，IL-8和IL-20可以刺激VEGF表达，与VEGF-A在血管生成中产生强烈的协同效应。一方面，VEGF-A激活PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK通路，促进内皮细胞迁移和增殖，加速血管网络形成。另一方面，它通过PLCγ/PKC–Src/FAK轴促进细胞骨架重组和血管通透性。这些机制共同增强了新血管网络的形成，为肿瘤的起始和进展创造了有利条件[34, 35]。快速的血管生成与高代谢需求之间的不匹配导致缺氧的肿瘤微环境，在这种环境中HIF-1α稳定并绑定到VEGF-A启动子，形成缺氧诱导的血管生成恶性循环[36, 37]。此外，卵巢癌细胞本身可以表达VEGFFR-2，形成自分泌的VEGF-A/VEGFFR-2信号环路，进一步增强侵袭能力[38, 39]。临床数据显示，血清或肿瘤组织中VEGF表达水平升高与疾病侵袭性和转移潜力密切相关。VEGF水平升高的患者通常具有更短的无症状进展间隔和总体生存率，尤其是在手术后仍有残留病灶的患者中[40]。这些发现表明，VEGF不仅作为血管生成和肿瘤进展的关键驱动因素，还作为重要的预后分层标志物。血液代谢物可能介导炎性细胞因子对SOC的影响。我们的两步中介MR分析表明，脂质代谢物1-棕榈酰-GPG（16:0）可能介导了IL-8对SOC的影响。尽管这种中介效应达到了名义显著性，但不耐受多重检验校正，因此应将其视为一个假设生成的发现。这一发现表明，IL-8的促肿瘤效应可能不仅依赖于慢性炎症和免疫逃逸，还可能与脂质代谢途径有关。然而，目前针对这种代谢物的具体证据仍然有限。1-棕榈酰-GPG（16:0）的异常丰富反映了卵巢癌细胞中的脂质代谢重编程，其中磷脂酶A2（PLA2）活性是连接1-棕榈酰-GPG（16:0）与IL-8信号的主要途径[41, 42]。PLA2生成多种溶血磷脂，包括1-棕榈酰-GPG（16:0），这些溶血磷脂可能放大和维持SOC中的IL-8信号，形成代谢-炎症级联[43, 44]。同样，最近的一项MR研究报道，1-棕榈酰-GPG（16:0）在糖尿病的发病机制中作为免疫细胞功能的调节中介[45]。总体而言，我们的发现提供了炎症细胞因子可能在SOC的启动和进展中起因果作用的证据，血液代谢物介导了其中部分效应。这一发现为SOC的病因提供了新的分子见解，支持了更针对性生物标志物的鉴定和开发，并为针对炎症、免疫、代谢和血管生成的新治疗策略奠定了基础，从而推进了SOC的个性化精准医疗。然而，也应认识到一些局限性。首先，本研究中使用的数据集主要来自欧洲人群；因此，我们的结果在其他祖先群体中的普适性需要进一步验证。其次，可用于MR分析的SNPs数量相对有限，数据集并未全面涵盖所有炎性细胞因子或代谢物，这可能导致相关中介效应的低估或遗漏。第三，为了确保有足够的SNPs用于这些暴露因素，选择IVs时使用了相对宽松的显著性阈值。虽然这是必要的，但这种宽松的阈值本身存在引入水平多态性或弱工具偏倚的风险。对于已识别细胞因子的事后功效计算显示，统计功效范围为29.4%至80.8%，表明对于效应较小的因素，分析可能会功率不足，容易产生假阴性结果。未来的研究应在更大、多祖先的队列中复制这些发现，并利用包括单细胞测序在内的整合多组学方法，以揭示SOC肿瘤微环境的动态重塑。这些努力对于探索这些机制在早期诊断、风险分层和治疗决策中的转化潜力至关重要。

5 结论

本研究基于双向双样本MR框架，系统评估了炎性细胞因子与SOC之间的潜在因果关系，并通过两步中介分析进一步探讨了血液代谢物的调节作用。结果表明，CSF1、CXCL1、IL-20、IL-8和VEGF-A是SOC的潜在风险因素，而脂质代谢物1-棕榈酰-GPG（16:0）介导了IL-8与SOC之间的关联。这些发现突显了炎症、免疫、代谢和血管生成在SOC发病机制中的关键相互作用，为疾病的遗传学提供了新的证据，并为未来针对炎症和代谢途径的精准干预奠定了基础。然而，由于病例样本量小和限制在欧洲祖先群体中，未来的研究需要使用更大、多祖先的队列来验证这些发现。

作者贡献

杨崇泽和秦兰辉设计了研究并撰写了手稿。杨崇泽、秦兰辉和兰伟进行了数据分析。黄成灿、黄晓莉和杨英霞准备了图表。范淼对手稿进行了严格修订。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。

致谢

作者无需报告任何内容。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号U24A20256）的支持。

伦理声明

作者无需报告任何内容。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

本研究中使用的数据来自公开可用的数据集。所有数据均可通过FinnGen数据库和NHGRI-EBI GWAS（https://www.ebi.ac.uk/gwas/）获取。