时序释放双层“三明治”结构二氧化铈纳米颗粒结合飞秒激光处理氧化锆种植体表面增强抗菌与骨整合能力

《Materials Today Bio》：Time-sequentially released bilayer sandwich cerium oxide nanoparticles on femtosecond laser-treated zirconia implant surface for enhanced antibacterial and osseointegration capacity

　　

： 氧化锆种植体具备优良的美学性能和生物相容性，但其固有的生物催化惰性限制了骨整合和抗菌活性。与现有缺乏时间可控、多阶段功能的氧化锆表面改性（例如，被动的微/纳米结构化或单层涂层）不同。本研究通过结合高重复频率飞秒激光物理改性与二氧化铈（CeO2）纳米颗粒化学改性，在氧化锆表面开发了一种二氧化铈纳米颗粒的双层“三明治”结构（Trbs-CeO2）。外层作为快速释放层，在植入后数小时至数天内释放高浓度的CeO2，以突出抗炎和抗菌作用；内层为缓释层，其特征是飞秒激光构建的微纳米结构负载了CeO2，在外层耗尽后，可继续释放低浓度CeO2数周，从而与氧化锆基底的微纳米结构协同增强长期成骨。在体外评估了Trbs-CeO2的抗炎、抗菌和成骨分化效果，并在动物模型中评估了其骨整合能力。与对照组相比，Trbs-CeO2组显著改善了氧化锆表面的粗糙度、润湿性和生物相容性。Trbs-CeO2通过破坏细菌细胞膜发挥强大的抗菌活性，诱导M2巨噬细胞极化，通过抑制RAW264.7细胞中的TLR4/MyD88/NF-κB（Toll样受体4/髓样分化因子88/核因子-κB）信号通路表现抗炎特性，并促进成骨细胞MC3T3-E1分化。Trbs-CeO2显著增强了体内骨整合效率。Trbs-CeO2提供了一种独特的、时间编程的双层策略，整合了抗菌、抗炎和促骨生成功能，为先进的氧化锆基种植体提供了有价值的见解。

论文解读：

研究背景、问题与动机

钛种植体长期被视为口腔和骨科修复的“金标准”，但其存在金属离子释放诱导慢性炎症反应、应力屏蔽导致骨吸收、影像学伪影及美观缺陷（如灰线）等固有局限。这促使研究者探索具有更优美学特性和生物相容性的替代材料。氧化锄（Zirconia）因其白色外观、低菌斑附着倾向和潜在的免疫相容性优势而备受关注。然而，氧化锄的生物惰性表面、有限的骨整合能力以及缺乏主动抗菌机制，阻碍了其在诸如即刻种植等复杂临床情况下实现快速稳定的骨整合。在种植体植入早期，种植体面临着炎症因子涌入、细菌定植和成骨抑制三重病理压力的相互作用，严重阻碍骨整合过程。在急性期，高浓度的促炎因子（如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β）可直接抑制成骨信号通路，而革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）通过激活TLR4/NF-κB轴进一步加剧炎症反应，形成感染与炎症的正反馈循环。伤口部位过量的活性氧（ROS）可损伤蛋白质和核酸，引发炎症并抑制免疫，从而阻碍修复。同时，局部缺氧和受损的成骨祖细胞迁移共同阻碍矿化的启动，使得传统的单一功能表面策略不足以应对这一复杂的病理网络。二氧化铈（CeO₂）纳米颗粒具有多种酶活性，可通过Ce³⁺和Ce⁴⁺之间的可逆价态转变催化细胞内氧化还原反应，有效清除炎症条件下的ROS，在促进成骨细胞分化、抑制细菌增殖和调节炎症方面展现出显著潜力。然而，单层涂层策略通常采用恒定释放模式，无法满足包括即刻种植在内的临床过程中复杂且动态变化的生物学需求。植入后早期存在局部急性炎症和细菌污染的风险，需要快速释放高剂量CeO₂以实现抗炎和抗菌作用；而在骨愈合的中后期，炎症反应趋于消退，需要持续缓慢释放CeO₂以促进成骨细胞粘附、增殖和分化。特定尺寸的微纳结构本身可影响免疫微环境并促进骨再生。通过调整加工参数，飞秒激光可以在氧化锄表面精确、一致地产生高度可重复且均匀的周期性微纳结构，而不会引起氧化锄相变或引入其他杂质元素。先前研究表明，单功能组分的空间排列与其释放动力学不匹配，使得难以实现协同的抗炎、抗菌和成骨效应。因此，本研究受“时间控制释放”概念启发，开发了一种双层“三明治”结构（Trbs-CeO₂），旨在实现功能分区和时间控制释放，以达成从早期感染控制到晚期骨整合的多维度协同效应。本研究论文发表在《Materials Today Bio》期刊。

关键技术方法概述

研究人员采用了物理与化学相结合的表面改性方法。1. 飞秒激光物理改性：使用中心波长1030纳米、脉冲持续时间300飞秒、重复频率200千赫兹、平均功率27瓦的光纤飞秒激光系统，在氧化锄（3摩尔%氧化钇稳定氧化锄多晶体，3Y-TZP）片状和种植体试样表面构建了周期性排列的凹槽结构和激光诱导周期性表面结构。2. CeO₂纳米颗粒合成与修饰：通过水热法合成CeO₂纳米颗粒，并利用聚多巴胺（PDA）进行表面修饰，形成外层快速释放层。3. 双层“三明治”结构（Trbs-CeO₂）构建：在激光处理的氧化锄表面依次负载CeO₂和PDA修饰的CeO₂纳米颗粒，并进行冷冻干燥，形成外层快速释放、内层缓释的结构。4. 体外与体内模型：使用小鼠巨噬细胞RAW264.7、小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 252和大肠杆菌进行体外功能评估；采用新西兰大白兔股骨缺损模型（动物实验经陆军军医大学动物福利与伦理委员会批准，编号AMUWEC20255399）进行体内骨整合评估。

研究结果

3.1. Trbs-CeO₂的制备与表征：光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察证实，飞秒激光处理在氧化锄种植体整个螺纹表面形成了均匀、周期性的平行凹槽结构，内部均匀分布纳米孔。透射电子显微镜（TEM）显示合成的CeO₂纳米颗粒为直径约11.55±1.79纳米的均匀球形，外围有PDA层修饰。X射线光电子能谱（XPS）和X射线衍射（XRD）分析证实了CeO₂纳米颗粒成功负载在氧化锄表面，并存在Ce³⁺和Ce⁴⁺价态。释药曲线显示，Trbs-CeO₂组表现出先快速（前5天）后缓慢（5-21天）的释药行为。接触角测量和原子力显微镜（AFM）分析表明，Trbs-CeO₂组具有最低的水接触角（12.4±1.11°），即最高的亲水性，且表面粗糙度（Sa和Sq值）最高。飞秒激光处理未对氧化锄的压缩强度产生显著负面影响。结论：成功制备了具有时间顺序释放特性的双层“三明治”结构，该结构显著增强了氧化锄表面的粗糙度和亲水性。

3.2. Trbs-CeO₂的抗菌作用：通过细菌粘附实验、存活率检测、死/活菌染色、SEM和TEM观察，评估了Trbs-CeO₂对MRSA和大肠杆菌的抗菌性能。结果显示，CeO₂和Trbs-CeO₂组表面粘附的细菌数量显著减少，细菌存活率降低。SEM和TEM观察发现，CeO₂和Trbs-CeO₂组中的细菌细胞膜破裂、内容物渗出。激光处理组（La）的表面能降低大肠杆菌的存活率，但对MRSA影响不显著。死/活菌染色显示Trbs-CeO₂组有大量死菌。结论：Trbs-CeO₂能够抑制细菌粘附和生长，并通过破坏细菌细胞膜发挥抗菌作用。

3.3. Trbs-CeO₂通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥抗炎活性：通过SEM、免疫荧光、ROS清除实验、酶联免疫吸附试验、蛋白质印迹、逆转录定量聚合酶链反应、流式细胞术和生物信息学分析，研究了Trbs-CeO₂对RAW264.7巨噬细胞极化和炎症的影响。结果显示，与对照组相比，Trbs-CeO₂组巨噬细胞形态更偏向长梭形（M2表型特征）。免疫荧光、蛋白质印迹和RT-qPCR证实Trbs-CeO₂组iNOS（M1标志物）表达降低，而Arg-1（M2标志物）表达升高。ELISA检测显示，Trbs-CeO₂组细胞上清液中促炎因子IL-6和IL-1β分泌水平显著降低，而抗炎因子IL-10水平升高。ROS清除能力增强。生物信息学分析、RT-qPCR和蛋白质印迹进一步证实，Trbs-CeO₂下调了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路关键分子的表达。流式细胞术显示Trbs-CeO₂降低了细胞膜表面TLR4的水平。在LPS刺激的时间依赖性实验中，Trbs-CeO₂能有效抑制NF-κB信号通路的激活。结论：Trbs-CeO₂通过靶向抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，促进巨噬细胞向M2抗炎修复表型极化，并发挥抗炎作用。

3.4. Trbs-CeO₂具有良好的生物相容性：通过细胞早期粘附实验、细胞骨架染色、SEM观察和CCK-8细胞毒性实验评估了MC3T3-E1细胞在Trbs-CeO₂表面的反应。结果显示，Trbs-CeO₂组在相同时间点粘附的细胞数量最多，促进了MC3T3-E1细胞的早期粘附。细胞在CeO₂和Trbs-CeO₂组表面展现出更广阔的细胞骨架和更多的丝状伪足。CCK-8实验表明各组间细胞活力无显著差异，证明Trbs-CeO₂对MC3T3-E1细胞无细胞毒性。结论：Trbs-CeO₂具有良好的生物相容性，有利于成骨细胞的早期粘附。

3.5. Trbs-CeO₂促进成骨分化：通过碱性磷酸酶（ALP）染色与活性定量、茜素红染色、间接与直接共培养模型以及RT-qPCR，评估了Trbs-CeO₂对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。结果显示，Trbs-CeO₂组的ALP活性和矿化结节形成均显著高于其他组。在炎症微环境（LPS条件培养基）下，Trbs-CeO₂涂层能减轻炎症对ALP活性的抑制作用，并调节共培养上清中细胞因子水平（降低IL-1β、IL-6，升高IL-10）。RT-qPCR显示，Trbs-CeO₂组在培养第7天和第14天时，ALP、Osterix、RUNX2和COL1A1的mRNA表达水平上调。结论：Trbs-CeO₂能显著增强MC3T3-E1细胞的早期成骨分化，并在炎症微环境中同时发挥抗炎和促成骨的双重作用。

3.6. Trbs-CeO₂在兔股骨缺损模型中促进种植体骨整合：将负载Trbs-CeO₂的氧化锄种植体植入兔股骨，在植入后4周和12周取材，通过显微CT三维重建、骨形态计量学分析（骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离度）以及硬组织切片VG染色、HE染色、Masson染色进行组织学评估。结果显示，Trbs-CeO₂组种植体周围300微米区域内的骨组织量最多，骨体积分数和骨小梁数量最高，骨小梁分离度最低。组织学切片显示，Trbs-CeO₂组有更丰富、更致密的新生骨小梁，种植体-骨组织界面更紧密，新骨覆盖面积更大，骨密度更高。在4周时，P组和La组观察到明显的炎性细胞浸润，而CeO₂和Trbs-CeO₂组则很少。结论：Trbs-CeO₂在体内能有效促进种植体骨整合，并表现出抗炎特性，减轻植入后的异物反应。

讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究首次结合高重复频率飞秒激光物理改性和CeO₂纳米颗粒化学改性，在非规则螺纹状氧化锄种植体表面制备了Trbs-CeO₂。其协同效应主要体现在两方面：一是结构协同，微纳形貌为纳米颗粒和PDA提供了增大的接触面积和机械互锁位点，促进了涂层的粘附并实现了CeO₂纳米颗粒的时序释放；二是功能协同，双层“三明治”设计实现了CeO₂纳米颗粒的时序释放：早期通过PDA降解释放高浓度CeO₂发挥抗炎抗菌作用，中后期则由嵌入种植体表面的CeO₂和飞秒激光构建的微纳结构共同促成骨。与纳秒激光相比，飞秒激光通过其汽化-烧蚀机制实现了更高的加工精度和更少的热损伤。本研究构建的微米凹槽和纳米孔结构未显著损害材料的抗压强度。微纳形貌、PDA和CeO₂纳米颗粒的引入显著增强了氧化锄表面的粗糙度和亲水性，这有助于早期细胞粘附和蛋白质吸附。尽管高粗糙度表面通常促进细菌粘附，但本研究观察到棒状大肠杆菌在弯曲凹槽结构上粘附减少，体现了细菌类型与形貌尺度的协同作用。CeO₂纳米颗粒可粘附于细菌细胞膜，干扰物质交换，发挥抗菌作用。巨噬细胞是骨免疫调节的关键调节者。研究发现Trbs-CeO₂通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路（驱动巨噬细胞M1极化的核心上游促炎信号轴），下调促炎细胞因子，上调抗炎因子，降低细胞内ROS水平，从而改善炎症微环境，促进巨噬细胞向M2表型极化。在LPS刺激下，Trbs-CeO₂加速了TLR4的内吞，并显著减弱了NF-κB通路的激活。间接和直接共培养模型表明，Trbs-CeO₂涂层能够逆转炎症微环境对ALP活性的抑制，体现了其抗炎和促成骨的双重功能。研究也指出了局限性，例如兔股骨模型无法充分模拟口腔感染或炎症的病理条件，未来需开发更具临床相关性的动物模型，并通过免疫共沉淀、报告基因细胞系、功能获得与缺失实验等手段进一步验证分子机制。

结论部分翻译：

本研究通过协同结合高重复频率飞秒激光物理改性与CeO₂纳米颗粒化学改性，开发了一种具有促进骨整合、抗炎和抗菌活性的新型氧化锄种植体表面（Trbs-CeO₂）。飞秒激光在氧化锄表面形成的微米凹槽和纳米孔结构不仅能促进成骨细胞的早期粘附和成骨分化，还能与CeO₂纳米颗粒形成机械互锁结构，从而提高涂层的稳定性。CeO₂纳米颗粒/PDA/CeO₂纳米颗粒的“双层三明治”设计实现了CeO₂纳米颗粒的时序释放，使其能够通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥抗炎作用，并通过破坏细胞膜发挥抗菌作用。通常，“物理+化学”处理产生了促进多维度成骨的双重协同效应。Trbs-CeO₂为氧化锄种植体的表面改性提供了一种新颖有效的策略，并在由炎症和感染引起的成骨不良中展现出潜在应用前景。